陳文雅(通信作者)，王明泉，高晶晶

泉州市第一醫(yī)院輸血科 (福建泉州 362000)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)特指由于母嬰之間的血型不合所引發(fā)的胎兒或新生兒紅細(xì)胞遭受破壞的一種免疫性溶血性疾病[1]，其主要臨床癥狀及體征為不同程度的黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大，嚴(yán)重者可繼發(fā)膽紅素腦病，即核黃疸。核黃疸的病死率達(dá)70%，即便患兒存活下來，也會(huì)遺留運(yùn)動(dòng)障礙、智力不全等后遺癥[2]。在過去幾十年中，得益于抗-D免疫球蛋白在RhD新生兒溶血病(RhD-HDN)免疫預(yù)防中的成功應(yīng)用，因RhD引發(fā)的妊娠期異體免疫發(fā)生率得到大幅度下降，HDN的模式也發(fā)生了轉(zhuǎn)變，ABO血型系統(tǒng)不合及其他非D型同種異型抗體已成為許多發(fā)達(dá)國家發(fā)生HDN的最主要原因[3]。中國作為發(fā)展中國家，以ABO血型系統(tǒng)不合(約占85.3%)最為常見，其次為Rh血型系統(tǒng)不合(約占14.6%)[4]。眾所周知，ABO新生兒溶血病(ABO-HDN)的臨床癥狀較輕，絕大多數(shù)患兒僅表現(xiàn)為黃疸，少數(shù)患兒可出現(xiàn)貧血、水腫等癥狀[5]；但也有文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道過因ABO-HDN引發(fā)較為嚴(yán)重的溶血病病例，部分患兒需采取換血治療，這也提醒我們，ABO-HDN并不總是輕癥，也需臨床多給予關(guān)注與重視。本研究通過分析我院收治的484例疑似ABO-HDN患兒的血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床病歷資料，旨在了解ABO-HDN的發(fā)生分布情況，探討該病的相關(guān)影響因素，以期為ABO-HDN的早期診斷提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2021年11月在我院順利分娩的484對符合條件的母嬰為研究對象。母親年齡17～46歲，平均(30.04±4.60)歲；患兒進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測時(shí)的日齡為10 h至36 d，平均(4.91±4.85)d；出生體質(zhì)量1 800～4 250 g，平均(3 190.46±438.49)g；其中，男患兒246例，女患兒238例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：母嬰ABO血型不合；母嬰RhD均為陽性；母親血型不規(guī)則抗體篩查結(jié)果呈陰性；母嬰雙方病歷資料均完整；單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕婦既往有輸血史；孕婦有自身免疫性溶血性疾病或其他溶血性疾?。恍律鷥夯加谐鼳BO-HDN之外的其他溶血性疾病。

1.2 儀器與試劑

所使用的儀器與試劑包括全自動(dòng)血型/配血系統(tǒng)分析儀、卡式離心機(jī)、ABO-Rh血型檢測卡、抗人球蛋白檢測卡、人ABO血型反定型用紅細(xì)胞測定試劑盒、紅細(xì)胞血型抗體篩選細(xì)胞，均由Diagnostic Grifols,S.A.配套提供；FYQ型試劑卡孵育器由長春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司提供，Baso微電腦控制血庫專用離心機(jī)由臺灣貝索生物技術(shù)有限公司提供，酸放散試劑盒由長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血型與不規(guī)則抗體篩查的檢測

ABO血型、Rh(D)血型及血型不規(guī)則抗體篩查均由Diana全自動(dòng)血型/配血系統(tǒng)分析儀進(jìn)行全自動(dòng)化檢測。

1.3.2溶血三項(xiàng)檢測

(1)直接抗人球蛋白試驗(yàn)：向抗人球蛋白檢測卡反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl患兒的紅細(xì)胞懸液(濃度為1%)，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。(2)游離抗體試驗(yàn)：向已標(biāo)記好的抗人球蛋白檢測卡各反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl血型抗體篩選紅細(xì)胞試劑、ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑，再向各反應(yīng)孔內(nèi)加入25 μl患兒血清，以37 ℃孵育15 min，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。(3)抗體放散試驗(yàn)：使用0.9%氯化鈉注射液洗滌患兒紅細(xì)胞3遍，最后1遍的洗滌液留取作為對照；嚴(yán)格按照酸放散試劑盒的使用說明書操作制備放散液，向已標(biāo)記好的抗人球蛋白檢測卡各反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μl血型抗體篩選紅細(xì)胞試劑、ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑，再向各反應(yīng)孔內(nèi)加入25 μl上述制備好的放散液和對照液，以37 ℃孵育15 min，最后離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結(jié)果。

