朱玉婷，文 欣，向 俊,3，郭錦材，荊輝華，李 燦，陳同強(qiáng),5,

（1.三二〇一醫(yī)院藥學(xué)部，陜西 漢中 723000；2.湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410007；3.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長沙 410083；4.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410006；5.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

植物乳桿菌作為一類食源性微生物，因其安全性高，在工業(yè)、食品和醫(yī)藥等重要領(lǐng)域占有一席之地，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、制藥及化工生產(chǎn)等領(lǐng)域[1-4]。多糖一般由10 個(gè)（含）以上的單糖通過糖苷鍵縮聚而成。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，多糖已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。大量的藥理及臨床實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)多糖類化合物具有一定的藥理活性，且一般無毒副作用[5]。近年來，多種不同來源的產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌被研究者們分離出來，并進(jìn)行了大量的深入研究，與植物源多糖比較，植物乳桿菌胞外多糖具有自身獨(dú)特的理化特性，如高黏度、濃稠、剪切稀釋等[6-8]。

植物乳桿菌胞外多糖作為一類新型天然食品添加劑，可改善酸乳、低脂干酪等發(fā)酵乳制品的質(zhì)地、口感、風(fēng)味及穩(wěn)定性等，因此，無需添加其他添加劑即可提高發(fā)酵乳制品的黏度和組織狀態(tài)[9]。分析單糖組成是鑒定多糖結(jié)構(gòu)的重要環(huán)節(jié)之一，采用氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定糖類，主要問題是糖類本身的難以揮發(fā)性，需將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、遇熱不易分解的衍生物。已有研究將單糖轉(zhuǎn)化成糖腈乙酸酯衍生物，該方法具有制備過程簡便、試劑較易獲取等優(yōu)點(diǎn)，并且每種單糖均可獲得單一色譜峰。目前對植物乳桿菌胞外多糖的研究主要體現(xiàn)在粗多糖的提取方法及其抗氧化、抗腫瘤等藥理作用方面[10-11]，但關(guān)于植物乳桿菌胞外多糖純組分的結(jié)構(gòu)及藥理活性的文獻(xiàn)報(bào)道較為鮮見。本研究以自制酸菜中分離出的植物乳桿菌發(fā)酵液為原料，經(jīng)乙醇沉淀后得到粗多糖，再經(jīng)一系列處理，包括脫色、脫蛋白、柱色譜分離純化等過程最終得到2 種新的多糖組分，通過分析這2 種多糖化合物的單糖組成及研究其體外抗氧化活性，為植物乳桿菌胞外多糖的構(gòu)效關(guān)系研究及植物乳桿菌的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌，分離自湖南岳陽某農(nóng)家自制酸菜。

DEAE-52陰離子交換纖維素 英國Whatman公司；30%雙氧水 南京化學(xué)試劑股份有限公司；三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、醋酸鈉、醋酸 阿拉丁試劑（上海）有限公司；所有實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC2410氣相色譜儀 日本島津公司；UV-9000雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；LGJ-12N冷凍干燥機(jī) 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；透析袋（截留分子質(zhì)量3.5 kDa） 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；BS-100N自動部分收集器、BT100N數(shù)顯恒流泵 南北儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的制備

實(shí)驗(yàn)用植物乳桿菌經(jīng)連續(xù)2 代活化后，轉(zhuǎn)接至脫脂乳培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)20 h，然后加入三氯乙酸至其在發(fā)酵液中最終質(zhì)量濃度約為5.0 g/L。室溫?cái)嚢? h左右，4 ℃、5 000 r/min離心5 min除去發(fā)酵液中的細(xì)胞、蛋白等雜質(zhì)。取上清液，加入95%乙醇使得粗多糖溶液中乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置過夜，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集沉淀，冷凍真空干燥，得到粗多糖，命名為DZ。

1.3.2 DZ的分離純化

DZ采用Savag法除蛋白和H2O2法脫色素[11]后，濃縮樣液，再按1.3.1節(jié)方式醇沉2 次，將得到的沉淀溶解于水中，自來水流水透析24 h，真空冷凍干燥，待用。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)上述處理后的50 mg DZ置于20 mL醋酸鈉-醋酸（NaAc-HAc）緩沖鹽溶液（pH 5.2）中，溶脹過夜，過陰離子交換柱（DEAE-52，Cl-，2.5×90 cm）（填料纖維素陰離子交換劑DEAE-52先后經(jīng)0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl處理1 h，水洗至中性），先用NaAc-HAc緩沖鹽溶液（pH 5.0）平衡24 h，裝樣，依次采用含0、0.2 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽溶液（pH 5.2）作為流動相進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，以苯酚-硫酸法（490 nm）[12]隔管示蹤，以奇數(shù)管號為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，收集主峰部分，自來水流水透析24 h，真空冷凍干燥。

