汪 杰，張偉蒙，胡 晶

（北京工商大學化學與材料工程學院，北京 100048）

0 前言

PLA材料由于生物降解性能良好，且抗壓強度（2～39 MPa）與天然骨（2～12 MPa）相似［1］，是骨支架制備中的一種常用選擇［2］。PLA雖然具有優(yōu)良的力學性能，但在骨組織工程支架應用過程中也存在著諸如韌性、親水性、生物相容性差等缺點影響了骨支架的性能，這也成為目前PLA骨支架的研究熱點問題。MONDAL等［3］采用3D打印技術制備了PLA支架，并對支架表面進行羥基磷灰石（HA）修飾，細胞相容性及力學性能測試結果表明，納米HA修飾后的PLA支架具有優(yōu)異的細胞黏附性能。Bouyer等［4］采用FDM技術制備PLA支架，該支架涂有一層提供成骨生物活性分子（BMP?2）的聚電解質膜，通過比較計算機斷層掃描、微計算機斷層掃描與自體骨移植的結果，骨在支架內均勻形成，骨修復效果與自體骨相同。Kao等［5］制備了聚多巴胺（PDA）涂層的PLA 3D支架，來調節(jié)人脂肪源性干細胞（hADSCs）的細胞黏附、增殖和分化，與未修飾的PLA支架相比，經PDA涂層的PLA支架上hADSCs能夠更好地黏附和生長，細胞分泌的I型膠原蛋白增加。Wang等［6］采用3D打印技術和順序浸漬法制備了PDA?PLA包覆硅酸鈣（PDA?PLA?CS）支架。所制備的PDA?PLA?CS支架具有良好的親水性。與無涂層支架相比，PDA?PLA?CS支架的力學性能顯著提高。此外，PDA? PLA? CS支架表面的PDA的存在對細胞的擴散起到了積極的作用，但涂覆支架的界面相容性仍需要改善。

PLGA具有良好的生物相容性和可調節(jié)的生物降解性，且已獲美國食品和藥物管理局 （FDA） 批準用于臨床應用［7］。PLGA的3D支架能夠為肌腱細胞及細胞基質提供良好的生長空間，促進肌腱細胞的生長或再生，減少肌腱黏連，促進肌腱愈合［8］。PLGA在力學性能上的單軸拉伸性能、壓縮性能、三點彎曲性能測試等方面上比PLA更能體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢［9］。

本研究采用3D打印技術制備PLA支架，使用浸涂法在支架表面修飾了PLGA涂層。研究了包覆溶液濃度對PLA/PLGA復合支架的斷面微觀形貌、力學性能、親水性和表面細胞活性性能等方面的影響。

1 實驗部分

1.1 主要原料

PLA線材，直徑為1.75 mm，深圳光華偉業(yè)股份有限公司；

PLGA，摩爾比為1∶9，中科院長春應用化學研究所；

六氟異丙醇，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

胰酶，143188，蘭杰柯科技有限公司；

磷酸鹽緩沖液（PBS），WH0112201911XP，武漢普諾賽生命科技有限公司 ；

αMEM培養(yǎng)基，C12571500BT，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；

胎牛血清，04?007?1A，廣州一科生物科技有限公司；

小鼠胚胎成骨細胞前體細胞，MC3T3?E1，賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；

活細胞染色試劑盒，BB?4126，上海貝博生物科技有限公司。

1.2 主要設備及儀器

3D打印機，RAISE3D N2，上海復志信息技術有限公司；

萬能試驗機，XJF?5，承德市金建檢測儀器有限公司；

磁力攪拌器，ZNCL?TS500，上海興創(chuàng)儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡（SEM），Quanta FEG 250，上海鑄金分析儀器有限公司；

視頻光學接觸角測量儀，OCA35，北京奧德利諾儀器有限公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱，WIGGENSWCI?180，北京桑翌實驗儀器研究所；

超凈工作臺，SW?CJ?2FD，上海篤特科學儀器有限公司；

離心機，TD5，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；酶標儀，SPARK 10M，帝肯貿易有限公司；激光共聚焦顯微鏡，F(xiàn)V1200，奧林巴斯有限公司；細胞計數(shù)試劑盒?8（CCK?8），IV08?100，上海創(chuàng)凌生物科技有限公司。

