周濤，王笑天，劉東，孔斌，趙士彭

2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指出，胃癌發(fā)生率位于所有癌癥中第五位，病死率排在第四位[1]，對人類健康影響巨大，嚴(yán)重威脅患者生命健康。雖然目前胃癌的治療方法較多，但是總體生存率仍較低，有必要探索發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，不僅有助于對患者預(yù)后進(jìn)行評估，而且可能提供更多的分子治療靶點(diǎn)。SERPINE1是SERPIN家族E成員1，又稱PAI、PLANH1、PAI1,其位置在7號染色體(7q22.1)，被認(rèn)為在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等癌癥中對腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后有影響[2-6]。本研究通過癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas ,TCGA)及基因綜合表達(dá)(the gene expression omnibus,GEO)公共數(shù)據(jù)庫，挖掘并分析SERPINE1對胃癌預(yù)后的影響，探討其作為預(yù)測胃癌預(yù)后的一種生物學(xué)標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)的可能，為以后研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索及下載 檢索TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，了解SERPINE1在33種癌癥中的差異表達(dá)情況。檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)并下載胃癌患者的STAR-Counts數(shù)據(jù)、臨床資料，獲得375例胃癌組織和32例癌旁組織的STAR-Counts數(shù)據(jù)。通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)檢索GSE54129數(shù)據(jù)集，下載111例胃癌組織和21例癌旁組織基因表達(dá)芯片和臨床資料，調(diào)取以上111例胃癌組織SERPINE1 mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)，以中位數(shù)為截?cái)嘀祵⑵浞譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組。

1.2 表達(dá)差異分析 將TCGA下載的375例胃癌組織和32例癌旁組織的SERPINE1 mRNA表達(dá)進(jìn)行差異分析，將GSE54129數(shù)據(jù)集中21例癌旁正常組織和111例胃癌組織的SERPINE1 mRNA表達(dá)進(jìn)行差異分析。

1.3 單/多因素COX分析及預(yù)后分析 收集TCGA數(shù)據(jù)集中375例胃癌患者臨床資料和SERPINE1 mRNA表達(dá)水平，刪去缺失預(yù)后資料樣本后剩余333例，然后刪去缺失性別、年齡、T分期、N分期、M分期、病理分期等資料的樣本，剩余300例患者資料，然后進(jìn)行單因素分析，單因素分析后P<0.05的因素可進(jìn)入多因素COX回歸分析。

1.4 Kaplan-Meier生存曲線、ROC曲線和生存列線圖繪制 收集TCGA數(shù)據(jù)集中具有完整預(yù)后資料患者共333例，并收集SERPINE1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以其中位數(shù)為截?cái)嘀?，分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線、受試者工作特征曲線(ROC)、生存列線圖的繪制。

1.5 基因富集分析(GSEA富集) 采用軟件GSEA_4.2.3進(jìn)行分析，TCGA數(shù)據(jù)集以SERPINE1 mRNA的表達(dá)量中位數(shù)為截?cái)嘀祵⑵浞譃楦摺⒌捅磉_(dá)組，以 Hall-mark 基因集作為參考基因集，分析SERPINE1在胃癌中的作用機(jī)制。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 R 3.6.3 版本對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，涉及的R包包括ggplot2包、survival包、survminer 包、timeROC包、rms包。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 泛癌分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫檢測SERPINE1在33種癌組織中的表達(dá)差異情況，發(fā)現(xiàn)SERPINE1在乳腺浸潤癌(BRCA)、結(jié)腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)等8種癌組織中高表達(dá)，在膽管癌(CHOL)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等6種癌組織中低表達(dá)，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 胃癌組織和癌旁組織中SERPINE1 mRNA的表達(dá)差異 TCGA數(shù)據(jù)集、GSE54129數(shù)據(jù)集中胃癌組織中SERPINE1 mRNA表達(dá)高于癌旁組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 SERPINE1 mRNA在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較

2.3 影響胃癌患者預(yù)后的單/多因素COX回歸分析 將TCGA數(shù)據(jù)集中胃癌患者臨床資料進(jìn)行單因素COX分析表明，N分期、病理分期、SERPINE1表達(dá)水平均與預(yù)后生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)；多因素COX回歸分析表明，病理分期4期、SERPINE1表達(dá)水平高是影響胃癌患者預(yù)后生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫影響胃癌患者預(yù)后生存的單/多因素COX分析

2.4 Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線分析 收集TCGA胃癌患者生存信息和SERPINE1 mRNA表達(dá)水平，Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組總生存期(OS)明顯低于低表達(dá)組(HR=1.86，95%CI1.32～2.62，P<0.001)，見圖2。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，SERPINE1表達(dá)預(yù)測1、3、5年生存幾率的曲線下面積(AUC)分別為0.598、0.649、0.731，預(yù)測5年生存幾率效能最好，見圖3。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線

