丁奕如，張超穎，謝賀新

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海市新藥設(shè)計重點實驗室,上海 200237）

腎臟是人體新陳代謝過程的重要器官，通過過濾血液生成尿液排泄、清除代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)血容量，維持電解質(zhì)和酸堿平衡，從而保證機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［1，2］.腎小球是血液和尿路之間的過濾屏障，對于成年人而言，每天約有180 L的血液流經(jīng)腎臟，隨后通過腎小球的濾過作用和腎小管的重吸收作用產(chǎn)生尿液［3，4］.

急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是一種臨床常見的急性腎臟疾病.急性腎損傷臨床表現(xiàn)主要為腎功能迅速下降或喪失，其主要特征有血液中廢物溶質(zhì)（如尿素和肌酐）水平升高、少尿及電解質(zhì)紊亂［5］.根據(jù)全球權(quán)威腎臟醫(yī)學(xué)組織KDIGO（Kidney Disease：Improving Global Outcomes）共識定義，48 h內(nèi)血清肌酐升高至26.5 mmol/L，或在7 d內(nèi)升高至基線的1.5倍，或尿量少于0.5 mL·kg-1·h-1持續(xù)6 h，即可定義為急性腎損傷.

通常，急性腎損傷的病因是多因素的，其中膿毒癥、休克和腎毒性占據(jù)了大多數(shù)［6］.急性腎損傷的發(fā)病率在所有住院患者中為1%～7%，在重癥監(jiān)護病房（ICU）患者中高達30%～50%，并且伴有非常高的死亡率（約50%）.全球每年約有170萬人的死亡與急性腎損傷密切相關(guān)，并且在存活患者中容易發(fā)展成慢性腎臟病（約20%）或是終末期腎臟病（約5%）［7］.同時，急性腎損傷也經(jīng)常作為其它綜合征（如心衰、肝功能衰竭和膿毒癥等）的一部分出現(xiàn)，而這些綜合征本身也會導(dǎo)致大量的發(fā)病率和死亡率.

在腎功能受損的情況下，對腎功能的準(zhǔn)確評估對于早期發(fā)現(xiàn)腎功能衰竭、評估干預(yù)措施和監(jiān)測腎功能變化至關(guān)重要［8］.盡管在過去的近100年里，診斷技術(shù)已經(jīng)取得了長足的進展，但腎臟疾病的早期診斷與發(fā)現(xiàn)仍然非常具有挑戰(zhàn)性，特別是在重癥監(jiān)護病房中的易發(fā)患者中.血清肌酐和尿量是診斷急性腎損傷的非常有效的手段，但這兩項指標(biāo)都是腎臟損傷的較晚期標(biāo)志，血清肌酐還會受到年齡、性別、飲食和藥物等的影響.此外，腎臟的功能狀態(tài)也可以通過腎小球濾過率、腎血流量和腎小管重吸收或各種化合物的分泌來評估.其中，腎小球濾過率（Glomerular filtration rate，GFR，即在單位時間內(nèi)腎產(chǎn)生的濾液量）一直以來都被認為是評估腎功能的最佳指標(biāo)［9］.然而，GFR難以進行直接測定，因此通常應(yīng)用特定標(biāo)志物的腎臟清除率來進行推測.一種物質(zhì)的腎臟清除率被定義為每單位濃度從血漿中清除該物質(zhì)的速率［10］，不同的標(biāo)志物通常具有不同的GFR計算方法.

早期的GFR標(biāo)志物主要是內(nèi)源性標(biāo)志物，包括血清肌酐（Scr）［11，12］、尿素（Urea）［13］、β2-微球蛋白（β2-M）［14，15］、β-痕跡蛋白（BTP）［16］以及血清胱抑素C（Cystatin C，CysC）［17，18］，然而這些內(nèi)源性標(biāo)志物的檢測通常操作方法繁瑣、準(zhǔn)確性偏低［19，20］.另外，內(nèi)源性標(biāo)志物不可避免地受到個體差異的影響［21］，并且這些標(biāo)志物大部分是蛋白質(zhì).對這些標(biāo)志物進行高靈敏度和準(zhǔn)確度的檢測通常依賴于復(fù)雜、精密的儀器設(shè)備，而且一般操作耗時和成本昂貴.迄今為止，尚未尋找到完美的內(nèi)源性標(biāo)志物，也仍未開發(fā)出精確和可靠的估計方法.

Fig.1 Structures of exogenous tracers for GFR

為了克服上述內(nèi)源性標(biāo)志物的問題，研究人員開始將目光轉(zhuǎn)向GFR外源性標(biāo)志物的開發(fā).外源性標(biāo)志物幾乎不受個體因素的影響，具有更高的個體間重現(xiàn)性.目前常用的外源性標(biāo)志物主要有菊粉（Inulin）［9］、碘酞酸鹽（Iothalamate）［22］和碘海醇（Iohexol）［23～25］等（圖1）.這些標(biāo)志物可以用于檢測其在血漿中的清除率，但一般需要應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）或X射線熒光法（X-ray fluorescence）進行檢測，并且需要費時費力多次采集血液和尿液樣本，難以適合在臨床環(huán)境中進行GFR的連續(xù)監(jiān)測［20，26，27］.為了解決這些問題，放射性的外源性GFR標(biāo)志物［如51Cr-EDTA（EDTA=乙二胺四乙酸）［28］，99mTc-DTPA（DTPA=二乙基三胺五乙酸）［29］等］也被開發(fā)出來.應(yīng)用這些放射性的試劑在監(jiān)測GFR中準(zhǔn)確性更高，并可實現(xiàn)連續(xù)檢測.然而這個過程中需要使用到價格昂貴的儀器設(shè)備，且監(jiān)測對象需較長時間暴露在輻射中，很大程度上也限制了這些放射性標(biāo)志物的臨床應(yīng)用［30］.

分子熒光探針的成像技術(shù)作為一種操作簡便、靈敏度高的非侵入性檢測方法，其在活體成像研究、臨床疾病診斷等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景.近年來，一系列基于熒光技術(shù)的GFR示蹤劑被設(shè)計、發(fā)展出來.同時，為了配合這些熒光示蹤劑的應(yīng)用，各種類型的檢測儀器也陸續(xù)被開發(fā)出來，這些新型示蹤分子和檢測儀器在急性腎損傷的臨床檢測與診斷應(yīng)用中取得了重要的進展［31］.研究表明，外源性GFR熒光示蹤劑的消除率可以在相關(guān)檢測儀器的幫助下通過皮膚實現(xiàn)實時、無創(chuàng)的監(jiān)測.與傳統(tǒng)的方法相比，這一方法有效避免了頻繁抽血和后續(xù)實驗分析，顯著提升了GFR監(jiān)測的效率與操作的便捷性.基于GFR熒光示蹤劑的分子結(jié)構(gòu)，本文對其相關(guān)研究進行了歸納和總結(jié)，重點介紹了其設(shè)計策略以及臨床應(yīng)用的最新進展.同時，對相應(yīng)的檢測儀器開發(fā)進行了簡單介紹，并展望了這些基于GFR熒光示蹤劑的檢測技術(shù)引入臨床實踐的發(fā)展前景.