1.4 ABO-HDN診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]

(1)母嬰之間存在ABO血型不合。(2)抗體放散試驗(yàn)為診斷ABO-HDN的金標(biāo)準(zhǔn)，只要抗體放散試驗(yàn)為陽性，即可診斷為ABO-HDN；抗體放散試驗(yàn)為陰性，而直接抗人球蛋白試驗(yàn)和(或)游離抗體試驗(yàn)為陽性，則為可疑ABO-HDN；三項(xiàng)檢測結(jié)果均為陰性，則不可診斷為ABO-HDN。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本率間的比較采用χ2檢驗(yàn)，單向有序R×2表資料的研究目的若為分析樣本率與等級分層變量之間是否存在線性變化趨勢，則采用線性趨勢卡方檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 484份溶血三項(xiàng)檢測結(jié)果

484份疑似ABO-HDN患兒的標(biāo)本，共檢測出陽性標(biāo)本321份，其中，305例被確診為ABO-HDN，其余16例被判定為可疑ABO-HDN；321份陽性標(biāo)本中，主要檢出組合為三項(xiàng)試驗(yàn)均陽性、游離抗體試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)雙陽性及抗體放散試驗(yàn)單陽性，占87.54%(281/321)；305例確診患兒中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗(yàn)檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗(yàn)檢出305例(占100%)，見表1。

表1 484份溶血三項(xiàng)檢測結(jié)果分布情況

2.2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN陽性率情況

母親為O型的患兒(O-A、O-B)ABO-HDN陽性率為72.88%(301/413)，母親為非O型的患兒(A-AB、A-B、B-A、B-AB)ABO-HDN陽性率為5.63%(4/71),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=117.558，P<0.05)；母親為O型、患兒為A型或B型的ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.809，P<0.05)，見表2。

表2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN發(fā)生分布情況

2.3 送檢日齡對ABO-HDN檢出率的影響

不同送檢日齡的ABO-HDN檢出率不完全相同(χ2=61.343，P<0.05)；而且，經(jīng)線性趨勢卡方檢驗(yàn)顯示，隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈線性下降趨勢(χ2=59.249，P<0.05)，見表3。

表3 不同送檢日齡分組的ABO-HDN檢出分布情況

2.4 患兒發(fā)生ABO-HDN的單因素分析

經(jīng)單因素分析顯示，ABO-HDN的發(fā)生可能受母親妊娠次數(shù)、患兒性別及出生體質(zhì)量的影響(P<0.05)；不受母親年齡的影響(P>0.05)，見表4。

表4 患兒發(fā)生ABO-HDN的單因素分析[例(%)]

2.5 患兒發(fā)生ABO-HDN的多因素分析

以單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素為自變量進(jìn)行賦值(見表5)，通過二項(xiàng)Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數(shù)≥2次、女患兒、出生體質(zhì)量≥3 000 g是ABO-HDN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表5 自變量賦值情況

表6 患兒發(fā)生ABO-HDN的多因素分析

3 討論

ABO-HDN的發(fā)生源于胎兒從父方遺傳到母方所缺乏的A型或B型抗原，導(dǎo)致母嬰ABO血型不合，一旦胎兒的紅細(xì)胞通過胎盤進(jìn)入到母體中，即有可能對母體形成免疫刺激，產(chǎn)生相應(yīng)的IgG抗體；IgG抗體作為唯一能通過胎盤的抗體類型，再借助胎盤反向進(jìn)入胎兒體內(nèi)，致敏胎兒紅細(xì)胞，并激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放大量溶酶體酶，破壞胎兒紅細(xì)胞，最后造成溶血[9]。ABO-HDN在胎兒時(shí)期溶血所產(chǎn)生的多余膽紅素可經(jīng)胎盤由母體代為清除，出生后溶血仍在繼續(xù)，但新生兒相對不成熟的肝臟系統(tǒng)無法清除過量的膽紅素，因而造成新生兒高膽紅素血癥，而皮膚黃染等征象一般于新生兒出生后2～3 d才逐漸顯現(xiàn)[10-11]。鑒于ABO-HDN的臨床表現(xiàn)相對滯后于其真實(shí)病情，為了避免因延遲診斷和治療給患兒健康造成損害，提升ABO-HDN的早期診斷能力尤為重要。

