曾名望, 鐘瑞蓬, 藍青海, 王鈺菲, 張文福, 楊 超綜述, 梁偉東審校

非編碼RNAs (non-coding RNAs,ncRNAs)是指基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子,是一類內(nèi)源性表達的RNA分子,主要包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等,在機體多種病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是由于腦的供血動脈狹窄或閉塞,使得腦血流減少或中斷、腦組織缺血缺氧導(dǎo)致腦組織壞死、神經(jīng)功能受損或喪失的一類高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的疾病[1]。目前急性缺血性腦卒中的主要治療方法是通過靜脈注射重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA)進行溶栓,然而常常因為治療時間窗過短,使得腦卒中的臨床治愈水平受到限制。同時,血流再通后的缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)會加重腦損傷,嚴重影響患者預(yù)后。因此,深入研究IS發(fā)生、發(fā)展及治療過程中的病理生理調(diào)控具有重要意義。近年來,許多研究報道非編碼RNAs通過多種途徑,如細胞凋亡、氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細胞的活化、血管內(nèi)皮細胞的再生等在IS中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,本文就非編碼RNAs在IS的具體調(diào)控機制研究進展做一綜述,旨在為IS的防治研究提供參考。

1 概 述

非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)是指由基因組轉(zhuǎn)錄而成的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。非編碼RNAs可分為兩種主要類型：基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)型ncRNAs和調(diào)控型ncRNAs。調(diào)控型ncRNAs又分為非編碼小RNA、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA),非編碼小RNA包括microRNA(miRNA)、siRNA和piRNA。miRNA是一類長約22個核苷酸序列的內(nèi)源性表達的非編碼短單鏈RNA,在3’非翻譯區(qū)(UTR)與mRNA不完全堿基配對，抑制蛋白質(zhì)翻譯,從而控制細胞的增殖、分化和凋亡等[2]。lncRNA是一種大于200個堿基數(shù)、在機體內(nèi)轉(zhuǎn)錄但基本不翻譯的一種非編碼RNA,在機體內(nèi)主要是通過干擾下游基因轉(zhuǎn)錄、阻斷信號通路、引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列結(jié)合或作為競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)調(diào)節(jié)mRNA的翻譯等發(fā)揮作用[3]。circRNA是一類環(huán)形分子,結(jié)構(gòu)由共價鍵形成,通常具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),不容易受RNA外切酶影響,同時具有高度的組織特異性表達,可作為miRNA海綿、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑等發(fā)揮作用[4]。腦卒中是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾和死亡的重要病因,可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種類型,其中缺血性腦卒中占所有腦卒中的87%,它是一類血液循環(huán)障礙性疾病,是由于腦供血動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致腦組織壞死,引起相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙。大量研究表明在腦卒中患者中ncRNAs的表達發(fā)生了改變[5]。越來越多的研究證實在缺血性腦卒中病理生理過程中,ncRNAs在細胞凋亡、氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細胞活化、血管新生等多種途徑中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[6～9]。

2 機 制

2.1 非編碼RNA參與調(diào)控腦卒中后細胞凋亡 細胞凋亡是指細胞按自身程序主動死亡的過程,細胞凋亡在形態(tài)學(xué)和生化特征上表現(xiàn)為細胞皺縮,細胞核、染色質(zhì)濃縮,DNA片斷化,細胞骨架和核蛋白降解,蛋白質(zhì)交聯(lián),凋亡體形成。有研究發(fā)現(xiàn),在急性腦缺血后,大腦有兩個重要的獨立區(qū)域:缺血核心區(qū)和缺血半暗區(qū)[10]。暴露在血流減少最嚴重的缺血核心區(qū)受到致命的損傷,大量的細胞發(fā)生壞死。包圍核心區(qū)的組織區(qū),因血流減少而失去功能,但仍保持代謝活性,這一區(qū)域被稱為缺血半暗區(qū),缺血半暗區(qū)有許多神經(jīng)元在數(shù)小時或數(shù)天后發(fā)生凋亡,因此在腦卒中發(fā)作后一段時間內(nèi)有可能恢復(fù),從而減輕腦缺血導(dǎo)致的腦損傷。Radak等[11]也提出腦缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷過程中出現(xiàn)細胞凋亡,遲發(fā)性神經(jīng)元損傷主要是由細胞凋亡所致。

