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多主棒孢SdhB-H278Y突變位點real-time PCR 檢測體系的建立與應用

2023-01-31 03:13:52朱廣雪閻昱韜孫炳學周榮佳岳圓圓謝學文柴阿麗李寶聚石延霞
中國蔬菜 2023年1期
關鍵詞:抗性黃瓜定量

朱廣雪 閻昱韜 孫炳學 周榮佳 岳圓圓 謝學文 柴阿麗 李 磊 李寶聚* 石延霞*

(1 青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院,山東青島 266109;2 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的黃瓜棒孢葉斑病是危害黃瓜較重的葉部病害之一(楊潔,2016),在我國的北京、山東、遼寧、河北等多個?。ㄊ校┘叭毡?、韓國、美國等地均有發(fā)生(李長松 等,2009;高葦 等,2011;楊苗,2013)。用于防治該病害的殺菌劑主要有琥珀酸脫氫酶抑制劑類(SDHIs)殺菌劑、甲氧基丙烯酸酯類(QoIs)殺菌劑等,但目前該病菌對大部分殺菌劑產(chǎn)生了抗性(Duan et al.,2019;Zhu et al.,2019)。啶酰菌胺作為SDHIs 殺菌劑中的一個廣譜性殺菌劑(顏范勇 等,2008;陳莉 等,2009),其通過阻斷琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)鐵硫簇與泛醌結合區(qū)域的電子傳遞來阻礙病原菌的能量代謝,抑制病菌正常生長,從而達到防治病害的目的(李良孔 等,2011)。

2004 年啶酰菌胺正式登記(亦冰,2006),多用于作物灰霉病的防治,但在施用過程中對多主棒孢間接產(chǎn)生了選擇壓力,導致多主棒孢對啶酰菌胺產(chǎn)生了抗性。藥靶基因突變是多主棒孢產(chǎn)生抗藥性的一種重要機制,日本學者Miyamoto 等(2009,2010)報道了由不同抗性突變導致的對啶酰菌胺的抗性水平差異,SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺超高抗,SdhB-H278R 和SdhC-S73P 突變株為高抗,SdhD-G109V、SdhD-S89P 和SdhD-G109V 突變株為中抗。引起我國多主棒孢對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的突變類型主要有SdhB-H278R/Y/L、SdhBI280V、SdhC-S73P、SdhD-D95E、SdhD-H105R、SdhD-G109V 等,其中SdhB-H278Y 突變可導致對啶酰菌胺高水平抗性(朱發(fā)娣,2018;Sun et al.,2022)。傳統(tǒng)的抗藥性檢測方法如菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法、抑菌圈法等存在周期長、工作量大且無法進行定量研究的問題(金恭璽 等,2015;李卓等,2017),因此建立一種高效、靈敏、定量的多主棒孢SdhB-H278Y 突變檢測方法,對于該病害的預防具有重要意義。隨著分子生物技術的發(fā)展,近年來多種分子檢測手段廣泛應用于植物病原菌的檢測和定量研究,如普通PCR(allele specific PCR,AS-PCR)、實時熒光定量PCR(real-time PCR)、環(huán)介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification method,LAMP)和多重等位基因PCR(multiplex allele specific PCR,MAS-PCR)等。real-time PCR 是美國應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems,ABI)推出的通過檢測熒光信號變化進行核酸定量的技術(王季秋 等,2016),目前在病原菌抗藥性檢測上也廣泛應用,先后建立了核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)抗多菌靈β-微管蛋白E198A 突變位點real-time PCR 檢測體系、多主棒孢抗啶酰菌胺SdhB-H278R 突變位點real-time PCR 檢測體系、灰葡萄孢抗啶酰菌胺的運輸體基因及琥珀酸脫氫酶基因表達量的real-time PCR 檢測體系等(趙偉,2005;孫炳學 等,2018;金宇杰,2021)。

