朱廣雪 閻昱韜 孫炳學 周榮佳 岳圓圓 謝學文 柴阿麗 李 磊 李寶聚* 石延霞*

（1 青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山東青島 266109；2 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的黃瓜棒孢葉斑病是危害黃瓜較重的葉部病害之一（楊潔，2016），在我國的北京、山東、遼寧、河北等多個?。ㄊ校┘叭毡?、韓國、美國等地均有發(fā)生（李長松 等，2009；高葦 等，2011；楊苗，2013）。用于防治該病害的殺菌劑主要有琥珀酸脫氫酶抑制劑類（SDHIs）殺菌劑、甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）殺菌劑等，但目前該病菌對大部分殺菌劑產(chǎn)生了抗性（Duan et al.，2019；Zhu et al.，2019）。啶酰菌胺作為SDHIs 殺菌劑中的一個廣譜性殺菌劑（顏范勇 等，2008；陳莉 等，2009），其通過阻斷琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）鐵硫簇與泛醌結合區(qū)域的電子傳遞來阻礙病原菌的能量代謝，抑制病菌正常生長，從而達到防治病害的目的（李良孔 等，2011）。

2004 年啶酰菌胺正式登記（亦冰，2006），多用于作物灰霉病的防治，但在施用過程中對多主棒孢間接產(chǎn)生了選擇壓力，導致多主棒孢對啶酰菌胺產(chǎn)生了抗性。藥靶基因突變是多主棒孢產(chǎn)生抗藥性的一種重要機制，日本學者Miyamoto 等（2009，2010）報道了由不同抗性突變導致的對啶酰菌胺的抗性水平差異，SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺超高抗，SdhB-H278R 和SdhC-S73P 突變株為高抗，SdhD-G109V、SdhD-S89P 和SdhD-G109V 突變株為中抗。引起我國多主棒孢對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的突變類型主要有SdhB-H278R/Y/L、SdhBI280V、SdhC-S73P、SdhD-D95E、SdhD-H105R、SdhD-G109V 等，其中SdhB-H278Y 突變可導致對啶酰菌胺高水平抗性（朱發(fā)娣，2018；Sun et al.，2022）。傳統(tǒng)的抗藥性檢測方法如菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法、抑菌圈法等存在周期長、工作量大且無法進行定量研究的問題（金恭璽 等，2015；李卓等，2017），因此建立一種高效、靈敏、定量的多主棒孢SdhB-H278Y 突變檢測方法，對于該病害的預防具有重要意義。隨著分子生物技術的發(fā)展，近年來多種分子檢測手段廣泛應用于植物病原菌的檢測和定量研究，如普通PCR（allele specific PCR，AS-PCR）、實時熒光定量PCR（real-time PCR）、環(huán)介導等溫擴增技術（loop mediated isothermal amplification method，LAMP）和多重等位基因PCR（multiplex allele specific PCR，MAS-PCR）等。real-time PCR 是美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）推出的通過檢測熒光信號變化進行核酸定量的技術（王季秋 等，2016），目前在病原菌抗藥性檢測上也廣泛應用，先后建立了核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）抗多菌靈β-微管蛋白E198A 突變位點real-time PCR 檢測體系、多主棒孢抗啶酰菌胺SdhB-H278R 突變位點real-time PCR 檢測體系、灰葡萄孢抗啶酰菌胺的運輸體基因及琥珀酸脫氫酶基因表達量的real-time PCR 檢測體系等（趙偉，2005；孫炳學 等，2018；金宇杰，2021）。

中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所蔬菜病害防控創(chuàng)新團隊前期發(fā)現(xiàn)的多主棒孢SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺表現(xiàn)為超高水平抗性，增加了黃瓜棒孢葉斑病的防治難度。本試驗根據(jù)黃瓜多主棒孢SdhB基因序列差異設計特異性引物，構建realtime PCR 分子檢測體系，并對該體系進行特異性、靈敏度等評價，以期建立高效、靈敏、定量檢測黃瓜多主棒孢SdhB-H278Y 抗性突變的real-time PCR體系，為黃瓜棒孢葉斑病抗性治理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：20 株多主棒孢及其他8 種常見病原菌（表1）均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所蔬菜病害防控創(chuàng)新團隊提供，其中多主棒孢HG15050740-4、SD1 已知SdhB基因序列（圖1）。HG15050740-4 攜帶SdhB-H278Y 突變，作為陽性對照；SD1 為野生型敏感菌株，作為陰性對照。

供試試劑和培養(yǎng)基：96%啶酰菌胺原藥，購自陜西美邦農(nóng)藥有限公司；植物基因組DNA 提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green），購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqMaster Mix（Dye Plus），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水定容至1 L）。