1 外源性腎小球濾過率熒光示蹤劑的設(shè)計策略

作為應(yīng)用于腎功能實時監(jiān)測的外源性GFR熒光示蹤劑，一般情況下需要滿足如下基本條件：（1）高生物兼容性，即在使用劑量范圍內(nèi)對檢測對象沒有危害性；（2）高穩(wěn)定性，除腎清除外無其它代謝途徑；（3）低血漿蛋白結(jié)合性和體內(nèi)組織攝取性及高尿液回收率；（4）高度親水性并在腎小球處自由濾過；（5）不被腎小管重吸收、分泌、合成或代謝［20］；（6）具有較長的熒光的激發(fā)與發(fā)射波長及較高的熒光量子產(chǎn)率，使激發(fā)光與熒光信號能夠有效穿透身體組織，確保其檢測靈敏度.

為了滿足這些要求，目前GFR熒光示蹤劑在設(shè)計上主要采用以下兩種策略：（1）直接利用高親水性的小分子熒光化合物作為GFR示蹤劑；（2）基于親水性多糖大分子化合物與常見的非親水性熒光染料共價鍵連接，構(gòu)造可腎臟清除的大分子熒光GFR示蹤劑.基于高親水性小分子熒光化合物的GFR示蹤劑具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在后續(xù)合成生產(chǎn)中的品質(zhì)監(jiān)控相對更容易.但是，這類示蹤劑的吸收和發(fā)射波長相對較短，易于受到活體自發(fā)熒光信號以及穿透率的影響.相反，基于親水性多糖大分子化合物的示蹤劑，由于采用了與現(xiàn)有熒光染料共價鍵連接的方式來構(gòu)建，因此可以采用吸收和發(fā)射波長以及熒光量子產(chǎn)率都較為理想的熒光染料，能夠有效克服自發(fā)熒光及熒光穿透率的影響.然而，這類示蹤劑一般采用具有一定分散性的多糖化合物，而非單一結(jié)構(gòu)的化合物，因此其結(jié)構(gòu)存在一定的不確定性.

目前，基于這兩種策略發(fā)展的熒光示蹤劑的吸收和發(fā)射波長一般都在可見光區(qū)域，一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)快速、動態(tài)和準(zhǔn)確地測量腎臟清除率，均展現(xiàn)出了較好的臨床應(yīng)用前景.

2 小分子腎小球濾過率熒光示蹤劑

基于小分子熒光化合物的GFR熒光示蹤劑具有結(jié)構(gòu)明確、易于獲取的特點.目前作為外源性GFR小分子熒光示蹤劑的主要是吡嗪類化合物.吡嗪及其衍生物通常具有較高的熒光量子產(chǎn)率、優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等特性.通過在吡嗪2位和5位引入吸電子基團，在3位和6位引入給電子基團（如3，6-二二甲氨基-2，5-氰基吡嗪，1）［圖2（A）］，可使其在最大吸收與發(fā)射波長均在可見光范圍，斯托克斯位移接近100 nm，熒光量子產(chǎn)率約為0.4［32］.2011年，Rajagopalan等［33］首次將吡嗪衍生物應(yīng)用于熒光腎小球濾過率示蹤劑的設(shè)計.他們以二羧酸吡嗪為母核結(jié)構(gòu)，通過在其2位和5位引入一系列具有親水性的取代基團，設(shè)計、合成了10種化合物，并從血漿蛋白結(jié)合率、血漿清除率、尿液中回收注射劑量百分比（%ID）及腎小管分泌等方面對這些化合物進行了篩選，最終篩選出3個較為理想的候選化合物2a（MB-102），2b和2c［圖2（A）］.在進一步的大鼠模型實驗中，發(fā)現(xiàn)化合物2b具有與臨床GFR測量的“金標(biāo)準(zhǔn)”碘酞酸鹽基本相當(dāng)?shù)难獫{清除率和更高的尿液中的回收率［圖2（B）］.

在此基礎(chǔ)上，他們進一步在吡嗪母核中引入高親水性的聚乙二醇（PEG）鏈作為取代基團.經(jīng)過系列篩選，發(fā)現(xiàn)化合物2d（PP-2338）和2e具有非常低的血漿蛋白結(jié)合，并且在大鼠模型實驗中呈現(xiàn)出了與碘酞酸鹽基本相當(dāng)?shù)难獫{清除率和尿液回收率以及更快的半衰期（2d：25 minvs.碘酞酸鹽：32 min）［34］.

Fig.2 Structures of pyrazine-based GFR tracer agents(A)and in vivo time-dependent fluorescence detection of 2b(B)[33]

為了進一步評估化合物2d（PP-2338）在GFR實時監(jiān)測中的作用［35］，他們通過將大鼠5/6腎切除的方式構(gòu)建了急性腎損傷模型（圖3）.研究發(fā)現(xiàn)，與對照組健康大鼠相比，化合物2d在急性腎損傷大鼠中的透皮熒光信號降低的速率要慢得多，其熒光信號清除的半衰期由對照組的25 min增加至85 min.這一結(jié)果表明了大鼠熒光信號變化的速率與其腎清除率具有高度相關(guān)性，并且首次確定這類化合物在透皮熒光檢測中的潛力.

需要特別指出的是，為了更簡化大鼠熒光信號的收集，他們構(gòu)建了一套專門的檢測裝置［35］（圖3）.該裝置主要包括一個激光發(fā)生器（作為激發(fā)光源）與一個感光模組（作為熒光信號收集器）.將該裝置與相應(yīng)的計算機相連即可實現(xiàn)在小型動物中熒光信號的采集與分析.在成像過程中，將相關(guān)檢測探頭置于血管分布較為密集的大鼠耳部即可實現(xiàn)熒光信號的實時非侵入性檢測.這與一般的采血或采尿檢測實驗相比在操作便捷性上具有明顯的優(yōu)勢.