中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所蔬菜病害防控創(chuàng)新團隊前期發(fā)現(xiàn)的多主棒孢SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺表現(xiàn)為超高水平抗性,增加了黃瓜棒孢葉斑病的防治難度。本試驗根據(jù)黃瓜多主棒孢SdhB基因序列差異設計特異性引物,構建realtime PCR 分子檢測體系,并對該體系進行特異性、靈敏度等評價,以期建立高效、靈敏、定量檢測黃瓜多主棒孢SdhB-H278Y 抗性突變的real-time PCR體系,為黃瓜棒孢葉斑病抗性治理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:20 株多主棒孢及其他8 種常見病原菌(表1)均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所蔬菜病害防控創(chuàng)新團隊提供,其中多主棒孢HG15050740-4、SD1 已知SdhB基因序列(圖1)。HG15050740-4 攜帶SdhB-H278Y 突變,作為陽性對照;SD1 為野生型敏感菌株,作為陰性對照。

供試試劑和培養(yǎng)基:96%啶酰菌胺原藥,購自陜西美邦農(nóng)藥有限公司;植物基因組DNA 提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green),購自天根生化科技(北京)有限公司;2×TaqMaster Mix(Dye Plus),購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;PDA 培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水定容至1 L)。

主要儀器設備:NanoDrop 2000c 超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc,美國)、3-18K 型離心機(Sigma,德國)、7500 熒光定量PCR 儀(ABI,美國)、S1000 Thermal Cycle PCR儀(BIORAD,美國)、Jel Doc 2001 型凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,美國)。

1.2 引物合成及測序

real-time PCR 和AS-PCR 所用引物及基因序列均由北京博邁德基因技術有限公司合成和測序。

1.3 DNA 提取

分別將供試菌株接菌至PDA 培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)5 d,刮取菌絲作為提取樣本。利用植物基因組DNA 提取試劑盒,根據(jù)試劑盒中的說明書提取菌絲基因組DNA,利用NanoDrop 2000c 測定DNA濃度;使用ddH2O稀釋至100 ng·μL-1,-20 ℃保存。

1.4 SdhB 序列測定

參考孫炳學等(2018)的方法,以表1 中序號2~17 的多主棒孢DNA 為模板,使用引物Cc-SdhB-F 和Cc-SdhB-R(表2)擴增SdhB基因片段,對PCR 產(chǎn)物進行測序。

表1 供試菌株信息

AS-PCR 反應體系(50 μL):2×TaqMaster Mix 25 μL,引物Cc-SdhB-F 和Cc-SdhB-R 終濃度為0.4 μmol·L-1,模板DNA 1 μL,ddH2O 補足至50 μL。反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,58 ℃15 s,72 ℃ 90 s,循環(huán)30 次;72 ℃ 5 min。

1.5 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺敏感性測定

采用菌絲生長速率法(Miyamoto et al.,2009)測定攜帶SdhB-H278Y 突變的多主棒孢及野生型敏感菌株SD1 對啶酰菌胺的敏感性。使用打孔器在培養(yǎng)好的菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅,接種于含啶酰菌胺濃度梯度(0.1、0.5、1.0、10.0、30.0 μg·mL-1)的PDA 平板上,以不加藥劑為空白對照,每處理3 次重復。28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,利用Excel 軟件計算EC50值、毒力回歸方程和相關系數(shù)。

1.6 引物設計

根據(jù)GenBank 中多主棒孢SdhB基因序列(登錄號:MG729603、MG729607),利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計特異性引物及內(nèi)參引物。針對SdhB-H278Y 突變位點設計特異性引物B-H278Y-Fc/R3e,并將包含SdhB-H278Y 突變位點的部分SdhB基因作為內(nèi)參基因設計內(nèi)參引物B-H278Y-NC-F/R?;趬A基錯配原則,將下游特異性引物3′末端與突變的堿基胸腺嘧啶(T)配對,靠近3′端第3 位的位置引入錯配堿基,以增加引物特異性(朱發(fā)娣,2018)(表2)。