溶血三項(xiàng)檢測是目前國內(nèi)診斷ABO-HDN最主要的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果顯示，溶血三項(xiàng)檢測結(jié)果顯示，484例疑似ABO-HDN患兒中，305例被確診為ABO-HDN，確診率達(dá)63.02%(305/484)，與尹明偉等[12]報(bào)道的69.97%確診率相近。主要陽性檢出模式集中分布于三項(xiàng)試驗(yàn)均陽型、游離抗體試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)雙陽性及抗體放散試驗(yàn)單陽性這三種組合，占87.54%。在305例確診病例中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗(yàn)檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗(yàn)檢出305例(占100%)。可見，抗體放散試驗(yàn)的靈敏度最高，直接抗人球蛋白試驗(yàn)的靈敏度最低。直接抗人球蛋白試驗(yàn)與抗體放散試驗(yàn)均為檢測患兒紅細(xì)胞是否被IgG抗體致敏的試驗(yàn)，但由于在新生兒時(shí)期，機(jī)體ABO抗原表達(dá)量僅為成人的25%～50%，導(dǎo)致可結(jié)合于患兒紅細(xì)胞上的IgG抗體相對有限，因此易造成直接抗人球蛋白試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[13]；抗體放散試驗(yàn)則相當(dāng)于直接抗人球蛋白試驗(yàn)的放大試驗(yàn)，利用比直接抗人球蛋白試驗(yàn)多出幾百倍紅細(xì)胞的量，通過酸放散等方法將致敏于紅細(xì)胞上的IgG抗體洗脫下來，因而獲得含有高滴度IgG抗體的放散液，從而提升了試驗(yàn)的靈敏度[14]。當(dāng)然，有關(guān)ABO-HDN的診斷不能單純依靠溶血三項(xiàng)檢測，還需完善其他相關(guān)輔助性檢查，并結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合分析。有文獻(xiàn)指出[15]，網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)、臍帶血總膽素或早期總膽紅素(產(chǎn)后第6小時(shí))及產(chǎn)前母體IgG抗-A(B)滴度等有助于ABO-HDN的早期診斷。由于本研究為回顧性調(diào)查，在資料收集上有一定的局限性，故可出現(xiàn)部分檢查缺失、檢測時(shí)間不統(tǒng)一或檢測方法不一致等情況，導(dǎo)致未能綜合分析其他輔助檢查與溶血三項(xiàng)檢測相結(jié)合對ABO-HDN早期診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

通過對母親是否為O型的患兒進(jìn)行分組比較后我們發(fā)現(xiàn)，母親為O型的ABO-HDN陽性率高達(dá)72.88%，母親為非O型的ABO-HDN陽性率僅為5.63%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果說明，ABO-HDN高發(fā)于O型產(chǎn)婦所分娩的非O型新生兒；母嬰血型為O-A、O-B的患兒ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，顯然，B型患兒的陽性率高于A型患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果與Bel Hadj等[16]和陳陸飛等[17]的研究結(jié)果相一致，但與楊愛月等[18]和李彥美等[19]的研究結(jié)果不一致。有關(guān)A型、B型患兒ABO-HDN陽性率的比較，不同的研究得出的結(jié)果截然不同，筆者分析其原因可能與不同地區(qū)ABO血型的分布存在差異有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)送檢日齡為0～2 d時(shí)，ABO-HDN檢出率高達(dá)82.66%；但隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈逐步下降的趨勢。這主要考慮隨著產(chǎn)婦病情進(jìn)展，被致敏患兒的紅細(xì)胞不斷被機(jī)體識別破壞，游離于血漿中的IgG抗體也不斷被機(jī)體中的血型抗原物質(zhì)所中和消耗，從而導(dǎo)致檢出率逐步下降[20]。這也提示我們，應(yīng)盡快對可疑ABO-HDN患兒進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測，以免因假陰性結(jié)果而延誤治療；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)送檢日齡≥7 d時(shí)，仍有32.39%的檢出率，提示日齡超7 d的患兒依然有進(jìn)行檢測的意義，但也需警惕，其存在假陰性率較高的風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是，送檢日齡在一定程度上也受臨床醫(yī)師對疾病風(fēng)險(xiǎn)評估的影響，越是早期送檢，面臨的臨床預(yù)估風(fēng)險(xiǎn)往往越大，這也可能是早期送檢檢出率偏高的原因之一?；谌正g對ABO-HDN檢出率的影響，筆者提議，留取新生兒臍帶血樣本進(jìn)行血型鑒定和溶血三項(xiàng)檢測等檢測，不僅有助于ABO-HDN的早期診斷，而且可減少有創(chuàng)操作對患兒造成的損傷。早在2015年，意大利1份有關(guān)預(yù)防和治療HDN的建議書中就曾提出，對所有新生兒臍帶血樣本進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)檢測，若試驗(yàn)呈陽性，再進(jìn)行抗體放散試驗(yàn)檢測[21]。結(jié)合我國國情，對所有新生兒進(jìn)行普遍篩查顯然是不切實(shí)際的，但可通過制定ABO-HDN風(fēng)險(xiǎn)評估標(biāo)準(zhǔn)，針對達(dá)到中高風(fēng)險(xiǎn)的新生兒進(jìn)行常規(guī)篩查。