Fig.3 Data acquisition system designed for 2d(PP-2338)(A)and representative elimination curves of 2d measured optically in anesthetized 5/6 nephrectomized and sham rats 7 d post injury(B)[35]

與此同時，Dorshow等［36，37］對先前篩選出的候選化合物2a（MB-102）也進行了更深入的研究.通過對MB-102在嚙齒動物、比格犬等動物的體內(nèi)安全性和毒性實驗研究，證明了MB-102是一種具有高度生物安全性的GFR示蹤劑候選化合物.通過對符合生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下生產(chǎn)的MB-102進行分析，發(fā)現(xiàn)這一化合物具有高化學(xué)穩(wěn)定性，在2～8℃下可以保持3年以上不發(fā)生變化［38］.此外，研究發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典GFR示蹤劑碘海醇相比，MB-102具有更低的血漿蛋白結(jié)合率（MB-102：4.1%；碘海醇：6%），同時，MB-102固有的光物理特性為GFR的實時、定量測定提供了一種可靠的方法.

基于MB-102的首次人體臨床研究于2017年被報道［39］，研究人員搭建了一套經(jīng)皮熒光測量儀，從而可以實現(xiàn)對血液中的MB-102熒光信號進行實時、非侵入性的測量.同時對測試人員身體的4個部位［前額、胸骨、內(nèi)側(cè)上部手臂和外側(cè)下胸腔（代表軀干）］進行實時監(jiān)測.觀察到MB-102進入測量區(qū)域的平衡動力學(xué)會因身體的測量位置不同而發(fā)生變化［圖4（A）和（B）］.此外，由于運動和組織光學(xué)特性的變化，研究中也會觀察到部分信號偽影.基于這些現(xiàn)象，研究人員進一步構(gòu)建了一個電子模型［圖4（C）］，以解釋觀察到的臨床測試結(jié)果，并完善了儀器設(shè)計［40］.總體而言，8名腎功能正常且膚色不同的測試人員的測試結(jié)果顯示，相關(guān)數(shù)據(jù)與模擬數(shù)據(jù)具有較好的一致性.

Fig.4 An example of clinical measurements of MB-102 for a single subject(A),measurements simulated by the model(B)[39]and a schematic of instrument developed to perform the transcutaneous fluorescence measurements(C)[40]

目前，MB-102已經(jīng)在20多項正式的毒理學(xué)、安全性和藥理學(xué)研究中［37］進行了性能評估.并且在人體測試中顯示，靜脈注射MB-102后可以利用直接放置在皮膚上的光電探測模塊經(jīng)皮檢測MB-102的實時熒光信號.這些結(jié)果均表明，MB-102有望為GFR的定量分析提供一種可靠的方法.目前，MB-102正由MediBeacon公司進行開發(fā)，進行Ⅲ期臨床實驗研究.此化合物有望成為第一個真正在臨床應(yīng)用的實時GFR監(jiān)測示蹤劑.

3 基于大分子多聚糖的腎小球濾過率熒光示蹤劑

作為應(yīng)用于活體內(nèi)熒光實時成像的試劑，GFR示蹤劑對其激發(fā)/發(fā)射波長、熒光量子產(chǎn)率等都提出了較高的要求.然而，常用的具有較為理想光物理性質(zhì)的有機熒光染料，由于一般都具有較高的親脂性而難以有效通過腎小球濾過.為了能夠?qū)⑦@類高效熒光染料應(yīng)用在GFR示蹤劑中，研究人員通常采用將其與高親水性的大分子多聚糖化合物共價鍵結(jié)合的方式構(gòu)建GFR示蹤劑.由于熒光染料分子相對大分子多聚糖要小得多，因此這些染料分子的引入對多聚糖本身的腎小球濾過率影響甚微.基于這種策略構(gòu)建的示蹤劑同時具有高熒光量子產(chǎn)率和GFR示蹤劑所必須的高腎小球透過率，在近年來受到了廣泛關(guān)注.應(yīng)用在這一類型GFR示蹤劑中的大分子多糖化合物主要包括菊粉、葡聚糖（Dextran）、海蔥糖（Sinistrin）以及環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）等（圖5）.這些多糖分子在GFR示蹤劑應(yīng)用研究中各有特點，并且其結(jié)構(gòu)也可用于其它官能團的進一步修飾.

Fig.5 Structures of glycan-based GFR tracer agents

3.1 基于菊粉的腎小球濾過率熒光示蹤劑

菊粉是一種分子量為3000～5000左右的惰性果糖聚合物，它可以被腎小球自由過濾，同時既不被腎小管上皮細胞分泌也不被再吸收，滿足外源性標(biāo)志物的所有標(biāo)準(zhǔn)，是一種較為理想的GFR外源性標(biāo)志物［41］.因此，菊粉清除率長時間以來被公認為是GFR定量的標(biāo)準(zhǔn).菊粉的清除率被定義為每分鐘為尿液中菊粉的排出所需的血漿體積［42］.早期，菊粉單獨作為外源性標(biāo)志物被用來檢測腎功能，一般通過分光光度法和熒光法進行定量［43］.但這一方法一般需要較高的血漿菊粉濃度，以至于最終尿液中的菊粉濃度會產(chǎn)生一定的滲透效應(yīng)，同時也進一步加重了腎的負擔(dān).

為了便于菊粉的檢測，早在1983年，Ulfendahl等［44］即首次利用常用的熒光染料異硫氰酸熒光素（FITC）對菊粉進行共價鍵標(biāo)記，構(gòu)建了FITC-菊粉.FITC在菊粉中的分子取代度約為0.001，即每1000個單糖中約連接1個FITC分子.在低取代度的情況下，F(xiàn)ITC的引入對菊粉本身的生物活性影響被降至最低.FITC本身具有明亮的綠色熒光，這一熒光基團在菊粉中的引入極大地簡化了在復(fù)雜環(huán)境中對菊粉的測定.利用FITC-菊粉作為標(biāo)志物，研究人員測定了腎小管液血漿濃度比（TF/P），這個比值與腎小管功能長度密切相關(guān).為了研究FITC-菊粉作為衡量腎小球濾過標(biāo)志物的有效性，在研究中以51Cr-EDTA和氚代菊粉作為對照進行了清除率和TF/P測試實驗.結(jié)果顯示，基于FITC-菊粉的檢測方法與這兩種方法具有良好的一致性，證明了FITC-菊粉作為GFR檢測工具的有效性.然而這種基于FITC-菊粉的方法在消耗大量樣本的同時，也同樣要求維持較高水平的血漿菊粉濃度，因此這一示蹤劑在應(yīng)用中依然受到了較大的限制.考慮到這些問題，1999年，Lorenz等［45］利用FITC-菊粉通過微穿刺的方式研究評估單腎單元腎小球濾過率（SNGFR）和小管液再吸收情況.這種方法只需要較低水平的血漿菊粉-FITC濃度，而且分析過程中不會消耗液體樣本，因此檢測效率得到了較大的提高.

