張君 張虹 張芮 路國(guó)棟 雍婧姣 郎思睿 陳任

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021; 2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021; 3.寧夏大學(xué)寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021）

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是菊科甜葉菊屬或斯臺(tái)比亞屬多年生草本植物，其葉片富含多種甜菊醇糖苷（steviol glycosides,SGs）［1-2］，具有甜度高（甜度是蔗糖的200-300 倍）、熱量低（熱量約為蔗糖的1/300）、安全無(wú)毒等特點(diǎn)［3-4］。隨著各國(guó)對(duì)甜菊醇糖苷作為食品甜味劑安全性的肯定，以及食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的公布，甜葉菊逐漸成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)［5-6］

甜菊醇糖苷是一系列甜菊糖苷類的混合物，由甜菊醇單糖苷（steviolmonoside,SMono）、甜菊醇雙糖苷（steviolbioside,SBio）、甜菊苷（stevioside,ST）、萊包迪苷A-F（rebaudioside A-F,RA-RF）杜爾可苷A、B（dulcoside A,B,DA,DB）等20 多種不同的甜菊醇糖苷組成［7-10］。其中ST 約占60%-70%、RA約占15%-20%。ST 的甜度為蔗糖的250-300 倍，但具有一定的苦味，在一定程度上影響了甜菊醇糖苷的口味，進(jìn)而也影響了甜菊醇糖苷的商業(yè)利用價(jià)值。而RA 的甜度則是蔗糖的350-450 倍［11］，且甜味最接近蔗糖，是理想的甜味成分。RA 含量越高，甜味就越純正，也就會(huì)越受消費(fèi)者的青睞［4,12］。因此，在一定程度上，甜菊醇糖苷的口感和甜度取決于RA的含量，要想改善現(xiàn)有甜菊苷產(chǎn)品風(fēng)味，就必須想辦法提高甜菊苷產(chǎn)品中RA 的含量。

自從甜葉菊葉片中分離出甜菊醇糖苷［13］以來(lái)，人們一直關(guān)注甜菊醇糖苷的生物合成途徑。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)甜菊醇糖苷的生物合成途徑的上游（前期）與赤霉素生物合成途徑一致［14］。在類異戊二烯及其衍生物的生物合成途徑中（圖1），以雙牻牛兒基二磷酸（geranylgeranyl diphosphate）為原料，在柯巴基二磷酸合酶（copalylpyrophosphate synthase,CPS）的催化作用下生成內(nèi)根柯巴基二磷酸（ent-copalyl diphosphate），然后在貝殼杉烯合酶（kaurene synthase,KS）的作用下生成內(nèi)根貝殼杉烯（ent-kaurene），而貝殼杉烯氧化酶（kaurene oxidase,KO）又將其轉(zhuǎn)化成內(nèi)根-貝殼杉烯酸（ent-kaurenoic acid），這是甜菊醇糖苷生物合成途徑與赤霉素生物合成途徑的分界點(diǎn)，隨后，內(nèi)根-貝殼杉烯酸在內(nèi)根-貝殼杉烯酸羥化酶（kaurenoicacid hydroxylase,KAH）的作用下,發(fā)生C-13 位脫氫氧化形成甜菊醇（stevoil），它是甜菊醇糖苷合成的前體。甜菊醇在不同的UDP（uridine diphosphate）-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucosyltransferases,UGTs）的作用下,最終形成一系列不同甜度的甜菊醇糖苷［14-16］。其中，在甜菊醇苷元的C-19 位上連接一個(gè)葡萄糖基和C-13 位上連接數(shù)個(gè)葡萄糖基，最終生成RA 的途徑被稱之為RA 生物合成途徑［14-15］。而在甜菊醇苷元的C-13位上連接的葡萄糖基上再連接鼠李糖基，生成DA、DB/RC 的RC 生物合成途徑，以及在葡萄糖基上再連接木質(zhì)糖基，生成RF 的生物合成途徑，有很多步驟仍然不甚明了［17］。