細胞凋亡主要有兩種途徑,即內(nèi)在途徑以及外在途徑。內(nèi)在刺激被線粒體信號通路激活,主要是線粒體細胞色素c(cytochrome C,Cyt-C)或細胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放。內(nèi)在途徑受到屬于Bcl-2家族的一類蛋白質(zhì)的控制和調(diào)節(jié),這些蛋白質(zhì)可以分為促凋亡蛋白(Bak,Bax等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-x等),通過參與調(diào)控線粒體膜的通透性調(diào)節(jié)Cyc-C的釋放,進而調(diào)控細胞凋亡[12]。外在途徑則被TNFR-1(CD120a/p55)、Fas(CD95/Apo1)、DR3、DR4和CD5受體等表面死亡受體激活,通過死亡配體與死亡受體的相互作用,引起細胞凋亡。

大量研究表明miRNA在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Chang等[13]在大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型中發(fā)現(xiàn),過表達miR-195可使大鼠腦梗死的體積和神經(jīng)元細胞的缺失顯著減少。此研究同時發(fā)現(xiàn)miRNA-195通過抑制KLF5介導(dǎo)的JNK信號通路的激活,使得Bcl-2的表達增強,而Bax的表達減弱,促進神經(jīng)元的生長、發(fā)育、軸突再生和突觸重塑,減弱MCAO大鼠的神經(jīng)元凋亡。有研究證實JNK信號通路的激活有助于提高Bax的表達并降低Bcl-2的表達,從而誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞凋亡[14]。另外有報道m(xù)iR-137通過抑制Src基因使MAPK信號通路失活,減少MCAO小鼠腦組織中的細胞凋亡[15]。綜上所述,miRNA可以通過調(diào)控某些基因介導(dǎo)的JNK、MAPK等信號通路,影響細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達,從而調(diào)控腦神經(jīng)元細胞的細胞凋亡過程,為腦卒中的防治提供新的靶點。

長鏈非編碼RNA在調(diào)控缺血性腦卒中中的細胞凋亡中也發(fā)揮著重要的作用。如長鏈非編碼RNA MALAT1可以通過競爭性結(jié)合miR-145來影響水通道蛋白4(AQP4)的表達,促進細胞凋亡,從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[16]。MALAT1也可作為miR-205-3p的ceRNA,下調(diào)miR-205-3p的表達,從而調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子PTEN的表達,抑制缺血性腦卒中中的內(nèi)皮細胞凋亡,抑制MALAT1則會抑制細胞活力并增加OGD誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[17]。Guo等[18]證實lncRNA MIAT和REDD1在IS大鼠和氧糖剝奪再氧(OGD/R)誘導(dǎo)的PC12細胞損傷中的表達增加。他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)si-MIAT干擾后,實驗小鼠中的Bax表達降低,而Bcl-2的表達增加,抑制了神經(jīng)元細胞的凋亡。進一步實驗發(fā)現(xiàn)MIAT可以通過上調(diào)REDD1促進缺血性腦卒中中的神經(jīng)細胞凋亡,導(dǎo)致腦損傷[18]。有研究報道,過表達長鏈非編碼RNA RIAN可通過Rian/miR-144-3p/GATA3信號通路抑制腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡[19]。最近,Wang等[20]發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA HOTAIR可能通過抗凋亡在缺血性腦卒中發(fā)揮保護作用,同時提出lncRNA HOTAIR可能是疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標志物,但還需進一步的研究證實。綜上所述,lncRNA可以通過ceRNA機制競爭性結(jié)合miR-145,或直接調(diào)控相關(guān)基因REDD1、MALAT1的表達和阻斷相關(guān)信號通路等發(fā)揮作用,抑制或促進神經(jīng)元細胞的凋亡,同時還能做為生物標志物用于腦卒中的診斷和預(yù)防。

