王亞琴

（浙江大學農業(yè)與生物技術學院 水稻生物學國家重點實驗室，浙江杭州 310058）

0 引言

FV3000 是一款高速、高靈敏度、高精確性，可實現(xiàn)從宏觀到微觀全面觀察成像的全新一代活細胞成像工具，是目前市場上應用較為普遍的一款激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM），也是浙江大學水稻生物學國家重點實驗室（以下簡稱水稻重點實驗室）新引進的一臺大型設備。由于它具有超分辨率成像和層析成像能力，相比一般顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡具有不可比擬的優(yōu)越性，已經成為現(xiàn)代科學技術研究領域中的大型綜合儀器。

隨著高校開展前沿學科、交叉學科、學科群的建設，對儀器設備的使用及管理提出了更多的需求。大型設備的投入及運行對培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力，提高科研水平起著重要作用，同時也是衡量學院學科建設和科研水平的重要指標[1]。LSCM 作為大型儀器的一員，其本身價格昂貴、操作復雜、耗材消耗較大，使用及維護成本較高。為貫徹落實《國務院關于國家重大科研基礎設施和大型科研儀器向社會開放的意見》（國發(fā)〔2014〕70 號）精神，優(yōu)化資源配置，釋放服務潛能，提高使用效率[2]，水稻重點實驗室依托浙江省科技創(chuàng)新云服務平臺，國有資產管理云服務平臺，將FV3000 主動對接國家平臺，并配置專業(yè)技術人員操作管理，實行開放共享。本文結合多年使用和管理經驗，對FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡的使用及規(guī)范管理進行總結，以期為相關的管理人員和使用者提供借鑒參考。

1 激光掃描共聚焦顯微鏡簡介

共聚焦顯微術（Confocal Microscopy）概念是20 世紀50 年代中期，由哈佛大學的Marvin Minsky 博士提出，并于1957 年申請技術專利，隨后多名學者對共焦成像開展了更為細致的研究，但受限于激光及計算機等技術發(fā)展水平的制約，直到20 世紀70 年代才研制出第一臺真正實用的共聚焦顯微鏡，80 年代中期才出現(xiàn)第一臺激光掃描共聚焦顯微鏡。

LSCM 是一種典型的高技術光電儀器，它主要是把熒光顯微鏡、激光掃描及計算機圖像處理等裝置組合在一起，通過有效阻止非焦平面信息的干擾，提高掃描圖像的分辨率和對比度，最終獲得比較清晰的圖像。同時，通過連續(xù)切片操作，三維圖像的掃描和重構，獲得樣品的整體信息。另外，LSCM 可以定量分析細胞內的特定物質和信號，同時定位不同的成分[3]。作為一種技術含量較高的研究工具，LSCM 可以對樣品進行定性、定量、定位和定時研究，由于這些強大的技術功能，目前，LSCM 在分子生物學、免疫學、遺傳學、藥理學、病理學、食品科學、材料科學等研究領域得到廣泛應用[4]。

2 FV3000 的主要用途

FV3000 具有完成活細胞和組織成像所需的高靈敏度和高速度，可以為細胞、組織和較小的生物體完成2D 到6D（x，y，z，t，λ，p）的從宏觀到微觀的成像操作，同時具備直觀且可以調整的用戶界面，支持從圖像采集到圖像處理和分析的整個工作流程，其主要用途有：

（1）用于組織切片、生物材料熒光標記、活細胞熒光標記的高分辨率成像，同時得到清晰銳利的多層Z 平面結構的光學切片，用于構建標本三維實體結構，并做形態(tài)分析和三維空間測量。

（2）用于活細胞生物分子、細胞器或離子等生物物質的定性、定量、定時和定位分布檢測等，適合用于快速變化樣品，捕捉變化過程信號，可監(jiān)測細胞內鈉、鎂、鈣離子濃度變化，捕捉鈣火花，并且縮短實驗時間，降低光毒性。