2004年，為了探尋簡單、便捷的方式對清醒小鼠的腎臟功能進行檢測，Breyer等［46］利用FITC-菊粉，分別用兩種方式對清醒小鼠體內(nèi)GFR進行了測定.一種方法是通過血漿FITC-菊粉的清除動力學(xué)來測量GFR，這種方式的主要優(yōu)點是不需要定時收集尿液或進行手術(shù)，能夠提供高重復(fù)性結(jié)果，但是反復(fù)采血本身也會給動物造成生存壓力.另一種是通過腹腔內(nèi)的微滲透泵持續(xù)給藥FITC-菊粉，再利用代謝籠收集尿液來測量FITC-菊粉的清除量，以此來測定其尿清除率.這種方法可避免多次血液采樣，但需要小鼠尿液的定時采集.這兩種方法各有優(yōu)缺點，但這一研究本身首次證明了利用FITC-菊粉檢測清醒小鼠GFR的可行性.

2013年，Rieg等［47］基于FITC-菊粉報道了一種高通量測試有意識小鼠GFR的方法.這種方法通過應(yīng)用雙室模型，根據(jù)特定流程，只需通過剪尾采血得到的1～2μL的稀釋血漿來測定其熒光，每天可以測量多達24只小鼠的GFR.該方法中所有的血液樣本都可以在清醒小鼠體內(nèi)采集，且只需要短暫的異氟烷麻醉.剪尾采血使得操作更方便快捷，同時，這種方式的另一個優(yōu)勢是，它可以在長達幾個月的時間內(nèi)持續(xù)跟蹤治療，通過飲食變化或藥物應(yīng)用進行配對協(xié)同實驗.

然而，基于單一波長的熒光強度測量容易受到各種實驗條件的影響從而造成偏差，如激發(fā)光源的波動、成像設(shè)備的不均勻性和不同成像深度的強度衰減等.為了克服這一問題，Yu等［48］發(fā)展了一種比率熒光測量法，利用活體熒光顯微鏡快速評估嚙齒模型動物的腎功能.他們將FITC-菊粉和德克薩斯紅-葡聚糖混合試劑經(jīng)皮注入血液.在這兩種試劑中，發(fā)出綠色熒光信號的FITC-菊粉由于分子量較?。?000～5000），可以自由透過腎小管，而發(fā)出紅色熒光信號的德克薩斯紅-葡聚糖由于分子量較大（500000）而不能被腎臟過濾，因此被限制在血管內(nèi).通過測量腎臟中綠色與紅色熒光強度比率即可實現(xiàn)對GFR效率的快速評估，在量化腎功能方面具有更高的準(zhǔn)確度.

在此基礎(chǔ)上，他們進一步利用FITC-菊粉和德克薩斯紅-葡聚糖混合試劑對急性腎損傷模型大鼠進行了研究［49］.他們將混合試劑對小鼠進行快速輸注，并對其腎臟進行熒光成像.從圖6（A）可以看出，毛細血管的紅色熒光通道的整體信號強度相對穩(wěn)定，而毛細血管的綠色熒光通道的信號強度急劇下降，表明綠色熒光標(biāo)記的菊糖從血管間隙中代謝消失.經(jīng)過研究獲得了0.17～1.12 mL·min-1·100 g-1范圍的全譜GFR值，與標(biāo)準(zhǔn)菊粉清除分析得到的GFR值有很好的相關(guān)性.該課題組［50］還通過測定45 min缺血模型后24 h內(nèi)多個時間點的GFR值，首次分析了腎臟缺血對腎功能的早期影響.研究發(fā)現(xiàn)，利用這種混合示蹤劑再結(jié)合活體熒光比率雙熒光通道腎臟成像和兩室藥代動力學(xué)模型，可以對正常和急性腎損傷模型大鼠實現(xiàn)GFR的快速量化.

為了將這一雙熒光通道技術(shù)應(yīng)用于臨床，Wang等［50］進一步開發(fā)了能夠產(chǎn)生及傳遞兩個激發(fā)源，并對相應(yīng)的發(fā)射進行檢測量化的比率型光纖系統(tǒng)［圖6（B）］，可分別為FITC和德克薩斯紅熒光標(biāo)記物提供激發(fā)光源.經(jīng)過特定的激發(fā)濾光片后，兩束近準(zhǔn)直的光束在反射藍色并發(fā)射琥珀色的激發(fā)二向色鏡處合并，混合熒光信號通過反射激發(fā)波長的同一雙頻分束器.他們將可傳遞激發(fā)光并收集熒光發(fā)射的亞毫米光纖通過商業(yè)靜脈導(dǎo)管插入動物模型的外周靜脈或中心靜脈通路.混合注入分子量較小的腎自由過濾分子FITC-菊粉和腎不可過濾的德克薩斯紅-葡聚糖，在被發(fā)光二極管激發(fā)后，光電倍增管檢測和量化體內(nèi)信號.該比率測定技術(shù)既可以檢測血漿血管體積，又能高精度地實時測定GFR.這種獨特的定量熒光方法的原理可以擴展應(yīng)用到其它器官或其它過程的實時監(jiān)測中，從而提高準(zhǔn)確性.然而，考慮到混合試劑中含有的排泄半衰期接近無窮大的分子帶來的潛在毒性，這種檢測策略在臨床應(yīng)用上受到了極大的限制.

另一種經(jīng)皮測量技術(shù)是Luyt等［51］研發(fā)的經(jīng)皮脈搏染料密度計（TPDD）.他們將開發(fā)的一種近紅外染料（Cy7.5）標(biāo)記的菊粉作為光學(xué)探針，在血氧儀中實時計算染料在動脈中的濃度，以非侵入性的方式測量活體的GFR.近紅外熒光染料的應(yīng)用有助于提升熒光穿透率，更利于檢測深層組織的熒光信號.利用這一方法，目前已成功實現(xiàn)模型豬的無創(chuàng)GFR測量.

目前，在外源性標(biāo)志物中，菊粉本身既不被腎小管重吸收也不分泌的特點使其依舊作為金標(biāo)準(zhǔn)而被廣泛認可.而FITC-菊粉作為GFR熒光示蹤劑在研究中也取得了一定的進展.然而，F(xiàn)ITC-菊粉的一些不利因素長久以來一直困擾著研究人員.如其水溶性較差，使用前通常需要高溫加熱促進其溶解，并且其熒光染料FITC發(fā)射波長較短，穿透性有限，在部分活體成像中依然需要使用侵入性的方式進行.基于這些原因，目前各種替代策略也在開發(fā)研究之中.