如上所述,非編碼RNAs可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)信號通路和基因的表達,或通過ceRNA機制,影響促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的生成,抑制神經(jīng)元細胞凋亡,改善缺血性腦卒中的預(yù)后,為腦缺血性腦卒中的防治提供新的靶點。非編碼RNAs也能促進神經(jīng)元細胞的凋亡,通過抑制特定的促凋亡ncRNA的調(diào)控作用,也能逆轉(zhuǎn)缺血性腦卒中造成的損傷。同時相關(guān)ncRNAs還能做為生物標志物,通過檢測其血清含量來判斷腦卒中的病情,用于腦卒中的診斷和預(yù)防。但目前非編碼RNA調(diào)控的確切機制還需要進一步闡明,作為生物標志物也還不成熟,需進一步的研究。

2.2 非編碼RNA參與調(diào)控腦卒中后氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是指體內(nèi)強氧化劑的形成與生理抗氧化能力之間的不平衡的一種狀態(tài)。強氧化劑如超氧化物(O2-)、羥基自由基(OH-)等在炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、自噬和血腦屏障(BBB)破壞引起的繼發(fā)性腦損傷中起著重要作用[21]。在腦缺血再灌注中,由于大量高度有害的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,引起氧化應(yīng)激,從而造成缺血再灌注損傷,導(dǎo)致腦組織損傷[22]。

越來越多的研究表明非編碼RNAs在調(diào)節(jié)氧化劑和抗氧化劑之間的平衡中,在ROS的生成調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[23]。在MACO小鼠模型中,Tian等[15]研究發(fā)現(xiàn)敲除miR-137可以顯著增加小鼠的腦梗死體積,同時miR-137的敲除也會增強小鼠腦組織中的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),使得ROS的濃度和TNF-α、IL-1、IL-6等的表達均升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-137是通過阻斷Src介導(dǎo)的MAPK信號通路來抑制氧化應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3P通過下調(diào)PIK3R1和抑制TGF-β信號傳導(dǎo)激活來抑制MACO小鼠中TNF-α、IL-6、IL-1β和丙二醛(MDA)的生成,增強CAT、錳超氧化物歧化酶(SOD)的活性,限制IS中的炎癥和氧化應(yīng)激。非編碼RNAs同時也能夠促進氧化應(yīng)激,有報道lncRNA RMST通過抑制miR-221-3P的表達和激活TGF-β途徑來增強IS[24]。綜上所述,非編碼RNAs可以通過調(diào)控MAPK信號通路或TGF-β途徑等,抑制炎癥因子和活性氧的生成,減輕氧化應(yīng)激的損傷。

氧化應(yīng)激在炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、自噬和血腦屏障破壞引起的繼發(fā)性腦損傷中起著重要的作用,通過調(diào)控氧化應(yīng)激損傷從而改善腦損傷顯得越發(fā)關(guān)鍵。越來越多的研究表明，非編碼RNAs對腦缺血相關(guān)氧化應(yīng)激損傷中轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控很重要,在缺血性腦卒中后氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)和控制病理事件中起著重要作用,但其在缺血性腦卒中后的氧化應(yīng)激損傷中的具體調(diào)控機制還存在爭議,仍有待探索。