主要儀器設備：NanoDrop 2000c 超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc，美國）、3-18K 型離心機（Sigma，德國）、7500 熒光定量PCR 儀（ABI，美國）、S1000 Thermal Cycle PCR儀（BIORAD，美國）、Jel Doc 2001 型凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）。

1.2 引物合成及測序

real-time PCR 和AS-PCR 所用引物及基因序列均由北京博邁德基因技術有限公司合成和測序。

1.3 DNA 提取

分別將供試菌株接菌至PDA 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，刮取菌絲作為提取樣本。利用植物基因組DNA 提取試劑盒，根據(jù)試劑盒中的說明書提取菌絲基因組DNA，利用NanoDrop 2000c 測定DNA濃度；使用ddH2O稀釋至100 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.4 SdhB 序列測定

參考孫炳學等（2018）的方法，以表1 中序號2～17 的多主棒孢DNA 為模板，使用引物Cc-SdhB-F 和Cc-SdhB-R（表2）擴增SdhB基因片段，對PCR 產(chǎn)物進行測序。

表1 供試菌株信息

AS-PCR 反應體系（50 μL）：2×TaqMaster Mix 25 μL，引物Cc-SdhB-F 和Cc-SdhB-R 終濃度為0.4 μmol·L-1，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足至50 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃15 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 5 min。

1.5 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺敏感性測定

采用菌絲生長速率法（Miyamoto et al.，2009）測定攜帶SdhB-H278Y 突變的多主棒孢及野生型敏感菌株SD1 對啶酰菌胺的敏感性。使用打孔器在培養(yǎng)好的菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，接種于含啶酰菌胺濃度梯度（0.1、0.5、1.0、10.0、30.0 μg·mL-1）的PDA 平板上，以不加藥劑為空白對照，每處理3 次重復。28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，利用Excel 軟件計算EC50值、毒力回歸方程和相關系數(shù)。

1.6 引物設計

根據(jù)GenBank 中多主棒孢SdhB基因序列（登錄號：MG729603、MG729607），利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計特異性引物及內(nèi)參引物。針對SdhB-H278Y 突變位點設計特異性引物B-H278Y-Fc/R3e，并將包含SdhB-H278Y 突變位點的部分SdhB基因作為內(nèi)參基因設計內(nèi)參引物B-H278Y-NC-F/R?；趬A基錯配原則，將下游特異性引物3′末端與突變的堿基胸腺嘧啶（T）配對，靠近3′端第3 位的位置引入錯配堿基，以增加引物特異性（朱發(fā)娣，2018）（表2）。

1.7 引物特異性檢驗

以攜帶SdhB-H278Y突變的菌株HG15050740-4、SDH 其他點突變的多主棒孢及其他常見8 種病原菌（表1）DNA 為模板，以ddH2O 為陰性對照，使用引物B-H278Y-Fc、B-H278Y-R3e 進行PCR擴增，檢驗引物特異性。

AS-PCR 反應體系（20 μL）：2×TaqMaster Mix 10 μL，引物B-H278Y-Fc 和B-H278Y-R3e 終濃度為0.4 μmol·L-1，模板DNA 1 μL，ddH2O 補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，66.5 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35 次；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

real-time PCR 反應體系（20 μL）：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上、下游引物終濃度均為0.4 μmol·L-1，模板DNA 1 μL，RNase-free ddH2O 補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，66.5 ℃ 15 s，72 ℃（熒光信號接受區(qū)）30 s，循環(huán)40 次；95 ℃15 s，60 ℃（每次循環(huán)增加0.35 ℃）1 min，60 ℃15 s，循環(huán)100 次。以熔解曲線是否有單一特異的吸收峰作為引物特異性的判斷標準。

1.8 標準曲線的建立

以SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板，調整SdhBH278Y 突變株DNA 摩爾質量分別占DNA 總量的5%、10%、20%、40%、80%和100%，使用特異性引物B-H278Y-Fc/R3e 和內(nèi)參引物B-H278Y-NCF/R 進行real-time PCR 擴增。計算ΔCt 值（ΔCt＝Ct特異性引物-Ct內(nèi)參引物），以ΔCt 值為縱坐標，以SdhB-H278Y 突變株DNA 所占比例的對數(shù)為橫坐標，制作標準曲線（孫炳學 等，2018），3 次重復。real-time PCR 擴增體系及反應程序同1.7。

1.9 靈敏度檢測

將定量SdhB-H278Y 基因組DNA 進行10 倍濃度梯度稀釋，至終濃度分別為3.6、3.6×10-1、3.6×10-2、3.6×10-3、3.6×10-4、3.6×10-5、3.6×10-6、3.6×10-7ng·μL-1，分別采用AS-PCR 和realtime PCR 的擴增方法進行檢測，根據(jù)擴增片段的有無、大小和熒光值的大小，評價引物的靈敏度。ASPCR、real-time PCR 擴增體系及反應程序同1.7。