Fig.6 Two-photon images from a living rat infused a mixture of Texas red-dextran(red)and FITC-inulin(green)(A)[49]and design of the ratiometric optical fiber system(B)

3.2 基于海蔥糖的腎小球濾過率熒光示蹤劑

海蔥糖（Sinistrin）是一種由果糖單位（97%）和葡萄糖單位（約3%）組成的支鏈多聚果糖，分子量范圍在2000～6000之間，平均分子量為3500.由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在側(cè)鏈而增加了水溶性，使其在應(yīng)用中更容易處理，并且海蔥糖的聚合度、相對分子質(zhì)量和流體動力學(xué)研究結(jié)果表明，其通過腎小球基底膜的滲透性比較好.因此，作為一種極具潛力的菊粉替代品，海蔥糖在1963年首次被引入作為腎臟標(biāo)志物［52］.

2005年，為了克服FITC-菊粉水溶性較差、使用前需提前加熱促溶解的問題，Pill等［53］首次將FITC與海蔥糖共價鍵連接合成得到了FITC-海蔥糖，其分子取代度約為0.08，即每100個單糖中約連接8個FITC分子.初步研究發(fā)現(xiàn)，利用FITC-海蔥糖可使用常規(guī)熒光計檢測其隨時間變化的血漿清除率，并且基于這一試劑測定GFR的方法耐受性好、準(zhǔn)確度高及相對易于操作，這些特點使得FITC-海蔥糖成為一種極具潛力的GFR示蹤劑.

為了簡化活體中GFR的測定，Schock-Kusch等［26］注意到了利用GFR熒光示蹤劑通過透皮實現(xiàn)實時測量GFR的潛力.為此，他們首次利用FITC-海蔥糖作為熒光示蹤劑，結(jié)合小型活體動物成像儀通過測量大鼠耳上的熒光信號開發(fā)了實時評估GFR的方法［圖7（A）］.由于活體成像儀的應(yīng)用極大地簡化了數(shù)據(jù)的收集，從而可以大大增加消除曲線上的測量點數(shù)量，有效提高了GFR的檢測精度.他們通過與常用的酶法和熒光法同時測定的血漿清除率比較，證明了利用FITC-海蔥糖經(jīng)皮測量熒光強度得到的GFR結(jié)果的有效性.但這一方法與傳統(tǒng)方法相比，避免了血液或尿液采樣以及耗時的實驗室工作，極大地簡化并加快了小型實驗室動物的GFR測定.然而，此研究中所選用的單室模型沒有考慮到藥物血漿濃度最初的快速下降，也存在一定的問題.對此可以通過獲得大量的經(jīng)皮測量數(shù)據(jù)，分析復(fù)雜的運動特征，根據(jù)獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)來建模，從而更精確地估計GFR.

Fig.7 Fluorescence images of a depilated rat ear taken before and after injection of FITC-sinistrin using a CRI Maestro small animal imager(A)[26],a schematic drawing of a transcutaneous device and optical part of the device(RFID:radio-frequency identification)(B)and a schematic drawing of a modified miniaturized device(C)

一般小型活體動物成像儀對小型動物GFR的檢測過程中通常需要提前對動物進行麻醉處理，而對動物進行麻醉本身也有很大可能對其GFR測定造成影響，從而降低檢測的準(zhǔn)確性.為了實現(xiàn)對非麻醉狀態(tài)下的小型動物GFR的測量，Schock-Kusch等［54］設(shè)計、發(fā)展了一種小型便攜熒光監(jiān)測裝置［圖7（B）］，該裝置主要包括用于激發(fā)熒光標(biāo)記物的發(fā)光二極管和用于檢測所發(fā)射的熒光的光電二極管.將該裝置固定在大鼠的皮膚上后，通過在適當(dāng)?shù)牟ㄩL閃爍反復(fù)激發(fā)血管間隙內(nèi)的熒光標(biāo)志物，其發(fā)出的熒光信號被檢測并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，存儲在內(nèi)部存儲器中.利用這個監(jiān)測裝置，首次實現(xiàn)了對非麻醉狀態(tài)下的小型動物進行熒光成像.這種用于測量非麻醉動物腎功能的非侵入性方法不會對動脈壓、心率或運動活動產(chǎn)生不良影響［54］.因此，可以避免麻醉本身導(dǎo)致的GFR變化，有利于獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果.

2012年，該課題組［55］對先前報道的可用于大鼠的小型便攜性監(jiān)測裝置進行進了優(yōu)化，通過進一步縮減監(jiān)測裝置的尺寸，并配備內(nèi)部存儲器，使其可適用于體型更小的小鼠.基于這一裝置，首次實現(xiàn)了對自由活動的清醒小鼠GFR的實時監(jiān)測［圖7（C）］.使用這一小型化成像設(shè)備，結(jié)合已建立的二室模型，經(jīng)皮測量熒光腎標(biāo)記物FITC-海蔥糖的消除動力學(xué)，并且在單側(cè)腎切除小鼠和腎結(jié)核模型小鼠中證明了透皮檢測法與傳統(tǒng)血漿清除率法的結(jié)果具有良好的一致性.

在此基礎(chǔ)上，該課題組［56］基于FITC-海蔥糖透皮檢測技術(shù)進一步建立了一種實時反饋調(diào)節(jié)的恒定輸液清除方法.恒定輸液清除（CIC）技術(shù)一直以來被認為是GFR評估方法的金標(biāo)準(zhǔn).該系統(tǒng)主要由透皮監(jiān)測裝置和主機上用于調(diào)節(jié)輸液泵的控制器組成.熒光檢測器將測量的數(shù)據(jù)發(fā)送到主機，主機能夠控制一個裝有FITC-海蔥糖的注射器泵，將藥物注射進動物的股靜脈.設(shè)置參考劑量后，閉環(huán)調(diào)節(jié)能夠自動確定最佳的維持注射劑量，從而做到對每一實驗對象的平衡時間單獨優(yōu)化.這種方法可以精確地確定穩(wěn)態(tài)標(biāo)記濃度的起始點，實時監(jiān)測體內(nèi)標(biāo)記物濃度的相對變化，從而實現(xiàn)獨立于GFR水平的維持劑量的單獨優(yōu)化調(diào)節(jié).此外，達到穩(wěn)定狀態(tài)后可以連續(xù)監(jiān)測數(shù)小時，且可以只使用單一血液樣本確定GFR.他們還對不同品系小鼠（Balb/c，SV129，NMRI和C57BL/6）進行兩次經(jīng)皮GFR測定，評估了GFR的日?？芍貜?fù)性、品系內(nèi)和品系間變異性以及年齡等參數(shù)對研究的影響［57］.這項研究發(fā)現(xiàn)，同一動物在3 d內(nèi)記錄的GFR測量數(shù)據(jù)可靠性強，根據(jù)小鼠品系的不同，變異系數(shù)穩(wěn)定在3.0%～6.2%之間.