1.3.3 單糖組成分析

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的制備

分別稱取葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇（內(nèi)標(biāo)）各4.0 mg，加入5 mg鹽酸羥胺與0.2 mL吡啶，密封，于90 ℃烘箱中反應(yīng)30 min后，冷卻，加入0.2 mL醋酸酐，90 ℃繼續(xù)加熱反應(yīng)30 min，冷卻，加入1 mL水和1 mL氯仿萃取3 次，取氯仿層，減壓濃縮至干，殘?jiān)? mL氯仿復(fù)溶，混勻，即得標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物，待進(jìn)樣。

1.3.3.2 多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化

稱取經(jīng)分離純化后的多糖組分4.0 mg，加入肌醇（內(nèi)標(biāo)）4.0 mg，加入2 mL 2 moL/L三氟乙酸，90 ℃密閉水解10 h，減壓蒸干，加入1 mL甲醇再蒸干，重復(fù)3 次，以徹底除去多余三氟乙酸。之后處理與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物制備過程相同，處理后待進(jìn)樣。

1.3.3.3 GC條件

氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），OV-101石英毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm，0.33 μm）；程序升溫：160 ℃，保持4.0 min，以5 ℃/min升至190 ℃，保持4.0 min，然后以3 ℃/min升至210 ℃，保持15.0 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度210 ℃，進(jìn)樣模式：分流；分流比50∶1；FID溫度280 ℃。

采用內(nèi)標(biāo)法測定多糖樣品中單糖含量，計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.4 抗氧化活性測定

將分離純化后的多糖分別配制成質(zhì)量濃度為0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液，參照文獻(xiàn)[13-15]方法，測定植物乳桿菌胞外多糖組分對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除率，上述實(shí)驗(yàn)均采用VC作為陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DZ的提取

水的滲透能力較強(qiáng)，提取效率高，使用時(shí)安全且經(jīng)濟(jì)。用水作為溶劑來提取多糖，所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，沉淀提純多糖；但由于不同性質(zhì)或不同相對分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇體積分?jǐn)?shù)不同，它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級分離；還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對樣品中不同的多糖進(jìn)行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。本研究采用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液可以一次性將樣品中大部分多糖成分沉淀出來。

植物乳桿菌胞外多糖經(jīng)水提醇沉法處理后得到粗多糖DZ，經(jīng)改良苯酚-硫酸法測定，DZ總糖含量約為70.2%。采用乙醇進(jìn)行沉淀時(shí)，需緩慢加入乙醇，同時(shí)邊加邊攪拌，整體溶液pH值需保持近中性，以避免產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，影響多糖的提取效果。

2.2 DZ的分離純化

除蛋白質(zhì)時(shí)一般選擇能使蛋白質(zhì)沉淀而不使多糖沉淀的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但需處理時(shí)間短、溫度低，避免多糖降解。Sevag法（氯仿、戊醇/丁醇體積比4∶1）在避免多糖降解方面有較好效果。

粗多糖需要采用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行跟蹤檢測，直至完成蛋白去除。脫蛋白后的多糖中含有大量色素，需采用雙氧水進(jìn)行脫色處理，需要注意的是，因雙氧水具有較強(qiáng)氧化性，因此用量不宜過大，否則可能會氧化導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，本研究通過優(yōu)化最終采用體積分?jǐn)?shù)20%雙氧水進(jìn)行脫色。

DZ經(jīng)過脫蛋白、色素等處理后，再經(jīng)DEAE-52 Cl-離子交換柱色譜分離，含0.2 mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖鹽溶液（pH 5.0）為流動相洗脫得到DZ-1和DZ-2 2 個(gè)多糖組分，如圖1所示，2 個(gè)多糖組分經(jīng)柱層析分離流出，采集峰形，譜圖基本呈單一對稱，可推測2 個(gè)多糖組分純度較高。

圖1 DZ的陰離子交換纖維素柱色譜洗脫圖Fig.1 Elution curve of the crude polysaccharides from anion exchange cellulose column

2.3 DZ-1與DZ-2的單糖組成分析

采用內(nèi)標(biāo)法測定多糖樣品中單糖含量并計(jì)算其含量百分比。由圖2可知，6 種單糖完全分離且均呈現(xiàn)單一對稱峰。由圖3可知，DZ-1為由葡萄糖組成的均多糖。由圖4可知，DZ-2為由阿拉伯糖、半乳糖組成的雜多糖，通過計(jì)算得到DZ-2的單糖組成及百分比含量比值為阿拉伯糖∶半乳糖=46.03∶53.89。