1.10 real-time PCR 檢測體系的驗證與應用

菌株DNA 驗證：以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA作為模板，調整SdhB-H278Y 突變株DNA 摩爾質量分別占DNA總量的90%、60%、30%、15%和7.5%，3 次重復，驗證標準曲線的可靠性。利用Excel 軟件計算標準差及預期值與試驗值的相關系數(shù)。

田間SdhB-H278Y 突變株定量檢測：從山東地區(qū)黃瓜種植大棚內(nèi)隨機采集黃瓜棒孢葉斑病病樣12 份，采用75%乙醇消毒葉片表面3 次，隨后用無菌水清洗3 次；使用無菌刀片切取病斑組織，然后用植物基因組DNA 提取試劑盒提取病斑組織DNA，利用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NCF/R 進行real-time PCR 擴增，以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 基因組DNA 為陽性對照，以野生型敏感菌株SD1 基因組DNA 為陰性對照，應用已構建的標準曲線計算病斑中SdhB-H278Y 突變株DNA 占病斑總DNA 的比例，3 次重復，驗證檢測體系是否可直接用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhBH278Y 突變株占比的檢測。

2 結果與分析

2.1 多主棒孢SdhB 核酸序列和氨基酸序列分析

以16 株多主棒孢DNA 為模板，使用引物Cc-SdhB-F/R 擴增SdhB基因并測序。結果顯示：多主棒孢SdhB基因在832、838 位發(fā)生堿基突變（C→T、A→G），導致278 位密碼子由組氨酸（CAC，H）突變成酪氨酸（TAC，Y），即SdhB-H278Y；280 位密碼子由異亮氨酸（ATT，I）突變成纈氨酸（GTT，V），即SdhB-I280V（圖1）。16 株多主棒孢中有5 株攜帶SdhB-H278Y 突變，5 株攜帶SdhB-I280V 突變（表1）。

圖1 部分多主棒孢SdhB 核酸序列和氨基酸序列信息

2.2 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定SdhB-H278Y 突變株及SD1 對啶酰菌胺的敏感性，結果表明（表3）：SD1 對啶酰菌胺的EC50值為0.09 μg·mL-1，SdhB-H278Y 突變株中僅1 株EC50值為21.47 μg·mL-1，其余5 株EC50值均大于30 μg·mL-1。

表3 SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的敏感性測定結果

2.3 引物特異性檢驗

以攜帶SdhB-H278Y 突變的菌株HG15050740-4、SDH 其他點突變的多主棒孢及其他常見8 種病原菌DNA 為模板進行AS-PCR 擴增，評價B-H278Y-Fc/R3e 引物的特異性。結果表明（圖2）：攜帶SdhBH278Y 突變的菌株能擴增出明亮且單一的條帶，大小為171 bp，而SDH 其他點突變的菌株、8 種常見病原菌DNA 及陰性對照ddH2O 均未擴增出條帶，證明該引物可用于多主棒孢SdhB-H278Y 突變特異性檢測。

圖2 引物特異性檢測結果

應用特異性引物B-H278Y-Fc/R3e 及內(nèi)參引物B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 檢測，結果顯示：在熔解溫度為88.66 ℃時，B-H278Y-Fc/R3e 的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)單一的特異性峰（圖3-a）；在88.18 ℃時，B-H278Y-NC-F/R 的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)單一的特異性峰（圖3-b）。

圖3 real-time PCR 熔解曲線分析結果

2.4 特異性引物靈敏度檢測

以10 倍梯度稀釋的SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 基因組DNA 為模板，對引物B-H278Y-Fc/R3e 進行AS-PCR 和real-time PCR靈敏度測定。結果表明：AS-PCR 檢測的靈敏度為3.6×10-3ng·μL-1（圖4-a），real-time PCR 檢測的靈敏度為3.6×10-4ng·μL-1（圖4-b），即real-time PCR 的靈敏度為AS-PCR 的10 倍。

圖4 AS-PCR 和real-time PCR 檢測體系的靈敏度比較

2.5 real-time PCR 標準曲線的建立

以SdhB-H278Y 突變株HG15050740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板，使用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 擴增，建立了標準曲線y＝-3.016 6x+6.603 8，斜率為-3.016 6，截距為6.603 8，相關系數(shù)R2＝0.992 9，呈現(xiàn)出良好的線性關系（圖5）。