圖1 甜菊醇糖苷的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of steviol glycosides

在RA 生物合成的十幾步酶促反應(yīng)中，最后5步酶促反應(yīng)，即KAH 和4 種不同的UGTs，包括UGT85C2、UGT91D2m、UGT74G1、UGT76G1 的催化是關(guān)鍵步驟［18-24］。編碼這些酶的基因被認(rèn)為是甜菊醇糖苷生物合成途徑的關(guān)鍵基因。

本研究通過(guò)克隆甜菊醇糖苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因UGT85C2、UGT91D2m和UGT76G1，構(gòu)建植物基因過(guò)量表達(dá)載體，以單獨(dú)或組合的形式將這些基因?qū)氲教鹑~菊中，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行各種甜菊醇糖苷成分的變化分析，以期明確這些基因在甜菊醇糖苷生物合成中的單獨(dú)作用和相互影響，為培育RA 含量高的高品質(zhì)甜葉菊新品系提供了理論依據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料甜葉菊品系‘中山2 號(hào)’、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 菌株、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、質(zhì)粒載體pKAFCR80、pKAFCR100 均由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的克隆 以甜葉菊葉片為材料，利用天根RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取總RNA，并使用天根TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

參照NCBI 等數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的甜葉菊SrUGT76G1（AY345974）、SrUGT85C2（AY345978）、SrUGT91-D2m（EU751291）基因的序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，同時(shí)加入相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)（Sr76G1-S,A; Sr85C2-S,A;Sr91D2m-S,A; 表1）。以上述合成的cDNA 為模板，使用美國(guó)NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR 試劑盒對(duì)上述基因的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用德國(guó)Qiagen QIAquick PCR Purification Kit 試劑盒提純。

1.2.2 過(guò)渡載體的構(gòu)建 利用Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit 試劑盒，從大腸桿菌DH5α 提取pKAFCR80 和pKAFCR100 的載體DNA，采用本實(shí)驗(yàn)室確定的方法構(gòu)建過(guò)渡載體、植物單個(gè)或多個(gè)基因過(guò)量表達(dá)載體［25］。

使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將經(jīng)PCR 擴(kuò)增、提純得到的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因全長(zhǎng)和pKAFCR80 過(guò)渡用載體進(jìn)行雙酶切處理并分別進(jìn)行連接反應(yīng)，使目的基因的前后連接CAMV 35S 啟動(dòng)子（cauliflower mosaic virus 35S promoter）和NOS 終止子（nopaline synthase terminator）（稱為基因組合），然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行PCR 鑒定并測(cè)序驗(yàn)證（引物CR80 MCS insert 35SS,A; 表1），構(gòu)建出3 種過(guò)渡載體。

1.2.3 單基因過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建 3 種過(guò)渡載體從大腸桿菌DH5α 中提取后，使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，將這3 個(gè)目的基因連同前后的35S 啟動(dòng)子和NOS 終止子基因組合分別連接到 pKAFCR100 相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌以及菌落PCR 鑒定后測(cè)序驗(yàn)證（引物CR100 Cla-S,CR80 MCS insert NOS-A;表1），構(gòu)建出3 種單基因過(guò)量表達(dá)載體（圖2）。

1.2.4 三基因過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建 同樣通過(guò)雙酶切將上述SrUGT91D2m基因組合、SrUGT85C2基因組合依次連接到SrUGT76G1單基因過(guò)量表達(dá)載體上，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化以及菌落PCR 鑒定后測(cè)序驗(yàn)證（引物Sr76G1-S,A; Sr85C2-S,A; Sr91D2m-S,A; 表1），最終形成1 種三基因過(guò)量表達(dá)載體（圖2）。

表1 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplification

圖2 單基因或三基因共表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic structure of co-expression vectors of single genes or three genes

