節(jié)笑笑 陳甜甜 張 月 陳旺宇 李 杰 郝旭亮

1.山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西太原 030012；

2.山西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，山西晉中 030619；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西太原 030024

腫瘤是威脅人類健康最主要的疾病之一，尤其是惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年惡性腫瘤的病死率約為11.94%[1]。目前，臨床上常用的惡性腫瘤的治療方法主要有放射療法和藥物化療等，但這些經(jīng)典的治療方法在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)殺傷機(jī)體正常細(xì)胞，降低其免疫功能，并且易產(chǎn)生耐藥性，因此臨床急需安全有效的腫瘤治療方法。隨著醫(yī)藥技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)人體免疫系統(tǒng)更加深入的了解，運(yùn)用免疫療法治療惡性腫瘤逐漸成為腫瘤治療的新方法。但目前對(duì)免疫系統(tǒng)的認(rèn)知尚不全面，若想要運(yùn)用免疫療法有效治療惡性腫瘤，需要深入了解藥物的作用機(jī)制及疾病的發(fā)病原理，深入探究免疫系統(tǒng)在疾病發(fā)展或治療中是如何發(fā)揮作用的。基因缺失動(dòng)物的出現(xiàn)使深入探究藥物和疾病機(jī)制成為可能，其為免疫抗腫瘤的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。

基因缺失動(dòng)物是指應(yīng)用基因敲除技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)制作出來的，在個(gè)體基因組特定位點(diǎn)上的目的基因被刪除或滅活的一類動(dòng)物[2]。在所有基因缺失動(dòng)物中，基因缺失小鼠的優(yōu)勢尤為明顯，其一：小鼠為哺乳類動(dòng)物，其生理和病理與人類有諸多相似之處；其二：人類基因在小鼠中幾乎都可以找到同源物[3]。現(xiàn)在基因缺失小鼠被應(yīng)用在多種方面，如人類疾病動(dòng)物模型方面、藥物依賴性研究方面以及免疫學(xué)方面的應(yīng)用等。本文就基因缺失小鼠在免疫抗腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用做一綜述。

1 免疫抗腫瘤的研究進(jìn)展

由于傳統(tǒng)腫瘤治療方法會(huì)對(duì)機(jī)體造成極大傷害，因此人們迫切需要尋求新的腫瘤治療手段。隨著人們對(duì)免疫系統(tǒng)的深入研究，免疫抗腫瘤逐漸走進(jìn)了人們的視野。免疫抗腫瘤不同于傳統(tǒng)抗腫瘤之處在于免疫抗腫瘤是通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用，而非直接殺滅腫瘤細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，許多藥物都具有免疫抗腫瘤的作用，如天然多糖通過與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）[4]、Dectin-1受 體（Dectin-1 receptor）[5]等受體結(jié)合激活免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。青蒿素可增強(qiáng)乳腺癌的抗腫瘤免疫應(yīng)答[6]；索拉非尼等現(xiàn)代臨床一線抗腫瘤藥物既能直接殺滅腫瘤細(xì)胞，又能抑制血管內(nèi)皮生長因子，從而延緩腫瘤的生長。

此外，還有一些尚在研發(fā)中的藥物經(jīng)過臨床前研究發(fā)現(xiàn)其具有免疫抗腫瘤的作用，如NC318可抑制Siglec-15通路激活，活化免疫細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞[7]；ABBV-151是GARP抑制劑，其通過抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulator T cells，Treg）釋放活性TGF-β1以達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的[8]；PY314可通過消耗免疫抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，促進(jìn)抗腫瘤免疫，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[9]。

由此可見，隨著人們對(duì)免疫系統(tǒng)的深入了解，免疫抗腫瘤的藥物日趨多樣化和精準(zhǔn)化，免疫抗腫瘤正在逐步替代傳統(tǒng)腫瘤治療方法，成為腫瘤治療的首要選擇。