（3）用于獲取圖像的時間信息，研究熒光標本隨時間濃度、強度、擴散速度、空間移動等變化的數(shù)據信息，進行相關動力學研究。

（4）可對樣本進行光譜掃描，獲取熒光標本光譜信息，研究熒光材料光譜特性、獲取未知染料發(fā)射光譜圖。

3 FV3000 的組成和技術參數(shù)

3.1 激光照射系統(tǒng)

激光照射系統(tǒng)包括紫色固體激光器：405 nm；青色固體激光器：445 nm；藍色固體激光器：488 nm；藍綠色固體激光器：514 nm；綠色固體激光器：561 nm；紅色固體激光器：640 nm。開放式和一體化的激光耦合器，通過單獨一根高透過率光纖導出，近紫外到紅光區(qū)域一體化色差校正，無須調節(jié)光纖中心。

3.2 共聚焦掃描檢測系統(tǒng)

共聚焦掃描檢測系統(tǒng)包括4 個獨立的光譜型熒光檢測通道和熒光檢測器；1 個透射DIC 檢測通道，所有通道可以獨立設置不同激光；2 個大靶面制冷型超高靈敏檢測器。

3.3 全自動倒置顯微鏡系統(tǒng)

全自動倒置顯微鏡系統(tǒng)包括8 孔電動激發(fā)塊轉盤，包含窄帶帶通紫外激發(fā)（UV）、窄帶帶通藍光激發(fā)（B）和寬帶綠光激發(fā)（G）3種；8 孔電動萬能聚光鏡，可適用物鏡1.25～100 倍；130 W 超高壓汞燈，無限遠校正光學系統(tǒng)，齊焦距離為國際標準45 mm。

3.4 計算機工作站

計算機工作站配置有CPU Intel Xeon W-2133 3.6 GHz六核CPU，Windows 10 Professional 64 bit 操作系統(tǒng)。

3.5 圖像采集及分析軟件

圖像采集及分析軟件包含圖像采集和系統(tǒng)自動控制，光路全電動控制切換，三維/四維可視圖象重建功能，具有Alphablend、Isosurface、MIP 等多種三維渲染模式。

4 FV3000 顯微鏡室的環(huán)境要求

4.1 實驗室內的溫濕度盡量保持恒定

實驗室內的環(huán)境溫度應保持在20～24 ℃，濕度40%～60%，室內遮光。需要特別注意的是，在比較潮濕的地區(qū)要配備除濕器。

4.2 實驗室要配備防震設備

激光掃描共聚焦顯微鏡應盡量放置在一樓，同時將設備安裝在具有防振功能的專用臺子上，防止因較高樓層的振動影響儀器的使用。

4.3 實驗室內要保持干凈整潔

定期對實驗室進行清理，保持室內干凈整潔，實驗者進入實驗室時要穿白大褂及鞋套，使用完畢后，要及時做好臺面、物鏡、目鏡等容易被污染的光學部件的清潔工作。

5 FV3000 管理人員的要求及職責

5.1 管理人員要求

由于激光掃描共聚焦顯微鏡功能多樣、硬件和軟件配置都比較復雜，操作步驟又因樣品和成像要求有所不同，使用時熒光倒置顯微鏡和電腦成像軟件之間需要不斷地切換，同時圖像采集時參數(shù)設置較多[5-9]，操作不當會對儀器造成較大的損傷，為此需要配備具有一定專業(yè)技術水平、責任心強的實驗技術人員或教師擔任操作管理人員，且須經過培訓和考核方可上機操作。為了提高管理人員的專業(yè)素質和管理能力，管理人員應定期參加設備相關的操作技能培訓，積極參加LSCM 研究領域的會議及論壇，以便和專業(yè)人士進行技術學習和交流，同時及時收集和歸納整理用戶的反饋信息，總結儀器的使用情況并及時作出改進。