1.2.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 將構(gòu)建好的3 種單基因過(guò)量表達(dá)載體以及1 種三基因過(guò)量表達(dá)載體，按照說(shuō)明書(shū)步驟轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)細(xì)胞。

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的甜葉菊無(wú)菌苗的葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化上述4 種基因過(guò)量表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化和培育過(guò)程按照實(shí)驗(yàn)室確定的方法進(jìn)行［26］。長(zhǎng)出愈傷組織后觀察sGFP 熒光的表達(dá)情況。

利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取4 種轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以野生型植株為陰性對(duì)照，PCR 鑒定導(dǎo)入的目的基因片段（引物Sr76G1-S,CR100 omega-A; CR100 Cla-S,Sr85C2-A; CR80 MCS insert NOS-S,Sr91D2m-A; 表1）。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)量的分析 PCR 鑒定的各種轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和野生型對(duì)照植株在溫室培養(yǎng)3 個(gè)月（未開(kāi)花）后，各選取10 株系，每株系頂部的3 對(duì)葉混合成1 個(gè)樣本。采用本實(shí)驗(yàn)室確定的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)并計(jì)算SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1基因的相對(duì)表達(dá)量［27］。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株甜菊醇糖苷含量的分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 同樣的樣本提取植株中各種甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷的提取和測(cè)定采用本實(shí)驗(yàn)室確定的方法［27-31］。

將甜菊醇糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（日本W(wǎng)ako）用乙腈-水（80∶20,V/V）溶液配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液系列。分別吸取15 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X 進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的克隆

從甜葉菊葉片提取的總RNA，經(jīng)cDNA 合成，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的SrUGT76G1、SrUGT85C2、SrUGT91D2m基因的長(zhǎng)度分別為1 425 bp、1 511 bp、1 441 bp，均橫跨各基因的編碼區(qū)序列（coding sequence,CDS）區(qū)域，同時(shí)PCR 產(chǎn)物兩端分別引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（表1）。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增條帶大小正確（圖3）。

圖3 3 個(gè)基因PCR 擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of 3 target genes

2.2 過(guò)渡載體的構(gòu)建

3 個(gè)基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物提純后，利用雙酶切方法，將之分別構(gòu)建至pKAFCR80 過(guò)渡用載體上使目的基因的前后連接上35S 啟動(dòng)子和NOS 終止子。獲得3 種過(guò)渡載體，分別命名為pNULPGE01001（pKAFCR80+SrUGT76G1）、pNULPGE01002（pKAFCR80+SrUGT85C2）、pNULPGE01003（pKAFCR80+SrUGT91D2m）。經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后菌落PCR 鑒定，確認(rèn)陽(yáng)性菌落里插入到pKAFCR80 過(guò)渡載體的目的基因片段條帶大小正確，分別為1 675 bp、1 764 bp、1 693 bp（圖4）。經(jīng)測(cè)序，與NCBI 公布的序列一致。

圖4 3 個(gè)基因以單獨(dú)形式連接至pKAFCR80 過(guò)渡載體后菌落PCR 鑒定Fig.4 Colony PCR identification of the 3 genes individually constructed into pKAFCR80 intermediate vector

2.3 單基因過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

3 種過(guò)渡載體，雙酶切處理后將目的基因連同前后的35S 啟動(dòng)子和NOS 終止子的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m基因組合片段，分別單獨(dú)連接到pKAFCR100 上，構(gòu)建出3 種單基因過(guò)量表達(dá)載體（圖2），分別命名為：pNULPGE01101：pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合（35S 啟動(dòng)子+SrUGT76G1+NOS 終止子）；pNULPGE01102：pKAFCR100+SrUGT85C2基因組合（35S 啟動(dòng)子+SrUGT85C2+NOS 終止子）；pNULPGE01103：pKAFCR100+SrUGT91D2m基因組合（35S 啟動(dòng)子+SrUGT91D2m+NOS 終止子）。