2 基因缺失小鼠的研究進(jìn)展

基因缺失小鼠是20世紀(jì)80年代后半期發(fā)展起來的，其原理是應(yīng)用DNA同源重組技術(shù)使機(jī)體特定的基因失活或缺失?；蛉笔∈蟪Ｒ?guī)制作技術(shù)主要有兩種：基因打靶技術(shù)和基因捕獲技術(shù)。第一次小鼠基因打靶實(shí)驗(yàn)于1989年完成，幾十年來基因打靶技術(shù)的問世加速了人們對(duì)于基因功能的研究，并為生物學(xué)研究提供了重要的生物資源。2007年美國的Mario R.Capecchi、Oliver Smithies和英國的Martin J.Evans使用基因打靶技術(shù)使小鼠體內(nèi)的特定性基因失活，培養(yǎng)出了使用價(jià)值極高的“基因缺失小鼠”，使他們獲得了同年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[10]。基因捕獲技術(shù)是作為基因打靶技術(shù)的替代方法而開發(fā)出來的，它是一種高通量的和隨機(jī)突變的技術(shù)，盡管不像基因打靶技術(shù)那樣特異，但是通過誘捕可在短時(shí)間內(nèi)制作出大量基因缺失小鼠[11]。

此外，還有條件基因缺失小鼠，條件基因缺失小鼠是指在小鼠發(fā)育的特定的階段或特定的細(xì)胞組織類型中將目的基因進(jìn)行敲除而得到的小鼠。條件基因敲除技術(shù)的本質(zhì)是基于常規(guī)基因敲除技術(shù)，再通過重組酶Cre對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行特異性重組，可以對(duì)小鼠的基因組修飾進(jìn)行時(shí)間和空間上的調(diào)控[12]。自1994年Gu等研制出全球第一例基于Cre/LoxP系統(tǒng)的特異性基因缺失小鼠，條件基因敲除技術(shù)便迅速取代了傳統(tǒng)的完全基因敲除技術(shù)成為現(xiàn)代基因敲除的主流技術(shù)[13]。

目前，還有其他小鼠基因敲除方法，包括ZFN技 術(shù)[14]、TALEN技 術(shù)[15]、CRISPR/Cas9基 因 編 輯技術(shù)[16]等。2020年法國生物化學(xué)家Emmanuelle Charpentier和美國生物學(xué)家Jennifer A.Doudna研發(fā)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，它對(duì)比于其他技術(shù)精度更高、成本更低，且方法更簡單。這兩位科學(xué)家也于同年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。郭洋等[17]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建PD-1基因缺失小鼠；李振等[18]使用CRISPR/Cas9基因編輯、顯微注射等方法成功構(gòu)建β2m基因缺失小鼠；王海杰等[19]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建凝血因子8基因缺失小鼠，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)支持。

小鼠基因敲除技術(shù)為闡明生物體內(nèi)基因的功能提供了有力手段。截至目前，已有近100種疾病模型由基因缺失小鼠構(gòu)建，通過對(duì)這些模型的建立和深入研究，人們對(duì)許多疾病有了更加系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)并可由此尋找這些疾病新的更有效的治療靶點(diǎn)?；蚯贸∈蠹夹g(shù)的問世是生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一項(xiàng)偉大的成就。

3 基因缺失小鼠在免疫抗腫瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展

3.1 在藥物治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展

免疫抗腫瘤作為現(xiàn)代腫瘤治療的熱門方式，在對(duì)其研究中，基因缺失小鼠是不可或缺的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基因缺失小鼠使臨床能夠更加深入地探究藥物在腫瘤治療中是如何發(fā)揮作用的。

近年來多糖是免疫抗腫瘤領(lǐng)域研究的熱門話題，許多植物多糖被證明具有免疫抗腫瘤的作用。余強(qiáng)[20]在對(duì)黑靈芝多糖的研究中應(yīng)用TLR4基因缺失小鼠以及對(duì)照鼠來對(duì)比黑靈芝多糖治療S-180肉瘤的能力，結(jié)果表明黑靈芝多糖提升了對(duì)照鼠的免疫水平，但對(duì)基因缺失型小鼠沒有影響，這說明黑靈芝多糖是通過激活TLR4信號(hào)通路來發(fā)揮治療S-180肉瘤的作用。劉艷玲等[21]在研究黃芪多糖對(duì)肺癌小鼠免疫功能影響時(shí)在實(shí)驗(yàn)中使用TLR4基因缺失小鼠，與對(duì)照鼠相比，基因缺失小鼠無論是模型組還是給藥組，其炎性因子和蛋白表達(dá)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這恰恰說明了黃芪多糖是通過TLR4信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤的作用，在TLR4基因缺失的小鼠體內(nèi)黃芪多糖是無法發(fā)揮作用的。