1.7 引物特異性檢驗

以攜帶SdhB-H278Y突變的菌株HG15050740-4、SDH 其他點突變的多主棒孢及其他常見8 種病原菌(表1)DNA 為模板,以ddH2O 為陰性對照,使用引物B-H278Y-Fc、B-H278Y-R3e 進行PCR擴增,檢驗引物特異性。

AS-PCR 反應體系(20 μL):2×TaqMaster Mix 10 μL,引物B-H278Y-Fc 和B-H278Y-R3e 終濃度為0.4 μmol·L-1,模板DNA 1 μL,ddH2O 補足至20 μL。反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,66.5 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)35 次;72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,采用凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

real-time PCR 反應體系(20 μL):2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,50×ROX Reference Dye 0.4 μL,上、下游引物終濃度均為0.4 μmol·L-1,模板DNA 1 μL,RNase-free ddH2O 補足至20 μL。反應程序:95 ℃ 15 min;95 ℃ 15 s,66.5 ℃ 15 s,72 ℃(熒光信號接受區(qū))30 s,循環(huán)40 次;95 ℃15 s,60 ℃(每次循環(huán)增加0.35 ℃)1 min,60 ℃15 s,循環(huán)100 次。以熔解曲線是否有單一特異的吸收峰作為引物特異性的判斷標準。

1.8 標準曲線的建立

以SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板,調整SdhBH278Y 突變株DNA 摩爾質量分別占DNA 總量的5%、10%、20%、40%、80%和100%,使用特異性引物B-H278Y-Fc/R3e 和內(nèi)參引物B-H278Y-NCF/R 進行real-time PCR 擴增。計算ΔCt 值(ΔCt=Ct特異性引物-Ct內(nèi)參引物),以ΔCt 值為縱坐標,以SdhB-H278Y 突變株DNA 所占比例的對數(shù)為橫坐標,制作標準曲線(孫炳學 等,2018),3 次重復。real-time PCR 擴增體系及反應程序同1.7。

1.9 靈敏度檢測

將定量SdhB-H278Y 基因組DNA 進行10 倍濃度梯度稀釋,至終濃度分別為3.6、3.6×10-1、3.6×10-2、3.6×10-3、3.6×10-4、3.6×10-5、3.6×10-6、3.6×10-7ng·μL-1,分別采用AS-PCR 和realtime PCR 的擴增方法進行檢測,根據(jù)擴增片段的有無、大小和熒光值的大小,評價引物的靈敏度。ASPCR、real-time PCR 擴增體系及反應程序同1.7。

1.10 real-time PCR 檢測體系的驗證與應用

菌株DNA 驗證:以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA作為模板,調整SdhB-H278Y 突變株DNA 摩爾質量分別占DNA總量的90%、60%、30%、15%和7.5%,3 次重復,驗證標準曲線的可靠性。利用Excel 軟件計算標準差及預期值與試驗值的相關系數(shù)。

田間SdhB-H278Y 突變株定量檢測:從山東地區(qū)黃瓜種植大棚內(nèi)隨機采集黃瓜棒孢葉斑病病樣12 份,采用75%乙醇消毒葉片表面3 次,隨后用無菌水清洗3 次;使用無菌刀片切取病斑組織,然后用植物基因組DNA 提取試劑盒提取病斑組織DNA,利用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NCF/R 進行real-time PCR 擴增,以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 基因組DNA 為陽性對照,以野生型敏感菌株SD1 基因組DNA 為陰性對照,應用已構建的標準曲線計算病斑中SdhB-H278Y 突變株DNA 占病斑總DNA 的比例,3 次重復,驗證檢測體系是否可直接用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhBH278Y 突變株占比的檢測。