根據(jù)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后菌落PCR 電泳和測(cè)序可以確認(rèn)陽(yáng)性菌落里插入到pKAFCR100 的目的基因組合存在，且大小和序列正確，分別為2 901 bp、2 808 bp、2 919 bp（圖5）。

圖5 3 個(gè)基因以單獨(dú)形式連接至pKAFCR100 二元表達(dá)載體后菌落PCR 鑒定Fig.5 Colony PCR identification of the 3 genes individually constructed into pKAFCR100 binary vector

2.4 三基因過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建

過(guò)渡載體雙酶切后的SrUGT91D2m基因組合、SrUGT85C2基因組合，依次連接到pNULPGE01101（pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合）相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上。經(jīng)菌落PCR 和測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤（圖6），最終構(gòu)建出含有3 個(gè)基因組合的過(guò)量表達(dá)載體（圖2），pNULPGE01105：pKAFCR100+SrUGT76G1基因組合+SrUGT91D2m基因組合+SrUGT85C2基因組合。

圖6 3 個(gè)基因以組合形式連接至pKAFCR100 二元表達(dá)載體菌落PCR 鑒定Fig.6 Colony PCR identification of 3 genes in combination constructed into pKAFCR100 binary vector

2.5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

4 種基因過(guò)量表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甜葉菊無(wú)菌苗葉片后，在含有抗生素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成了愈傷組織，進(jìn)一步培育成完整植株。分別以目的基因和表達(dá)載體特有序列設(shè)計(jì)嵌合引物，經(jīng)基因組PCR 鑒定，獲得陽(yáng)性再生植株（圖7-圖8），說(shuō)明了構(gòu)建到基因過(guò)量表達(dá)載體的SrUGT76G1、SrUGT85C2和SrUGT91D2m三個(gè)基因已經(jīng)按單獨(dú)或組合的形式導(dǎo)入到這些PCR 陽(yáng)性的甜葉菊植株。而野生型對(duì)照甜葉菊植株，PCR 鑒定為陰性，說(shuō)明了PCR 引物設(shè)計(jì)是正確的。4 種基因過(guò)量表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株分別命名為Sr01101、Sr01102、Sr01103和Sr01105。

圖7 3 個(gè)基因以單獨(dú)形式轉(zhuǎn)化植株的PCR 鑒定Fig.7 PCR identification of the transgenic plant transferred 3 genes individually

圖8 3 個(gè)基因以組合形式轉(zhuǎn)化植株的PCR 鑒定Fig.8 PCR identification of the transgenic plant transferred 3 genes in combination

2.6 轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)量分析

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的結(jié)果，以野生型甜葉菊植株為對(duì)照，相對(duì)定量計(jì)算出導(dǎo)入基因在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的相對(duì)表達(dá)量和標(biāo)準(zhǔn)誤。單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01102）中，其相對(duì)表達(dá)量增加了8.3 倍；單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01103）中其相對(duì)表達(dá)量增加了10.26倍；單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01101）中其相對(duì)表達(dá)量增加了15.22 倍；3 個(gè)基因組合同時(shí)導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01105）中，三基因的相對(duì)表達(dá)量分別增加了9.76、8.88、11.69 倍（圖9）。說(shuō)明這些導(dǎo)入基因甜葉菊轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中達(dá)到了過(guò)量表達(dá)的效果，且各轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)情況良好（圖10）。

圖9 各種轉(zhuǎn)基因植株的基因相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Gene relative expressions in transgenic plantlets

圖10 各種轉(zhuǎn)基因植株與野生型對(duì)照植株Fig.10 Transgenic plantlets and wild-type plantlets

2.7 轉(zhuǎn)基因植株甜菊醇糖苷含量的分析

以野生型甜葉菊植株為對(duì)照，利用HPLC 方法分別對(duì)4 種不同基因過(guò)量表達(dá)載體誘導(dǎo)形成的甜葉菊轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行甜菊醇糖苷含量的分析。