圖3 SERPINE1表達(dá)預(yù)測1、3、5年生存幾率的ROC曲線

2.5 生存預(yù)測列線圖構(gòu)建 通過各臨床指標(biāo)(性別、年齡、T分期、N分期、M分期，病理分期，SERPINE1 mRNA)構(gòu)建列線圖，其得分可直觀地預(yù)測1年、2年、3年生存幾率，見圖4。

圖4 生存預(yù)測列線圖

2.6 GSEA富集分析 GSEA分析表明，SERPINE1 mRNA高表達(dá)組與SERPINE1 mRNA相關(guān)的基因富集在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎性反應(yīng)、細(xì)胞頂端連接復(fù)合物、KRAS通路、血管生成等基因集上，被富集到的通路在SERPINE1 mRNA高表達(dá)組表現(xiàn)為上調(diào)趨勢，可能SERPINE1的表達(dá)與以上通路及功能存在密切關(guān)系,見表2。

表2 GSEA富集分析與SERPINE1相關(guān)的通路

3 討 論

在所有已知癌癥中，胃癌的發(fā)生率及病死率仍名列前茅，雖然目前治療胃癌的方法比較多，如手術(shù)、化療、放療、靶向、免疫治療等方法[7]，但是其對人類的生存威脅仍較大，為能夠造福胃癌患者并指導(dǎo)臨床治療，挖掘并研究參與胃癌發(fā)生及影響胃癌患者生存的生物學(xué)標(biāo)志物很有必要。有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)，尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)系統(tǒng)參與癌癥的血管生成、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、免疫等生物學(xué)行為及過程，SERPINE1是尿激酶纖溶酶原激活物系統(tǒng)中的重要成員[8-12]。有研究發(fā)現(xiàn)其影響頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤患者的預(yù)后，通過靶向uPA系統(tǒng)治療癌癥的方法已廣泛用于腫瘤治療的研究中[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，SERPINE1在荷瘤小鼠胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中顯著高表達(dá)，過表達(dá)SERPINE1后荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長明顯增快，敲低LINC00200后荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長減慢，LINC00200可正向調(diào)控SERPINE1影響胃癌細(xì)胞的生長及腫瘤的形成[14]。多項(xiàng)研究證實(shí)，SERPINE1的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展存在密切關(guān)系。

本研究基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，主要分析TCGA數(shù)據(jù)庫333例具有預(yù)后資料的胃癌患者臨床信息和STAR-Counts數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，SERPINE1在胃癌組織中高表達(dá)，單/多因素COX分析發(fā)現(xiàn)SERPINE1 mRNA的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后具有相關(guān)性，并且是一個(gè)影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，Kaplan-Meier生存曲線和ROC曲線分析表明SERPINE1預(yù)測胃癌患者生存時(shí)間的可行性，通過GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與癌癥相關(guān)的通路和生物學(xué)行為與SERPINE1高表達(dá)呈正相關(guān)，EMT生物學(xué)過程已經(jīng)被多項(xiàng)研究證實(shí)參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，炎性反應(yīng)同樣被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)，EMT和炎性因子之間相互誘導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[15]。KRAS突變與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系，SERPINE1水平可通過KRAS通路上調(diào)[16]。另外低氧環(huán)境、血管生成也與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，本研究通過富集分析發(fā)現(xiàn)，SERPINE1與影響腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的不良因素均有關(guān)。所以進(jìn)一步深入的通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究SERPINE1對腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的影響有重大意義。為以后從多個(gè)方面研究SERPINE1在胃癌進(jìn)展中的生物學(xué)作用及影響患者預(yù)后的機(jī)制方面提供了理論依據(jù)和思路。

目前臨床中用于輔助診斷胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物有CEA、CA199、CA125、AFP等，但仍較少，并且缺乏一定的特異度及敏感度，需要挖掘更多更準(zhǔn)確的生物學(xué)標(biāo)志物用于服務(wù)臨床。通過本研究發(fā)現(xiàn)并證實(shí)SERPINE1作為一種生物學(xué)標(biāo)志物用于胃癌輔助診斷及預(yù)測胃癌患者預(yù)后的可能性，并且可能成為一種新的治療靶點(diǎn)，為胃癌患者的治療提供了新的思路及方向。本研究患者例數(shù)仍較少，臨床中需要收集更多胃癌患者的臨床資料及免疫組化或基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行更深入更有說服力的研究，致力于發(fā)現(xiàn)更好的治療方法來延長胃癌患者的生存時(shí)間。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周濤：提出研究方向、研究選題、設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫;王笑天：設(shè)計(jì)研究方案，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;劉東：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文審核;孔斌：修改論文、論文審核;趙士彭：修訂論文、論文終審