5.2 管理人員職責

激光掃描共聚焦顯微鏡儀器功能強大，應用廣泛，如何更好地使用儀器，保證其正常安全運行的同時再開發(fā)其他功能和應用，技術人員起到了關鍵作用。其主要職責有：

（1）制定并執(zhí)行FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡的操作規(guī)程，認真整理好設備的使用、維護和維修記錄，并及時登錄開放共享網絡管理平臺，填報儀器設備的管理及使用狀況。

（2）在熟練使用FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡已有功能的基礎上，合理開發(fā)新功能，使儀器設備發(fā)揮最大收益。

（3）按規(guī)定對FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡進行維護、維修、校驗標定及檔案管理工作。

（4）負責對校內和校外的服務及對使用人員的操作培訓工作。

6 FV3000 網絡預約使用及管理

大型儀器設備共享管理系統(tǒng)能夠結合互聯(lián)網技術，有效整合設備資源，打破科研單位界限，是儀器開放共享共用、提高儀器利用率的有效途徑[10]。激光掃描共聚焦顯微鏡應用非常廣泛，藥學、醫(yī)學、化學、生命科學等學科都會用到此類儀器。為了促進各學院學科的資源共享，提高大儀設備使用率，F(xiàn)V3000 已加入浙江大學大型儀器共享平臺，實行網絡化管理。校內外的研究人員可以登錄浙江大學大型儀器共享管理平臺（http：//equip.zju.edu.cn/xin/）查詢到儀器型號、技術指標、應用范圍、管理員、收費標準等信息，實行網絡預約。操作人員可根據用戶需求，對樣本的預選、圖像采集、顯微圖像分析等系列環(huán)節(jié)進行技術服務。網絡平臺上儀器使用預約一覽表可以直觀地查看儀器的預約使用情況，可以極大地解決儀器空置、使用時間沖突、使用率低等問題[11]。

7 FV3000 開放共享及有償服務

FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡價格昂貴，運行成本和維修保養(yǎng)的費用都很高，且設備需要定期更換燈泡、矯正光路等，后期維修費用是否充足，直接影響設備的使用壽命。為保障大型儀器設備的良好運行，提高大型儀器設備的使用效益，規(guī)范大型儀器功能開發(fā)與維修保養(yǎng)服務，促進開放共享，更好地為教學、科研和學科建設服務，目前FV3000 已納入國家大型設備平臺開放共享管理系統(tǒng)，在滿足校內教學科研基本需求的前提下，主動為社會提供分析測試、協(xié)作咨詢、培訓指導等共享服務工作，有效整合資源，促進社會共享。同時，F(xiàn)V3000 設備連接浙江大學有償服務系統(tǒng)，根據有關文件制定收費標準，經學校實驗室與設備管理處審核通過后，根據審定的標準開展大型設備后有償服務，用戶可通過線上、線下兩種形式繳納測試費用。有償服務收入全部納入學校統(tǒng)一財務賬戶管理，集中核算，同時根據服務收入設立大型設備專項維修基金，用于儀器日常運行及維修。

近年來，國家加大對科研的投入，促進高精尖儀器技術快速發(fā)展，科研工作者對共聚焦顯微鏡成像實驗需求量在不斷攀升，使得共聚焦掃描顯微鏡的數(shù)量和功能都在快速增長，如何管好、用好貴重儀器設備，保證其在穩(wěn)定且高效運行的同時發(fā)揮與其價值相匹配的功能，更好地為教學和科研工作服務，提高設備使用效益和資源共享率，已成為眾多高校乃至社會學術群體共同關注的問題。水稻重點實驗室自購置FV3000 共聚焦顯微鏡以來，已為15 個院內外課題組的280 多位科研人員提供服務，年使用機時1800 h 左右，支撐國家級重大重點項目40 余項，發(fā)表高水平研究論文200 余篇，獲省部級以上獎勵8 項，為學科建設及發(fā)展提供了強有力的保障。