2 結果與分析

2.1 多主棒孢SdhB 核酸序列和氨基酸序列分析

以16 株多主棒孢DNA 為模板,使用引物Cc-SdhB-F/R 擴增SdhB基因并測序。結果顯示:多主棒孢SdhB基因在832、838 位發(fā)生堿基突變(C→T、A→G),導致278 位密碼子由組氨酸(CAC,H)突變成酪氨酸(TAC,Y),即SdhB-H278Y;280 位密碼子由異亮氨酸(ATT,I)突變成纈氨酸(GTT,V),即SdhB-I280V(圖1)。16 株多主棒孢中有5 株攜帶SdhB-H278Y 突變,5 株攜帶SdhB-I280V 突變(表1)。

圖1 部分多主棒孢SdhB 核酸序列和氨基酸序列信息

2.2 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定SdhB-H278Y 突變株及SD1 對啶酰菌胺的敏感性,結果表明(表3):SD1 對啶酰菌胺的EC50值為0.09 μg·mL-1,SdhB-H278Y 突變株中僅1 株EC50值為21.47 μg·mL-1,其余5 株EC50值均大于30 μg·mL-1。

表3 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的敏感性測定結果

2.3 引物特異性檢驗

以攜帶SdhB-H278Y 突變的菌株HG15050740-4、SDH 其他點突變的多主棒孢及其他常見8 種病原菌DNA 為模板進行AS-PCR 擴增,評價B-H278Y-Fc/R3e 引物的特異性。結果表明(圖2):攜帶SdhBH278Y 突變的菌株能擴增出明亮且單一的條帶,大小為171 bp,而SDH 其他點突變的菌株、8 種常見病原菌DNA 及陰性對照ddH2O 均未擴增出條帶,證明該引物可用于多主棒孢SdhB-H278Y 突變特異性檢測。

圖2 引物特異性檢測結果

應用特異性引物B-H278Y-Fc/R3e 及內(nèi)參引物B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 檢測,結果顯示:在熔解溫度為88.66 ℃時,B-H278Y-Fc/R3e 的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)單一的特異性峰(圖3-a);在88.18 ℃時,B-H278Y-NC-F/R 的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)單一的特異性峰(圖3-b)。

圖3 real-time PCR 熔解曲線分析結果

2.4 特異性引物靈敏度檢測

以10 倍梯度稀釋的SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 基因組DNA 為模板,對引物B-H278Y-Fc/R3e 進行AS-PCR 和real-time PCR靈敏度測定。結果表明:AS-PCR 檢測的靈敏度為3.6×10-3ng·μL-1(圖4-a),real-time PCR 檢測的靈敏度為3.6×10-4ng·μL-1(圖4-b),即real-time PCR 的靈敏度為AS-PCR 的10 倍。

圖4 AS-PCR 和real-time PCR 檢測體系的靈敏度比較

2.5 real-time PCR 標準曲線的建立

以SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板,使用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 擴增,建立了標準曲線y=-3.016 6x+6.603 8,斜率為-3.016 6,截距為6.603 8,相關系數(shù)R2=0.992 9,呈現(xiàn)出良好的線性關系(圖5)。

圖5 real-time PCR 檢測SdhB-H278Y 突變的標準曲線

2.6 real-time PCR 檢測體系的驗證與應用

以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板,使用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 擴增。結果顯示:DNA 檢測值依次為(84.35±3.88)%、(54.89±9.60)%、(23.59±3.85)%、(10.20±2.36)%、(3.67 ± 0.06)%,與對應的預期值90%、60%、30%、15%、7.5%具有很高的相關性,R2=0.999 7,表明該檢測體系具有可靠性,可定量檢測總DNA 中SdhB-H278Y 突變株DNA 所占比例。

田間多主棒孢SdhB-H278Y 定量檢測結果表明(表4):12 份田間病樣的DNA 檢測結果為0.12%~2.69%,平均值為0.69%,與陰性對照無顯著差異,而與陽性對照差異顯著,表明該檢測體系可用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhB-H278Y 突變株所占比例的檢測。