1.3 樣品制備

使用Solid Works（3D）繪制3D支架模型，采用Idea Maker軟件對3D模型進行切片，打印速度為50 mm/s，噴頭溫度為 215 ℃，熱床溫度為 60 ℃，支架填充率為100 %，支架體積為12 mm×12 mm×8 mm。稱取不同質量的PLGA放入六氟異丙醇（CH3COOC2H5）溶劑中，用磁力攪拌器在30 r/min轉速下、50 ℃下攪拌120 min，待PLGA完全溶解，制備質量分數(shù)分別為2 %、4 %、6 %、8 %的PLGA溶液。PLGA溶液在PLA支架上均勻地淋灑2次，將支架放入真空干燥箱中，50 ℃下干燥48h得到不同濃度PLGA包覆的支架。

1.4 性能測試與結構表征

壓縮性能測試：按照GB/T 1041—2008進行測試，加載速度為 1 mm/min，定量壓縮4 mm，每種濃度包覆支架選取 5個樣品，樣品壓縮方向為3D打印模型的Z軸方向；

SEM測試：各支架通過液氮脆斷獲得橫截面，將樣品的斷面置于15 kV的工作電壓下進行噴金處理，測試脆斷斷面的表面形貌，加速電壓為10 kV，放大倍率為50倍和1 000倍；

表面水接觸角測試：采用表面接觸測定儀測量樣品的靜態(tài)水接觸角，將檢測支架樣本放在試樣臺上，將1 μL蒸餾水滴落在待測支架樣本上，每個樣本選取5個測試點位，測3個樣品，取平均值作為測定結果；

2 結果與討論

2.1 表面形貌分析

組織工程支架的孔結構對細胞的黏附、遷移和增殖有重要的影響，尤其孔徑大小和分布在很大程度上決定了細胞在支架材料中遷移和生長的活性［10］。圖1（a）、（c）、（e）、（g）分別為質量分數(shù)為2 %、4 %、6 %、8 %PGLA溶液包覆后支架的斷面形貌，圖1（b）、（d）、（f）、（h）是相應的局部放大1 000倍的形貌?？梢郧逦赜^察到支架內部通孔在包覆后連通性良好，支架孔徑可在1 200 μm左右，由于宿主細胞從骨髓遷移和鄰近成骨細胞遷移，需要一個相互連接的通道結構以允許組織在其上生長［11］。較大的孔徑支架具有良好的血管化，涂覆均勻且不會阻塞孔隙［12］。這為細胞在支架材料中遷移、生長以及動物體內和體外實驗的可行性提供保障。包覆溶液質量分數(shù)為2 %的PLA支架如圖1（a）所示，支架已經被包覆，因為溶液濃度低、黏度較低，包覆溶液在支架表面明顯分層，黏附力較差；包覆溶液質量分數(shù)為4 %的PLA支架如圖1（c）所示，有局部分層；包覆溶液質量分數(shù)為6 %的PLA支架，如圖1（e）所示，可觀察到支架和涂層黏結較緊，未見明顯邊界；包覆溶液質量分數(shù)為8 %的PLA支架，如圖1（g）所示，沒有分層。圖1（b）和（d）中涂層與支架表面存在明顯的間距；圖1（f）中隨著溶液濃度的升高，黏度變大，包覆溶液與支架表面無開裂現(xiàn)象，縫隙間距減??；圖1（h）中因黏度適中包覆溶液與支架表面未有明顯兩相，PLA與PLGA相容性較好，其相界面結合緊密，支架的整體性最佳。

圖1 PLGA溶液包覆PLA支架的SEM照片F(xiàn)ig.1 Surface section morphology of PLA scaffold coated with PLGA solution

圖2 （a）、（c）、（e）、（g）分別為質量分數(shù)為2 %、4 %、6 %、8 %PGLA溶液包覆后支架壓縮后的斷面形貌，圖2（b）、（d）、（f）、（h）是其相應放大的1 000倍的局部圖。包覆溶液質量分數(shù)為2 %、4 %的PLA支架壓縮后，如圖2（b）、（d）所示，涂層與支架有明顯的剝離現(xiàn)象，在應力集中的地方出現(xiàn)了一些細小的裂紋；包覆溶液質量分數(shù)為6 %、8 %的PLA支架壓縮后，如圖2（e）所示，涂層與支架表面未發(fā)生剝離現(xiàn)象，包覆溶液質量分數(shù)為8 %的PLA支架壓縮后，如圖2（g）所示，由于支架力學性能的降低，支架產生較大裂紋。綜上所述，包覆溶液質量分數(shù)為6 %的PLA支架，包覆效果最好。