目前，這種非侵入性腎臟清除檢測裝置（NIC）已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化制造，并在多種動物模型中驗證了其可行性.如，Cowley等［58］應(yīng)用該裝置，通過注射FITC-海蔥糖連續(xù)測定有意識且行動自由的達爾鹽敏感性（SS）大鼠中隨著高血壓發(fā)展的前21 d GFR的變化.研究結(jié)果表明，該方法與傳統(tǒng)的基于肌酐清除的標(biāo)準(zhǔn)測量方法相比，檢測靈敏度更高，且更為簡便省時.并且，實驗顯示SS大鼠的腎小球濾過率下降出現(xiàn)于高血壓發(fā)生的約14 d后，因此推斷腎小球濾過率的降低是高血壓所導(dǎo)致的結(jié)果而并非其原因.此外，該裝置還被用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因敲除小鼠中，證明了腎臟ACE對于一氧化氮合成誘發(fā)的高血壓抑制起著非常重要的作用［59］.

利用FITC-海蔥糖和非侵入性腎臟清除檢測裝置，Street等［60］測定了野生型和A1aR基因敲除小鼠盲腸結(jié)扎和穿刺性膿毒癥早期的GFR和系統(tǒng)血流動力學(xué)，為已知的膿毒性急性腎損傷中GFR降低建立早期時間表.研究表明，透皮熒光檢測可以準(zhǔn)確快速監(jiān)測GFR在膿毒癥期間的變化，而傳統(tǒng)的GFR生物標(biāo)志物檢測方式無法檢測到如此快速的變化.此外，Scarfe等［61］利用類似的技術(shù)對阿霉素誘導(dǎo)的腎病模型小鼠的GFR進行了評估，發(fā)現(xiàn)海蔥糖清除率與患有阿霉素誘導(dǎo)腎病的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中受損腎小球的比例顯著相關(guān).這項技術(shù)允許對個體動物進行反復(fù)測試，最大限度地利用腎病和/或再生效應(yīng)的進展獲得信息，可以顯著減少臨床前腎病模型中的動物數(shù)量.

Mullins等［62］基于FITC-海蔥糖對瘦和肥胖C57BL/6J雄性小鼠進行了經(jīng)皮GFR測試研究.研究發(fā)現(xiàn)，這種非侵入性技術(shù)可以實時連續(xù)測量清醒瘦小鼠的GFR，而無需收集血液和尿液或進行化驗.但是在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、高血糖和近端腎小管病變的小鼠中，基于經(jīng)皮熒光測試得到的GFR與公認的血漿清除方法得到的結(jié)果差異性較大.他們推測，GFR經(jīng)皮熒光和/或血漿檢測可能受到循環(huán)脂類與FITC-海蔥糖之間相互作用的影響.此外，Chang等［63］首次將透皮監(jiān)測裝置和FITC-海蔥糖用于實時測量模型大鼠GFR和腎損傷生物標(biāo)志物的研究中.

由于活體動物背景熒光信號干擾、熒光信號透過率低等原因，用于監(jiān)測GFR的熒光示蹤劑通常需要使用較高的濃度.但是，熒光示蹤劑的血漿和/或尿液濃度過高可能會干擾常規(guī)的血液或尿液檢測.因此，在應(yīng)用于人體之前，應(yīng)最大限度地減少熒光標(biāo)記物使用的濃度，以此減少其潛在副作用.為此，Shmarlouski等［64］提出了基于時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC）的一種新的GFR透皮測量方法，稱為熒光壽命分解測量（LTDM），即將時間相關(guān)單光子計數(shù)采集與新的分解方法相結(jié)合［圖8（A）］.該硬件的光路由發(fā)射波長為485 nm的新型緊湊型皮秒脈沖二極管激光器、柔性光纖束和可安裝于清醒大鼠背上的測量頭，以及以單光子計數(shù)模式工作的光電倍增管和經(jīng)優(yōu)化的時間相關(guān)單光子計數(shù)單元組成.這種方法可以將FITC熒光信號與背景熒光信號分離，有效排除體內(nèi)自發(fā)熒光，從而提高檢測靈敏度.與NIC透皮檢測裝置相比，在保留相同檢測精度的情況下，該系統(tǒng)在清醒大鼠體內(nèi)的所需FITC-海蔥糖檢測劑量減少了200倍.但是，LTDM依賴于光導(dǎo)，因此必須使用Raturn微透析籠來防止測量頭因強烈運動而分離，因此檢測成本較高.研究指出，LTDM設(shè)備的高昂成本與Raturn籠的應(yīng)用缺陷能夠被節(jié)省GFR熒光示蹤劑的優(yōu)勢所彌補.當(dāng)監(jiān)測時間延長或者在需要更大劑量熒光示蹤劑的狗或豬等高等動物中進行臨床前研究時，這一優(yōu)勢更為明顯.

Fig.8 Components of optical measurement systems for lifetime-decomposition measurement(LTDM)(A)and MR-compatible optical sensor devices for FITC-sinistrin clearance measurement(B)[67]

同樣，為了解決透皮檢測GFR過程中皮膚漂白、自發(fā)熒光以及由皮膚灌流變化的影響，F(xiàn)riedemann等［65］通過測得的經(jīng)皮熒光數(shù)據(jù)，推導(dǎo)并驗證了一個新的區(qū)別于標(biāo)準(zhǔn)1～3室模型的FITC-海蔥糖分布和排泄動力學(xué)的數(shù)學(xué)算法.結(jié)果表明，記錄從注射示蹤劑開始的完整動力學(xué)過程，結(jié)合基線信號偏移的自動校正，基于透皮熒光測定得到的GFR可以達到與金標(biāo)準(zhǔn)恒定輸液清除率近乎相當(dāng)?shù)木?

除了熒光示蹤劑透皮檢測外，動態(tài)對比增強磁共振成像（DCE-MRI）也是一種非侵入性的GFR檢測方法.動態(tài)對比增強磁共振成像還支持單腎GFR，甚至可以通過計算參數(shù)圖對GFR進行空間分辨分析.但是，基于這一方法在人體研究和動物研究中的結(jié)果表明，其與金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法結(jié)果偏差較大［66］.Z?llner等［67］在Schreiber等［55］設(shè)計的透皮裝置的基礎(chǔ)上進行了改進，首次報道了一種可以同時進行磁共振成像（MRI）和熒光成像的小型傳感器［圖8（B）］.這種傳感器包括用于信號激發(fā)和接收的LED及光電二極管的原始設(shè)備和電子器件，采用銅箔屏蔽，僅保留LED、光電二極管和電池插頭.該裝置允許通過兩種非侵入性技術(shù)（動態(tài)對比增強磁共振成像和經(jīng)皮熒光檢測）同時測量GFR，免除了血液/尿液采樣或?qū)嶒炇覚z測的繁瑣程序，具有高時空的三維（3D）分辨成像.通過透皮熒光檢測所獲得的平均GFR值大約是DCE-MRI值的兩倍.與之前的報道相比，這種差異的縮減改善了大鼠GFR的測量結(jié)果.研究認為，GFR測量差異可能是由于未能找到最佳的動脈輸入函數(shù)以及未能考慮到信號強度與濃度曲線轉(zhuǎn)化中的偏差.