除此之外，陳潔等[22]利用Dectin-1基因缺失小鼠和對(duì)照鼠構(gòu)建荷瘤小鼠模型，使用β-葡聚糖進(jìn)行治療，結(jié)果顯示經(jīng)過治療后基因缺失小鼠腫瘤生長速度明顯高于對(duì)照鼠，這表明Dectin-1基因?qū)Ζ?葡聚糖抗腫瘤有影響，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

由此可見，在尋求免疫療法治療腫瘤的道路上，基因缺失小鼠是必不可少的，在實(shí)驗(yàn)中相對(duì)于使用野生型小鼠而言，同時(shí)利用基因缺失小鼠及對(duì)照鼠，可以使藥物機(jī)制更加明確，令實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說服力?？傊?，基因缺失小鼠對(duì)于藥物機(jī)制的研究意義重大。

3.2 在非藥物領(lǐng)域的研究進(jìn)展

除了探究藥物機(jī)制外，在非藥物領(lǐng)域基因缺失小鼠也得到了廣泛的應(yīng)用。Katrin等[23]在對(duì)腫瘤監(jiān)測的研究中使用Stat1缺失小鼠以及野生型小鼠，以此來探究NK細(xì)胞依賴性腫瘤監(jiān)測，結(jié)果顯示Stat1的缺失并沒有取消NK細(xì)胞依賴性腫瘤監(jiān)測，即兩種小鼠所得結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I-Ying等[24]在抗腫瘤研究中使用Rab37基因缺失小鼠及野生型小鼠，結(jié)果表明Rab37通過觸發(fā)M2型巨噬細(xì)胞極化改變腫瘤微環(huán)境，發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。Klara等[25]在探究細(xì)胞因子CDK6與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系中使用T細(xì)胞特異性CDK6敲除小鼠模型，結(jié)果顯示CDK6在IFN信號(hào)傳導(dǎo)中起雙重作用，即CDK6既促進(jìn)早期IFN反應(yīng)，也參與負(fù)反饋回路的誘導(dǎo)，這表明CDK6在細(xì)胞因子反應(yīng)的微調(diào)中發(fā)揮作用。

基因缺失小鼠除了可以探究腫瘤發(fā)病機(jī)制外，還有助于尋求更有效的治療靶點(diǎn)。Ivana等[26]在對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌的研究中使用CDH11基因缺失小鼠以及對(duì)照鼠，無論是否使用藥物治療，CDH11基因缺失小鼠較對(duì)照鼠而言，其生存期更長、腫瘤體積更小，說明CDH11被敲除或抑制可以降低胰腺腫瘤的發(fā)展，并且延長小鼠的存活期。CDH11可能成為胰腺癌的治療靶點(diǎn)。石秀珍等[27]在結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用MLL5基因缺失小鼠以及對(duì)照鼠制備小鼠荷瘤模型，結(jié)果顯示MLL5基因缺失可抑制腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤免疫，MLL5可能成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。

這表明無論是探究腫瘤發(fā)病機(jī)制，還是篩選腫瘤治療靶點(diǎn)，基因缺失小鼠都是必不可少的，其貫穿于腫瘤從發(fā)生到治療的始終。基因缺失小鼠對(duì)于人類認(rèn)識(shí)腫瘤、治療腫瘤做出了巨大貢獻(xiàn)。

4 討論

基因缺失小鼠的問世是人類醫(yī)學(xué)史上的巨大進(jìn)步，其對(duì)免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等都有深刻的影響?；蛉笔∈笄袑?shí)地幫助人類更直觀地認(rèn)識(shí)到藥物是如何在機(jī)體發(fā)揮治療作用的。

在人體生理病理以及藥物作用機(jī)制的研究中，尤其是在基因以及通路的研究方向上，基因缺失小鼠的應(yīng)用是十分重要的技術(shù)方法之一，其對(duì)比于野生型小鼠而言優(yōu)勢明顯，但基因缺失小鼠造價(jià)高昂、制備困難，再加上目前技術(shù)有限，只能敲除一個(gè)或幾個(gè)基因，而藥物的作用往往是多方面的，這大大限制了基因缺失小鼠在實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用，隨著基因技術(shù)的不斷突破，相信在不久的將來，基因敲除領(lǐng)域會(huì)攻克難關(guān)，使基因缺失動(dòng)物應(yīng)用在更多實(shí)驗(yàn)研究中，尤其是在免疫抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。腫瘤發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，免疫系統(tǒng)讓人難以捉摸，再加上藥物治療具有多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，運(yùn)用免疫療法治療腫瘤還有很長遠(yuǎn)的路需要走。