2.2 力學性能分析

相界面結合在復合材料中具有相當重要的意義，其對材料性能有直接的影響，若界面結合不好，復合材料很容易形成局部松弛而導致應力集中和材料的強度性能降低［13］。實驗制備了PLGA質量分數(shù)分別為0、2 %、4 %、6 %、8 %的PLA/PLGA復合支架進行壓縮試驗，壓縮強度測試結果如圖3所示，包覆了質量分數(shù)為2 %的PLGA的PLA支架與未包覆PLGA的PLA支架相比，支架的壓縮強度從29.2 MPa下降至22.9 MPa。當包覆溶液濃度為4 %時，溶液黏度提高，支架表面PLGA涂層包覆更加均勻，試樣壓縮強度較2 %溶液包覆略有上升；當包覆溶液濃度增加至6 %和8 %時，溶液黏稠，表面包覆均勻，但溶劑揮發(fā)更加困難，8 %溶液壓縮強度最低為21.6 MPa，但仍高于人體松質骨最高承載要求12 MPa。PLA支架包覆不同濃度的PLGA溶液后其壓縮強度都有所下降，這是由于在制備支架過程中無法完全除去有機溶劑［14］，造成PLGA涂層力學性能下降，且PLGA和PLA的界面表現(xiàn)出大尺寸的宏觀分離，界面黏結松散，導致PLA/PLGA復合支架壓縮強度有所降低。

圖3 不同濃度PLGA溶液包覆PLA支架的壓縮強度Fig.3 Compression strength of the PLA scaffold coated with different concentrations of PLGA solution

2.3 表面親水性分析

親水性是反應物質表面性質的重要性能，研究固體材料親疏水性時，接觸角測試法是一種常見的表征方法［15］。

支架表面的親水性是影響材料與細胞支架最初相互作用行為的關鍵因素之一，研究表面支架表面的親水性是細胞依附和蛋白質通過的重要屬性［16］。接觸角廣泛用于評估支架的表面親水性，對PLGA質量分數(shù)為0、2 %、4 %、6 %、8 %5組支架分別進行接觸角測試，結果如圖4所示。由圖可知，PLGA質量分數(shù)為2 %、4 %、6 %、8 %的復合支架接觸角均低于70 °，相對于PLA支架接觸角降低。隨著包覆溶液濃度的升高，接觸角有下降的趨勢，其中，包覆質量分數(shù)為6 %PLGA的支架接觸角為（64.7±1.1） °，包覆溶液濃度為8 %時，由于溶液較黏稠影響了表面包覆質量，接觸角有所升高。PLA由單體乳酸聚合而成，其分子骨架中富含疏水性的酯鍵，缺乏親水性基團，因而PLA的疏水性較強［17］。說明表面包覆處理提高了支架材料表面的親水性能。原因之一可能是包覆處理對支架表面形貌的改變；從圖1中發(fā)現(xiàn)，表面包覆后的支架表面變得粗糙不平，引起的比表面積增大，表面能增大，表面吸附能力增大，從而表現(xiàn)出對水分子更強的吸附能力［18］。其次，表面包覆賦予了表面有更多的親水性官能團—OH的改善。因此復合材料的親水性得到提高，材料具有更好的親水性，有利于細胞的黏附。

圖4 不同濃度PLGA溶液包覆PLA支架的水接觸角Fig.4 Water contact angles of the PLA scaffold coated with different concentrations of PLGA solution

2.4 支架表面的細胞活性及黏附

圖5 支架表面的細胞活性及細胞Live染色Fig.5 Cell activity and adhesion on the scaffold surface

3 結論

（1）相比未包覆的PLA支架，PLGA涂層質量分數(shù)為 6 %的支架接觸角由（81.1±0.4） °降至（64.7±1.1） °，親水性有明顯提升，有利于成骨細胞的增殖、依附和蛋白質的交換；

（2）包覆不同濃度PLGA的支架整體壓縮強度減小，但壓縮強度均大于人體松質骨最高承載要求12 MPa；

（3）PLA/PLGA復合支架表面涂層促進了支架表面的細胞增殖，且6 %濃度的PLGA涂層細胞活性最高。