兩項(xiàng)Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數(shù)≥2次、女患兒、出生體質(zhì)量≥3 000 g是ABO-HDN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。由于自然界廣泛存在與A、B型抗原相類似的物質(zhì)(如植物、寄生蟲、細(xì)菌、傷寒疫苗、破傷風(fēng)及白喉類毒素等)，若母親在首次妊娠前接觸到這類物質(zhì)，即有可能免疫刺激母體，產(chǎn)生IgG抗-A(B)抗體，因此，ABO-HDN可發(fā)生于第一胎[22]，且伴隨著母親妊娠次數(shù)的增加，胎兒紅細(xì)胞再次進(jìn)入母體的概率也隨之增加；與初次免疫應(yīng)答不同的是，再次免疫應(yīng)答只要接觸到小劑量的抗原，便可快速產(chǎn)生大量且持續(xù)時(shí)間較長的IgG抗體，誘發(fā)ABO-HDN發(fā)生，因此，妊娠史可增加ABO-HDN的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[23]。有關(guān)出生體質(zhì)量對ABO-HDN發(fā)生的影響，考慮可能為出生體質(zhì)量≥3 000 g的患兒ABO血型抗原發(fā)育相對于出生體質(zhì)量<3 000 g的患兒成熟，這更有利于IgG抗-A(B)抗體致敏于紅細(xì)胞上，故而增加了發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[24]；至于女患兒更易發(fā)生ABO-HDN，考慮其原因可能與患兒雌激素水平有關(guān)；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[25]，雌激素有增強(qiáng)免疫反應(yīng)的作用。

綜上所述，溶血三項(xiàng)檢測對ABO-HDN的診斷具有重要價(jià)值；其中，抗體放散試驗(yàn)具有高靈敏度的特征。鑒于送檢日齡對ABO-HDN檢出率的影響，針對可疑ABO-HDN的患兒，應(yīng)盡早進(jìn)行溶血三項(xiàng)檢測，以免因漏診而延誤治療；同時(shí)，筆者也提倡，應(yīng)合理完善產(chǎn)前關(guān)于ABO-HDN的輔助性檢查，如夫婦血型鑒定、母體IgG抗-A(B)滴度及IgG亞型測定、母體外周血游離胎兒DNA(cff-DNA)血型基因檢測、胎兒大腦中動(dòng)脈峰值流速(MCA-PSV)多普勒檢測等，綜合考量產(chǎn)前檢測及相關(guān)危險(xiǎn)因素的影響，制定ABO-HDN風(fēng)險(xiǎn)評估標(biāo)準(zhǔn)[26, 27]。對達(dá)到中高風(fēng)險(xiǎn)的新生兒，應(yīng)留取臍帶血樣進(jìn)行血型鑒定、溶血三項(xiàng)檢測、網(wǎng)織紅計(jì)數(shù)和總膽紅素測定，以實(shí)現(xiàn)早診斷早治療，保障患兒生命健康。