根據(jù)不同濃度的甜菊醇糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，得到各種甜菊醇糖苷的回歸方程。其中ST 的回歸方程為Y= 3 251 326.26X+ 4 582.59,R2= 0.997 5；RA 的回歸方程為Y= 2 394 407.22X+2 280.21,R2= 0.999 1，從而計(jì)算得出不同轉(zhuǎn)基因植株中各種甜菊醇糖苷的含量。

結(jié)果表明，在所有的甜葉菊植株中，總甜菊醇糖苷（SGs）含量在12.74%-16.12%。單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT85C的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01102）中，總SGs、ST、RA 含量以及RA/SGs 與對(duì)照沒(méi)有明顯變化，而SMono 含量最高，達(dá)到1.57%，是對(duì)照的1.3 倍。單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01103）的SBio 含量最高，達(dá)到1.1%，是對(duì)照的1.7 倍；而SMono 含量最低，僅為0.68%，減少1.9 倍；SGs、ST 含量提高，RA 含量沒(méi)有明顯變化。單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01101）中，總SGs 含量顯著提高；RA 含量最高，達(dá)到10.77%，比對(duì)照提高2.0 倍；RA/SGs 也最高，達(dá)到71.7%，提高了1.8倍；而ST 的含量最低，僅為2.49%，減少2.2 倍。3個(gè)基因共表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株（Sr01105）中，總SGs含量顯著提高；RA 含量、RA/SGs 比例比對(duì)照分別提高1.8 倍和1.3 倍；Sbio 含量提高而ST 含量降低（表2）。

表2 不同轉(zhuǎn)基因植株中各種甜菊醇糖苷的含量Table 2 Variety of steviol glycosides contents in different transgenic plant

3 討論

本研究從甜葉菊葉片克隆了SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G13 個(gè)關(guān)鍵基因，構(gòu)建植物基因過(guò)量表達(dá)載體，以單獨(dú)或組合的形式將這些基因?qū)氲教鹑~菊中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了導(dǎo)入基因相對(duì)表達(dá)量以及各種甜菊醇糖苷成分的變化分析。從基因單獨(dú)過(guò)量表達(dá)的結(jié)果看，單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株中，總甜菊醇糖苷、ST、RA 含量以及RA 占總甜菊醇糖苷含量比例與野生型甜葉菊對(duì)照植株相比沒(méi)有明顯變化，而SMono 含量提高了1.3 倍。因?yàn)镾rUGT85C2 能夠催化甜菊醇甜菊醇C-13 位上發(fā)生糖基化連接第一個(gè)葡萄糖基，生成第一個(gè)甜菊醇糖苷—SMono，從而開(kāi)啟了各種甜菊醇糖苷的生物合成。但是單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT85C2的轉(zhuǎn)基因植株的其他甜菊醇糖苷含量與對(duì)照相差不大，這可能是由于SrUGT85C2屬于比較上游的基因，合成SMono 后，由于合成途徑分支多，產(chǎn)物分散，效果不容易顯現(xiàn)。RA 合成途徑中從SMono 轉(zhuǎn)化成SBio 也是重要的一步酶促反應(yīng)，這一過(guò)程以前一直未得到確認(rèn)。從專利和一些基因庫(kù)的資料推測(cè)該UGT 的序列，克隆了SrUGT91D2m基因。單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT91D2m的轉(zhuǎn)基因植株的SMono 含量顯著降低1.9 倍，而SBio 含量顯著增加1.7 倍，證明了SrUGT91D2m能夠催化甜菊醇C-13 位上再次連接第2 個(gè)葡萄糖基，轉(zhuǎn)化SMono 生成SBio。但SrUGT91D2m仍屬于上游基因，對(duì)其他甜菊醇糖苷生物合成的影響作用比較分散；有報(bào)道SrUGT91D2m有多種同源基因，甚至能夠催化甜菊醇C-19 位上連接第2 個(gè)葡萄糖基，生成RE 或RD［21,32］。

