劉二龍盧麗付海濱張敏金鑫鑫王興寧

(1.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510730；2.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；3.沈陽海關(guān)技術(shù)中心，遼寧 沈陽 110016；4.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866；5.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

引言

匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera L.)又叫莖翦股穎、本特草，為冷地型草坪草，是禾本科翦股穎屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐亞大陸，20世紀(jì)80年代曾引種部分美國俄勒崗州品種進(jìn)入我國[1,2]。近年來由于各種運(yùn)動場地、城市綠化的建設(shè)，使草坪草的需求量大增。為獲得耐磨、生長快、易于整修和移植的草，相應(yīng)出現(xiàn)了多種應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)的草坪草品種[3]。

ASR368匍匐翦股穎是孟山都公司和斯格茲公司共同研發(fā)的一種耐受草銨膦除草劑的轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎品系。ASR368采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)PV-ASGT08質(zhì)粒轉(zhuǎn)入匍匐翦股穎后培育而成，其T-DNA中含有2個拷貝的cp4-epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp.strain CP4，來自農(nóng)桿菌CP4的5莽草酸-3磷酸合成酶基因)，使其具有草甘膦除草劑耐受性，ASR368于2003年在美國批準(zhǔn)上市[4]，目前尚未獲得我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)。

隨著各種轉(zhuǎn)基因草品種的應(yīng)用，其在生態(tài)環(huán)境上的安全性成為公眾關(guān)注的問題之一，口岸相關(guān)監(jiān)管部門也亟需相應(yīng)的檢測方法識別相應(yīng)的未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因品系。目前國內(nèi)未見有ASR368品系特異性實(shí)時熒光PCR鑒別方法的報道，為完善我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系識別檢測技術(shù)體系，本研究基于轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎ASR368品系轉(zhuǎn)入的基因盒鄰接區(qū)序列，建立ASR368品系特異性實(shí)時熒光PCR檢測方法，適用于其種子及植株的鑒別檢測，可為相關(guān)部門監(jiān)管轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎ASR368品系提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

非轉(zhuǎn)基因剪股穎、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結(jié)縷草、早熟禾、轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、小麥、非轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH92-527-1，為本實(shí)驗(yàn)室購置或保存；匍匐剪股穎內(nèi)源基因1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase(ACO)gene，ACO基因)(GenBank:KU921687.1)和轉(zhuǎn)基因ASR368品系特異性片段質(zhì)粒，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒，北京天根公司；Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大連寶生物；引物和探針，閃晶生物公司(終濃度稀釋為10μm的引物和探針工作液)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

控制型研磨機(jī)，德國IKA；微量分光光度計(jì)nanodrop2000c，美國Thermo公司；實(shí)時熒光定量PCR儀ABI7500FAST，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；微滴式數(shù)字PCR，系統(tǒng)QX 200，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組DNA的提取與純化

稱取研磨好的樣品80mg，使用基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，測定提取基因組DNA的濃度，DNA溶液放置于5℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時熒光PCR檢測方法的建立

1.2.2.1 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫所述轉(zhuǎn)基因ASR368品系轉(zhuǎn)入的基因盒3’端與匍匐剪股穎基因組鄰接區(qū)序列，采用Primer Express設(shè)計(jì)引物和探針。通過與BLAST數(shù)據(jù)庫相比對，確定引物和探針的理論特異性；引物和探針的信息，如表1所示。

1.2.2.2 實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系建立

采用不同體積的引物探針進(jìn)行優(yōu)化。最后采取的擴(kuò)增反應(yīng)體系：25μL，包括Premix Ex TaqTM12.5μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、10μmol·L-1檢測引物ASR368-F和ASR368-R各0.5μL、10μmol·L-1ASR368-P 1μL、模板2μL和ddH2O 8.3μL。

反應(yīng)程序：95℃ 30s后，于95℃ 5s、60℃ 34s進(jìn)行40個循環(huán)，于60℃收集熒光信號。

1.2.3 特異性測試

提取非轉(zhuǎn)基因剪股穎、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結(jié)縷草、早熟禾、轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、小麥、非轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH92-527-1的基因組DNA為模板，陽性對照為ASR368-ACO質(zhì)粒，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因水稻DNA，對該檢測方法的特異性進(jìn)行鑒定。

1.2.4 靈敏度測試和建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將提取的ASR368-ACO質(zhì)粒DNA稀釋后用微滴數(shù)字PCR進(jìn)行定量，然后用TE緩沖液分別稀釋至4000000拷貝·μL-1、200000拷貝·μL-1、10000拷貝·μL-1、500拷貝·μL-1、100拷貝·μL-1、20拷貝·μL-1和10拷貝·μL-1，進(jìn)行線性范圍測試、可重復(fù)性測試和靈敏度檢測。3個平行/濃度。

1.2.5 可重復(fù)性測試

對1.2.4中倍比稀釋的DNA溶液，測定本實(shí)驗(yàn)建立方法的可重復(fù)性，并統(tǒng)計(jì)分析其標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時熒光PCR檢測方法的建立