此外，Ahmad等［68］于2021年首次報道了X射線計算機斷層成像（CT）和FITC-海蔥糖透皮熒光檢測在放射性腎臟疾病成像中的聯(lián)合應(yīng)用，利用FITC-海蔥糖熒光成像彌補了X射線成像不利于在7 d內(nèi)多次評估的問題.該課題組評估了C57BL/6小鼠接受雙側(cè)局灶X射線照射治療后的腎損傷，結(jié)合FITC-海蔥糖腎排泄的透皮測量以及使用造影劑（ISOVUE-300 Iopamidol）的動態(tài)對比增強CT成像來檢測GFR.基于FITC-海蔥糖的技術(shù)允許在有意識、自由移動的小鼠中重復(fù)測量GFR，而使用非離子造影劑的動態(tài)增強CT成像可以提供腎臟的功能信息和形態(tài)特征，兩種方法具有較好的互補性.

FITC-海蔥糖的優(yōu)異表現(xiàn)使研究人員在腎病模型的研究和臨床應(yīng)用中對海蔥糖尤為關(guān)注.然而這種示蹤劑具有一定的局限性，如海蔥糖成本相對較高、提取和純化過程復(fù)雜.此外，大部分多糖都是多分散的聚合物，結(jié)構(gòu)的確定性相對較低.這些物質(zhì)是否均勻可靠也是它們能否用作GFR標(biāo)志物的一個重要限制因素.

3.3 基于環(huán)糊精衍生物的腎小球濾過率熒光示蹤劑

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是一類環(huán)狀低聚糖，一般含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元.這些環(huán)狀寡糖具有高水溶性，在動物和人體內(nèi)毒性都非常低，生物相容性良好，并且不會引發(fā)免疫反應(yīng)，因此在制藥與相關(guān)工業(yè)中具有非常廣泛的應(yīng)用［69］.2-羥丙基環(huán)糊精（HPCD）由于破壞了次級羥基之間的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，具有比一般天然環(huán)糊精更好的水溶性［70］，如，2-羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）水溶性可以達到60%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），甚至更高.并且，這一類化合物對豬源或人源的α-淀粉酶的水解性也更穩(wěn)定.此外，它們的分子量相對海蔥糖分布更窄，獲取成本更低.HPCD經(jīng)靜脈給藥后體內(nèi)吸收非常低，主要經(jīng)由腎臟排泄.HPCD已被證明在人體內(nèi)短期和長期研究中耐受性良好，靜脈給藥對腎臟或其它器官基本沒有不良影響［71］.諸多優(yōu)良性能使它們成為GFR熒光試劑的理想骨架［72，73］.

2016年，Gretz課題組［74］首次基于2-羥丙基環(huán)糊精發(fā)展了一系列GFR熒光示蹤劑，其中，基于2-羥丙基β環(huán)糊精（HPβCD）構(gòu)造的化合物FITC-HPβCD是最具潛力的GFR檢測試劑（圖5）.這一熒光示蹤劑可以經(jīng)由2-羥丙基β環(huán)糊精與熒光染料FITC共價鍵標(biāo)記快速合成得到，并且化合物具有良好的熒光特性.研究表明，F(xiàn)ITC-HPβCD具有低血漿蛋白結(jié)合力，高血漿與酯酶穩(wěn)定性，并且沒有展現(xiàn)出任何可檢測到的細胞毒性.在模型大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-HPβCD在體內(nèi)基本不被代謝，具有非常高的尿液回收率.他們進一步通過一個微型經(jīng)皮熒光信號監(jiān)測裝置對注射FITC-HPβCD的實驗大鼠進行了非侵入性實時熒光信號分析［圖9（A）］，結(jié)果顯示，在有與沒有丙磺舒處理的情況下，F(xiàn)ITC-HPβCD的清除沒有顯著差異［圖9（C）和（D）］，證明腎臟近端小管對這一示蹤劑既沒有重吸收也沒有分泌，即FITC-HPβCD僅被腎小球濾過.這些結(jié)果為基于2-羥丙基環(huán)糊精發(fā)展GFR示蹤劑奠定了重要基礎(chǔ).此外，相關(guān)檢測設(shè)備體積小，可以直接穿戴在清醒大鼠身上［圖9（B）］，通過對其熒光信號強度變化的測量，實現(xiàn)了以非侵入性的方式對未麻醉實驗動物GFR的實時動態(tài)監(jiān)測.

基于熒光探針分子的成像技術(shù)在活體動物成像中易于受到光穿透率、光散射和自發(fā)熒光信號的干擾.如，血液中的血紅蛋白對可見光具有較強的吸收作用，極大地限制了短波長熒光信號的穿透，而源自彈性蛋白、膠原蛋白以及其它一些生物熒光團的自發(fā)熒光也會對活體熒光信號的檢測造成較大的干擾［75，76］.由于GFR熒光示蹤劑發(fā)射波長大部分都在波長較短的藍、綠光范圍，在進行體內(nèi)無創(chuàng)透皮腎功能評估時，不可避免地受到信號穿透性差和組織的自發(fā)熒光信號背景的干擾，限制了其應(yīng)用.而在700～1700 nm近紅外區(qū)域，包括近紅外第一窗口（NIR-I，波長：700～900 nm）和近紅外第二窗口（NIR-II，波長：1000～1700 nm），由于其組織穿透深、自發(fā)熒光干擾少及成像速度快等優(yōu)點，近年來引起了極大關(guān)注［77］.但是，有機近紅外熒光染料大多具有強疏水性的大π-共軛體系，這通常會導(dǎo)致染料與血清中的蛋白質(zhì)之間有很強的結(jié)合，會影響由此產(chǎn)生的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和體內(nèi)的生物分布［78］.