圖5 real-time PCR 檢測SdhB-H278Y 突變的標準曲線

2.6 real-time PCR 檢測體系的驗證與應用

以SdhB-H278Y 突變株HG15051740-4 和野生型敏感菌株SD1 的混合DNA 作為模板，使用引物B-H278Y-Fc/R3e、B-H278Y-NC-F/R 進行real-time PCR 擴增。結果顯示：DNA 檢測值依次為（84.35±3.88）%、（54.89±9.60）%、（23.59±3.85）%、（10.20±2.36）%、（3.67 ± 0.06）%，與對應的預期值90%、60%、30%、15%、7.5%具有很高的相關性，R2＝0.999 7，表明該檢測體系具有可靠性，可定量檢測總DNA 中SdhB-H278Y 突變株DNA 所占比例。

田間多主棒孢SdhB-H278Y 定量檢測結果表明（表4）：12 份田間病樣的DNA 檢測結果為0.12%～2.69%，平均值為0.69%，與陰性對照無顯著差異，而與陽性對照差異顯著，表明該檢測體系可用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhB-H278Y 突變株所占比例的檢測。

表4 田間黃瓜多主棒孢SdhB-H278Y 定量檢測結果

3 結論與討論

近年來，由多主棒孢引起的黃瓜棒孢葉斑病給我國黃瓜生產(chǎn)造成了嚴重的危害，且番茄、茄子等蔬菜的棒孢葉斑病也在我國大面積發(fā)生，造成嚴重的經(jīng)濟損失（李寶聚 等，2012）。多主棒孢SdhBH278Y 突變在我國山東、河北等地黃瓜主產(chǎn)區(qū)發(fā)生頻率高，導致病菌對啶酰菌胺產(chǎn)生超高水平抗性（朱發(fā)娣，2018），且與吡噻菌胺、氟吡菌酰胺、萎銹靈存在正交互抗性（閻昱韜 等，2020）。為了及時、有效檢測該突變在田間的頻率變化，建立一種高效real-time PCR 檢測技術是十分必要的，將為該病害的風險評估、防治策略提供理論依據(jù)。

本試驗通過對黃瓜多主棒孢SdhB序列的測定，發(fā)現(xiàn)供試多主棒孢攜帶SdhB-H278Y 和SdhBI280V 突變。SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的EC50值為21.47 μg·mL-1或＞30 μg·mL-1。也有報道多主棒孢SdhB-H278Y 突變株對啶酰菌胺的EC50值均大于30 μg·mL-1，且對其他SDHIs 殺菌劑也有較高的抗性水平，推測可能與同類型藥劑選擇壓力有關（Shi et al.，2021）。此外，在茄鏈格孢（Alternaria solani）中也發(fā)現(xiàn)了SdhB-H278Y突變，且在啶酰菌胺濃度為100 μg·mL-1時SdhB-H278Y突變株仍能繼續(xù)生長，而野生型敏感菌株在啶酰菌胺濃度為0.1～10 μg·mL-1時菌絲生長受到明顯抑制（Mostafanezhad et al.，2022），這表明SdhBH278Y 突變株對啶酰菌胺有較高水平抗性，應盡快選擇有效藥劑進行抗SDHIs 多主棒孢的抗性治理。

本試驗建立的real-time PCR 檢測體系具有良好的線性關系（R2＝0.992 9），可以快速定量檢測田間SdhB-H278Y 突變株。經(jīng)多主棒孢菌株DNA驗證，試驗值與預期值具有極高的相關性（R2＝0.999 7），可用于黃瓜棒孢葉斑病病斑中SdhBH278Y 突變株所占比例的檢測。該檢測體系熔解曲線在88.66 ℃有唯一的產(chǎn)物吸收峰，靈敏度達到3.6×10-4ng·μL-1，是AS-PCR 的10 倍。用于核盤菌β-微管蛋白E198A 突變位點real-time PCR檢測體系的靈敏度也是AS-PCR 的10～100 倍（趙偉，2005），與本試驗結果基本一致。利用LAMP技術對多主棒孢Cytb基因G143A 突變也可進行有效檢測（Li et al.，2021），但與real-time PCR 相比，LAMP 需要設計多對引物（Prida et al.，2008），在反應過程中產(chǎn)生大量的擴增產(chǎn)物，極易造成交叉污染，定量研究時還需使用特殊儀器（如濁度儀），且易產(chǎn)生假陽性（Shi et al.，2020）。而real-time PCR 具有靈敏度高、特異性和可靠性強等特點，還能實現(xiàn)多重反應，自動化程度高，無污染，在定量檢測中發(fā)揮著重要的作用（Mori et al.，2001；歐陽松應 等，2014；李文學 等，2019）。

綜上，本試驗建立的real-time PCR 檢測技術體系能夠高效、靈敏、定量檢測多主棒孢SdhBH278Y 突變株在田間的發(fā)生，為黃瓜多主棒孢抗性治理提供科學的技術手段，以便及時有效開展黃瓜棒孢葉斑病抗藥性治理。