引物和探針設(shè)計(jì)：通過分析轉(zhuǎn)基因匍匐剪股穎ASR368品系鄰接區(qū)序列，見圖1，然后根據(jù)引物與探針的擴(kuò)增效果，最終篩選ASR368-F、ASR368-R和ASR368-P建立本檢測方法，序列見表1。

注：陰影部分依次為ASR368-F、ASR368-P、ASR368-R。

表1 實(shí)時熒光PCR的引物、探針

2.2 特異性測試

采用1.1中農(nóng)作物基因組DNA進(jìn)行ASR368品系特異性方法的測試，如圖2所示。由圖2可知，采用ASR368特異性引物ASR368-F/R和探針ASR368-P進(jìn)行測試時，只有陽性樣品ASR368-ACO呈現(xiàn)典型熒光擴(kuò)增曲線的特征，表明本文的檢測方法具備良好特異性。

注：1為ASR368-ACO陽性樣品；2～17分別為非轉(zhuǎn)基因剪股穎、轉(zhuǎn)基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麥、高羊芽、天堂草、結(jié)縷草、早熟禾、轉(zhuǎn)基因大豆DAS44406、轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、轉(zhuǎn)基因油菜MON88302、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、小麥、非轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH92-527-1和空白對照。

2.3 靈敏度測試

將提取的ASR368-ACO質(zhì)粒DNA溶液分別稀釋至4000000拷貝·μL-1、200000拷貝·μL-1、10000拷貝·μL-1、500拷貝·μL-1、100拷貝·μL-1、20拷貝·μL-1和10拷貝·μL-1進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。7個濃度梯度均能有典型擴(kuò)增曲線，其最低檢測濃度為10拷貝·μL-1。擴(kuò)增圖從左至右分別為4000000～10拷貝·μL-1擴(kuò)增曲線。

圖3 轉(zhuǎn)基因棉花ASR368品系實(shí)時熒光PCR方法靈敏度測試

2.4 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用2.3中7個濃度梯度DNA作為模板，進(jìn)行ASR368品系實(shí)時熒光PCR檢測，建立ASR368品系特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線，以實(shí)現(xiàn)對ASR368品系的相對定量分析。測試結(jié)果的Ct值如表2所示，根據(jù)表2中Ct值數(shù)據(jù)與在20～800000拷貝(25μL體系中上樣量為2μL)范圍內(nèi)7個濃度的對數(shù)值與所得Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示，線性回歸方程為：y=-3.6096x+40.385，R2=0.987，表明本實(shí)驗(yàn)的ASR368品系特異性實(shí)時熒光PCR檢測方法在模板量該拷貝范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，擴(kuò)增效率較高；RSD介于0.78%～2.90%，表明該方法重復(fù)性良好。在線性范圍內(nèi)最低模板量20拷貝時，其SD和RSD均小于25%，說明本方法定量檢測下限達(dá)20拷貝。

表2 實(shí)時熒光PCR方法的靈敏度及可重復(fù)性測試

圖4 ASR368品系特異性序列擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

目前國內(nèi)外有多個研究者通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良匍匐翦股穎性狀[3]。王渭霞等[5]將外源基因?qū)胭橘媵骞煞f品種中獲得具耐旱性狀的新品系。胡繁榮[6]將經(jīng)過改良的抗蟲基因crylAb導(dǎo)入匍匐翦股穎種子胚愈傷組織，得到抗蟲的轉(zhuǎn)基因植株。Fu等[7]將大麥haval基因?qū)胭橘媵骞煞f，研發(fā)了耐干旱環(huán)境的植株。由于匍匐翦股穎是多年生植物草本植物，可通過形成濃密根系，或通過花粉和種子的有性繁殖進(jìn)行傳播。其種子生存力強(qiáng)，能夠借助風(fēng)力等從進(jìn)行傳播。轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎轉(zhuǎn)入相應(yīng)的性狀基因如耐除草劑、抗旱等，可能導(dǎo)致其難以在種植地區(qū)被根除；此外，轉(zhuǎn)基因匍匐翦股穎草可能存在通過雜交把相應(yīng)基因傳遞給其他草類的生態(tài)風(fēng)險。

為有效應(yīng)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品生態(tài)等相關(guān)風(fēng)險，建立準(zhǔn)確的檢測方法對相關(guān)品系進(jìn)行有效鑒別是非常必要的。目前轉(zhuǎn)基因鑒別方法基本上以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法為主[8]，如轉(zhuǎn)基因大米(Bt)[9]、轉(zhuǎn)基因玉米[10]、轉(zhuǎn)基因大豆[11,12]、轉(zhuǎn)基因甜菜[13]、轉(zhuǎn)基因棉花等[14]。為滿足進(jìn)出境農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管的需求，針對轉(zhuǎn)基因匍匐剪股穎ASR368品系轉(zhuǎn)入的基因盒3’端鄰接區(qū)建立ASR368品系特異性實(shí)時熒光PCR檢測方法，具有良好的特異性、高靈敏度和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于口岸監(jiān)管中轉(zhuǎn)基因匍匐剪股穎ASR368種子及植株的鑒別。