Gretz課題組［79］將近紅外熒光染料七甲川菁與2-羥丙基β環(huán)糊精共價鍵連接，首次發(fā)展了發(fā)射波長在近紅外區(qū)域的GFR熒光示蹤劑ABZWCY-HPβCD與AAZWCY-HPβCD（圖5）.同時，為了降低親脂性的熒光染料與蛋白的非特異性結(jié)合，他們在染料中引入磺酸基陰離子和季銨鹽陽離子，使其具有兩性離子.研究結(jié)果表明，這些近紅外熒光示蹤劑具有非常強的親水性、極低的血漿蛋白結(jié)合與生物毒性以及更深的熒光信號穿透性.同時，與多數(shù)GFR熒光示蹤劑一樣，可以有效透過腎小管而不被腎小管重新吸收與分泌.他們進一步將這些近紅外熒光示蹤劑分別注射到健康大鼠與過表達人Ang II 1型受體（hAT1R）的腎功能障礙大鼠中.同時，為了實現(xiàn)對清醒大鼠的熒光信號監(jiān)測，他們也開發(fā)出一個穿戴式的小型熒光監(jiān)測裝置.該裝置由兩個激發(fā)波長為700 nm的發(fā)光二極管和一個用于檢測790 nm發(fā)射波長的光電二極管組成.通過無創(chuàng)透皮實時熒光強度變化檢測發(fā)現(xiàn)，腎功能障礙大鼠的血漿半清除時長比腎功能正常大鼠顯著增加［圖9（E）和（F）］，從均值32.98 min增加到了42.88 min，表明基于這些近紅外的熒光示蹤劑來實時監(jiān)測腎臟的功能具有較高的可行性.

Fig.9 Miniaturized transcutaneous devices and a battery for transcutaneous measurement(A),a conscious Sprague-Dawley(SD)rat under transcutaneous measurement with an attached device(B),elimination curves of FITC-HPβCD by transcutaneous measurements in SD rats in the absence(C)and presence(D)of probenecid treatment[74],elimination curves of ABZWCY-HPβCD by transcutaneous measurements in wild-type rats(E)and AT1R transgenic rats(F)[79]

綜上，腎小球濾過率（GFR）熒光示蹤劑在過去的20多年間取得了長足的發(fā)展（表1），一系列新穎的熒光示蹤劑被陸續(xù)發(fā)展出來，同時，與之相匹配的系列檢測裝置也被開發(fā)出來.這些示蹤劑與新型成像裝置的結(jié)合，已在模型動物的GFR實時監(jiān)測中展示出極大的應(yīng)用潛力.特別是通過小型穿戴式熒光成像裝置，更可實現(xiàn)對清醒無麻醉狀態(tài)下模型動物的透皮非侵入性熒光檢測，實時了解其腎臟功能.

Table 1 Summary of GFR fluorescent tracers and their key parameters

4 總結(jié)與展望

基于熒光示蹤劑的分子結(jié)構(gòu)和設(shè)計策略，對近20年來發(fā)展的GFR熒光示蹤劑進行了歸納與總結(jié)，同時對相關(guān)的檢測儀器或裝置也進行了介紹.在這些探針分子中，基于吡嗪的熒光示蹤劑MB-102目前由MediBeacon公司進行開發(fā)，正在進行臨床Ⅲ期研究當(dāng)中.同時，基于大分子多糖化合物與常用熒光染料共價鍵連接構(gòu)建的GFR熒光示蹤劑，由于其具有的熒光量子產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)可調(diào)性強等優(yōu)勢，受到了越來越多的關(guān)注，相關(guān)的臨床研究也在穩(wěn)步推進中.這些GFR熒光示蹤劑的成功開發(fā)，再結(jié)合可穿戴式的小型化檢測儀器，一方面將極大地簡化腎臟功能相關(guān)模型動物的研究，實現(xiàn)對各種類型動物在清醒非麻醉狀態(tài)下的實時腎功能監(jiān)測.更為重要的是，在另一方面將為潛在腎功能障礙病人，特別是處于重癥監(jiān)護室中的急性腎損傷高危人群提供一個無創(chuàng)實時的監(jiān)測與診斷工具，使醫(yī)護人員能夠早了解、早干預(yù)、早治療，具有非常重要的臨床應(yīng)用價值.

盡管當(dāng)前GFR熒光示蹤劑已經(jīng)取得了令人矚目的進展，但是這些試劑的進一步應(yīng)用，尤其在臨床應(yīng)用中仍然面臨著一些問題.首先，活體組織固有的背景熒光信號以及熒光在活體組織中的低穿透率依然是目前GFR熒光示蹤劑需要克服的一個挑戰(zhàn)，這直接影響到了相關(guān)示蹤劑的檢測靈敏度.盡管目前通過增加示蹤劑的用量一定程度上能夠提高檢測信號的強度，但與此同時也增加了腎的負擔(dān)，一定程度上帶來了試劑安全性方面的問題.此外，目前近紅外熒光染料的應(yīng)用也有助于解決熒光信號穿透率低和背景信號干擾等問題，但依然存在較大的提升空間.可以預(yù)期，進一步應(yīng)用具有更長激發(fā)/發(fā)射波長、更高量子熒光產(chǎn)率的熒光染料，特別是處于近紅外二區(qū)（1000～1700 nm）激發(fā)/發(fā)射的熒光染料將有助于提升信號穿透率和降低背景熒光信號干擾，提升檢測靈敏度，從而進一步降低熒光示蹤劑的用量.同時，能夠有效去除背景熒光信號與具有更高檢測靈敏度的新型儀器的開發(fā)也將有效地降低熒光示蹤劑的實驗量.其次，目前GFR熒光示蹤劑主要是依賴于單一熒光信號強度的變化來評估個體GFR.這種方法盡管在應(yīng)用上相對簡單，但是易于受到成像光源、信號接收裝置、檢測位點變化，甚至個體差異性等各個方面的影響，對檢測結(jié)果的可靠性產(chǎn)生影響.為了解決這個問題，基于混合示蹤劑的比例性熒光檢測方法已經(jīng)被開發(fā)出來，但是這種混合試劑中基本不排泄示蹤劑的應(yīng)用極大地限制了其臨床應(yīng)用的可能性.此外，基于腎小管濾過率來對腎臟功能進行實時監(jiān)測和評估的方法也難以反映出腎臟本身更為早期的病理變化，從而失去對病人更早干預(yù)治療的寶貴機會.近年來，一系列基于環(huán)糊精的激活型分子熒光探針被報道出來，通過體內(nèi)注射探針結(jié)合尿液分析的方式對腎臟早期病變生物標(biāo)志物進行檢測，實現(xiàn)了對急性腎損傷更早期的診斷［80～82］.但是，這種依賴于尿液分析的方法對應(yīng)用于處于重癥監(jiān)護期的急性腎損傷易發(fā)病人群存在一定的困難.在未來的研究中，如果能夠?qū)⑦@種類型的熒光探針分子與GFR熒光示蹤劑有機結(jié)合，構(gòu)造出具有檢測靶標(biāo)成像功能的GFR熒光示蹤劑，通過體表無創(chuàng)的方式實現(xiàn)同時對包括腎小管濾過率和前期的急性病變信號在內(nèi)的腎臟功能的實時監(jiān)測，將更有助于這一檢測策略在重癥監(jiān)護狀態(tài)下急性腎損傷易發(fā)人群中的應(yīng)用.