單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因甜葉菊植株中，總甜菊醇糖苷含量明顯提高，特別是RA 含量比對(duì)照提高了2 倍，達(dá)到10%以上；RA 占總甜菊醇糖苷總量比例提高1.8 倍，而ST 含量減少了一半以上。該效果優(yōu)于以前報(bào)道的在甜葉菊植株中過(guò)量表達(dá)該基因（RA 含量從0.79%提高到1.87%）［24］。SrUGT76G1能夠催化甜菊醇苷元C-13 位上連接第3個(gè)葡萄糖基（在第一個(gè)葡萄糖基上再連接一個(gè)葡萄糖基），將ST 生成轉(zhuǎn)化為RA，它是甜菊醇糖苷生物合成途徑中合成RA 的最后一個(gè)關(guān)鍵酶［23-24,33］。SrUGT76G1與底物具有很高的親和力，這種高親和力可以提高RA 合成前體物的合成量，從而使RA的合成量也提高［19］。SrUGT76G1基因的表達(dá)量與RA 的積累存在極顯著的相關(guān)性，直接影響著RA 的積累［27］。前人利用RNAi 技術(shù)有針對(duì)性地研究了SrKAH、SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1四個(gè)基因的功能，其中，SrUGT76G1的沉默使得甜菊醇糖苷的減少量最多。本研究也證明了單獨(dú)導(dǎo)入過(guò)量表達(dá)SrUGT76G1基因，能顯著提高甜葉菊細(xì)胞內(nèi)RA 的合成，該提高是由于SrUGT76G1催化ST 生成轉(zhuǎn)化為RA 的結(jié)果。ST 具有一定的苦味，RA 的甜味最接近蔗糖，是最理想的甜味成分，通過(guò)過(guò)量表達(dá)SrUGT76G1基因能夠提高RA 含量，而且甜味更純正，達(dá)到了我們轉(zhuǎn)基因培育甜葉菊優(yōu)良品系的目的。

3 個(gè)基因同時(shí)導(dǎo)入SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株與單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有太大的差別，總甜菊醇糖苷總量明顯提高；RA 含量、RA 占總甜菊醇糖苷總量比例比對(duì)照分別提高1.8 倍和1.3 倍，但ST 含量降低沒(méi)有那么明顯。說(shuō)明了多個(gè)基因的共同作用和影響是相當(dāng)復(fù)雜的，甜葉菊體內(nèi)各種甜菊醇糖苷的生物合成可能存在一定的平衡，上游基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m的過(guò)量表達(dá)牽涉到其他甜菊醇糖苷以及其他代謝物的合成。有報(bào)道各種甜菊醇糖苷的生物合成不單單受功能基因即各種UGTs 的影響，還受到轉(zhuǎn)錄因子如SrWRKY71 和miRNA 如miRStv_11、miR319g 的調(diào)控［34-35］，其規(guī)律還有待以后進(jìn)一步研究。

甜菊醇糖苷生物合成途徑中還有一個(gè)關(guān)鍵基因SrUGT74G1。與SrUGT76G1 不同，SrUGT74G1主要催化甜菊醇苷元在C-19 位上發(fā)生糖基化連接第一個(gè)葡萄糖基，在RA 生物合成途徑中催化Sbio 生成ST。因?yàn)镾T 帶有一定的苦味，影響了甜菊醇糖苷的口味和商業(yè)利用價(jià)值，所以本研究沒(méi)有對(duì)該基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)實(shí)驗(yàn)。以上這些結(jié)果為以后通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)調(diào)控甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，培育RA 含量高的高品質(zhì)甜葉菊新品系提供了理論依據(jù)和技術(shù)方法。

4 結(jié)論

從甜葉菊葉片克隆到SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1基因，將這些基因以單獨(dú)或組合形式在甜葉菊中過(guò)量表達(dá)，單獨(dú)導(dǎo)入SrUGT76G1能夠顯著提高總糖苷，特別是RA 的含量。