表4 田間黃瓜多主棒孢SdhB-H278Y 定量檢測結果

3 結論與討論

近年來,由多主棒孢引起的黃瓜棒孢葉斑病給我國黃瓜生產(chǎn)造成了嚴重的危害,且番茄、茄子等蔬菜的棒孢葉斑病也在我國大面積發(fā)生,造成嚴重的經(jīng)濟損失(李寶聚 等,2012)。多主棒孢SdhBH278Y 突變在我國山東、河北等地黃瓜主產(chǎn)區(qū)發(fā)生頻率高,導致病菌對啶酰菌胺產(chǎn)生超高水平抗性(朱發(fā)娣,2018),且與吡噻菌胺、氟吡菌酰胺、萎銹靈存在正交互抗性(閻昱韜 等,2020)。為了及時、有效檢測該突變在田間的頻率變化,建立一種高效real-time PCR 檢測技術是十分必要的,將為該病害的風險評估、防治策略提供理論依據(jù)。

本試驗通過對黃瓜多主棒孢SdhB序列的測定,發(fā)現(xiàn)供試多主棒孢攜帶SdhB-H278Y 和SdhBI280V 突變。SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的EC50值為21.47 μg·mL-1或>30 μg·mL-1。也有報道多主棒孢SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的EC50值均大于30 μg·mL-1,且對其他SDHIs 殺菌劑也有較高的抗性水平,推測可能與同類型藥劑選擇壓力有關(Shi et al.,2021)。此外,在茄鏈格孢(Alternaria solani)中也發(fā)現(xiàn)了SdhB-H278Y突變,且在啶酰菌胺濃度為100 μg·mL-1時SdhB-H278Y突變株仍能繼續(xù)生長,而野生型敏感菌株在啶酰菌胺濃度為0.1~10 μg·mL-1時菌絲生長受到明顯抑制(Mostafanezhad et al.,2022),這表明SdhBH278Y 突變株對啶酰菌胺有較高水平抗性,應盡快選擇有效藥劑進行抗SDHIs 多主棒孢的抗性治理。

本試驗建立的real-time PCR 檢測體系具有良好的線性關系(R2=0.992 9),可以快速定量檢測田間SdhB-H278Y 突變株。經(jīng)多主棒孢菌株DNA驗證,試驗值與預期值具有極高的相關性(R2=0.999 7),可用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhBH278Y 突變株所占比例的檢測。該檢測體系熔解曲線在88.66 ℃有唯一的產(chǎn)物吸收峰,靈敏度達到3.6×10-4ng·μL-1,是AS-PCR 的10 倍。用于核盤菌β-微管蛋白E198A 突變位點real-time PCR檢測體系的靈敏度也是AS-PCR 的10~100 倍(趙偉,2005),與本試驗結果基本一致。利用LAMP技術對多主棒孢Cytb基因G143A 突變也可進行有效檢測(Li et al.,2021),但與real-time PCR 相比,LAMP 需要設計多對引物(Prida et al.,2008),在反應過程中產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物,極易造成交叉污染,定量研究時還需使用特殊儀器(如濁度儀),且易產(chǎn)生假陽性(Shi et al.,2020)。而real-time PCR 具有靈敏度高、特異性和可靠性強等特點,還能實現(xiàn)多重反應,自動化程度高,無污染,在定量檢測中發(fā)揮著重要的作用(Mori et al.,2001;歐陽松應 等,2014;李文學 等,2019)。

綜上,本試驗建立的real-time PCR 檢測技術體系能夠高效、靈敏、定量檢測多主棒孢SdhBH278Y 突變株在田間的發(fā)生,為黃瓜多主棒孢抗性治理提供科學的技術手段,以便及時有效開展黃瓜棒孢葉斑病抗藥性治理。

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