圖2 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖Fig.2 GC chromatogram of a standard mixture of monosaccharides

圖3 DZ-1的GC圖Fig.3 GC chromatogram of DZ-1

圖4 DZ-2的GC圖Fig.4 GC chromatogram of DZ-2

2.4 DZ-1與DZ-2的抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基作為一類穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基，可接受電子或氫自由基生成穩(wěn)定的分子[16]。DPPH自由基清除率時(shí)常在體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中被用于評價(jià)天然化合物的抗氧化活性[17]。由圖5可知，DZ-1與DZ-2對DPPH自由基的清除能力均表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。其中，DZ-2對DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為0.25 mg/mL，VC對DPPH自由基的IC50為0.04 mg/mL。DPPH自由基清除率在DZ-1與DZ-2質(zhì)量濃度為0～1.0 mg/mL時(shí)均呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)DZ-1與DZ-2質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，二者清除率達(dá)到最大值，分別為45.63%與62.11%，而陽性對照組VC對DPPH自由基的清除率則高達(dá)97.80%。

圖5 DZ-1與DZ-2的DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2

2.4.2 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

作為一類反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，羥自由基的破壞性極強(qiáng)，能輕易穿透細(xì)胞膜，與其中多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，從而造成組織損傷或細(xì)胞凋亡。因此，清除羥自由基對保護(hù)生物系統(tǒng)具有極為重要的作用[18-22]。由圖6可知，DZ-1與DZ-2對羥自由基的清除能力均表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。其中，DZ-2對羥自由基的IC50為0.30 mg/mL，VC對羥自由基的IC50為0.04 mg/mL。當(dāng)DZ-1與DZ-2質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL后，羥自由基清除率的增長速率均趨于平緩，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，DZ-1與DZ-2的羥自由基清除率分別達(dá)到最大值43.05%、62.98%。

圖6 DZ-1與DZ-2的羥自由基清除效果Fig.6 Hydroxyl radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2

2.4.3 ABTS陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)

ABTS陽離子自由基測定法也是一種評價(jià)天然化合物抗氧化能力的方法。多糖向不穩(wěn)定的ABTS陽離子自由基提供一個(gè)電子和氫原子以形成穩(wěn)定的ABTS自由基[23-27]。由圖7可知，DZ-1與DZ-2對ABTS陽離子自由基的清除能力均表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。其中，DZ-2對ABTS陽離子自由基的IC50為0.31 mg/mL，VC對ABTS陽離子自由基的IC50為0.05 mg/mL。DZ-1與DZ-2質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)，ABTS陽離子自由基清除率最大，分別為42.01%與61.47%。

圖7 DZ-1與DZ-2的ABTS陽離子自由基清除效果Fig.7 ABTS cation radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2

大量研究報(bào)道已證實(shí)多糖具有一定的體外抗氧化作用[28-30]，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，DZ-1與DZ-2 2 種植物乳桿菌胞外多糖均具備一定的自由基清除能力，且DZ-2總體抗氧化活性強(qiáng)于DZ-1。造成這種差異性的可能原因?yàn)镈Z-2結(jié)構(gòu)中含有更多帶電荷基團(tuán)，如糖醛酸、硫酸基等。至于植物乳桿菌胞外多糖抗氧化機(jī)理與多糖結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

通過對植物乳桿菌胞外多糖采用水提醇沉方法得到粗多糖，粗多糖先后經(jīng)除蛋白、脫色等處理后，再經(jīng)陰離子DE-52交換柱色譜分離純化最終得到DZ-1與DZ-2多糖組分，采用柱前衍生-GC法分析DZ-1與DZ-2中單糖的組成，DZ-1為由葡萄糖組成的均多糖，DZ-2則為由阿拉伯糖、半乳糖組成的雜多糖，其單糖組成及百分比含量比值為阿拉伯糖∶半乳糖=46.03∶53.89。體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，DZ-1與DZ-2均具有一定的自由基清除能力，且DZ-2的抗氧化活性強(qiáng)于DZ-1，該結(jié)論表明植物乳桿菌胞外多糖具備被開發(fā)成天然抗氧化劑的前景，同時(shí)為植物乳桿菌在醫(yī)學(xué)、化妝品及食品工業(yè)等領(lǐng)域的開發(fā)與利用提供參考。