2.3 非編碼RNA參與調(diào)控腦卒中后小膠質(zhì)細胞的激活 小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的常駐免疫細胞,能夠識別源自死亡細胞的多種危險信號、病原體、自身抗原及神經(jīng)遞質(zhì),發(fā)揮免疫監(jiān)視和吞噬功能[10]。在缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細胞被激活[25],形成兩種不同的表型,即經(jīng)典激活型M1和替代激活型M2。M1型小膠質(zhì)細胞主要發(fā)揮促進炎癥反應(yīng)的功能,通過促進IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子的釋放,加劇炎癥反應(yīng),導(dǎo)致不良后果[26]。Nishioku 等[27]研究發(fā)現(xiàn)激活的小膠質(zhì)細胞釋放的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可以誘導(dǎo)血腦屏障(BBB)功能障礙,增加血腦屏障的通透性,進一步促進神經(jīng)炎癥和腦水腫,導(dǎo)致嚴重的腦損傷。M2型小膠質(zhì)細胞通過分泌IL-4、IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和幾丁質(zhì)酶3樣蛋白3(CHI3L3)等抗炎細胞因子和生長因子發(fā)揮抗炎功能,促進腦組織細胞的修復(fù)和再生,實現(xiàn)對腦的保護作用[26]。大量的研究表明非編碼RNAs對小膠質(zhì)細胞的激活具有調(diào)控作用。Lian等[28]研究發(fā)現(xiàn)OGD/R組M1小膠質(zhì)細胞標記物iNOS、CD11b增加,而M2小膠質(zhì)細胞標記物Arg1和CD206的相關(guān)蛋白水平減少,敲除lncRNA NEAT1逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng),說明NEAT1可促進OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞M1型激活,增強炎癥因子的表達水平,促進OGD/R引起的炎癥反應(yīng)[28]。實驗還發(fā)現(xiàn),miR-374a-5p的下調(diào)可以提高CD11b和iNOS的蛋白水平,降低CD206和Arg1的蛋白水平,進一步實驗發(fā)現(xiàn)NEAT1通過靶向miR-374a-5p/NFAT5軸并抑制其表達,從而影響小膠質(zhì)細胞的激活[28]。SIRT1是一種煙酰胺腺苷二核苷酸依賴性蛋白去乙?；?可以調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。Li等[29]在Rice-Vannucci新生兒大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)miR-210可以通過靶向SIRT1和阻斷p65脫乙酰化來激活NF-κB信號通路,從而調(diào)節(jié)M1型小膠質(zhì)細胞的活化并增強HIE新生大鼠的神經(jīng)炎癥。Huang等也發(fā)現(xiàn)在MCAO大鼠模型中,抑制miR-210可以降低小膠質(zhì)細胞的活化[6]。Deng等[30]在MCAO/R動物模型和體外OGD/R BV2細胞模型中發(fā)現(xiàn),lncRNA Nespas表達顯著增加,而沉默Nespas則會加重大腦中動脈閉塞所致的I/R損傷和細胞凋亡。此外,研究還發(fā)現(xiàn)Nespas過表達會顯著抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生和OGD誘導(dǎo)的NF-κB的激活,抑制M1型小膠質(zhì)細胞的激活。Ren等[31]以缺氧/復(fù)氧(hypoxia/re-oxygenation,H/R)損傷的人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMVECs)為模型,發(fā)現(xiàn)沉默circ-Memo1可以也能抑制NF-κB信號通路的激活,從而抑制M1型小膠質(zhì)細胞激活,減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。綜上所述,非編碼RNA可以通過miR-374a-5p/NFAT5軸、NF-κB信號通路等,調(diào)控小膠質(zhì)細胞M1型和M2型的激活,從而在缺血性腦卒中導(dǎo)致的腦損傷發(fā)揮不同的作用。

M1型和M2型小膠質(zhì)細胞對炎癥反應(yīng)有不同的作用,對缺血性腦卒中的預(yù)后也不一樣。非編碼RNAs可以抑制小膠質(zhì)細胞M1型和促進M2型的激活,抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),改善缺血性腦卒中導(dǎo)致的腦損傷,這為臨床檢測和防治缺血性腦卒中提供了新的思路和方法,但ncRNAs調(diào)控小膠質(zhì)細胞M1型和M2型的激活的具體機制仍不是很清楚,需要不斷探索。

2.4 非編碼RNA參與調(diào)控腦卒中后血管新生 缺血性腦卒中主要由腦血管阻塞引起局灶性腦缺血缺氧,進而導(dǎo)致腦損傷。因此,及時恢復(fù)或改善缺血腦區(qū)的血流供應(yīng)對于腦卒中的結(jié)局和功能恢復(fù)至關(guān)重要。缺血性腦卒中后的血管新生,可以促進側(cè)支循環(huán)并恢復(fù)缺血區(qū)域的血液供應(yīng),減輕缺血性損傷引起的缺血性壞死并逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種典型的促血管生成因子,在血管新生中起著關(guān)鍵的作用。VEGF可以促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移,誘導(dǎo)相應(yīng)的配體和受體在內(nèi)皮細胞上的表達[32]。內(nèi)皮細胞參與血管生成,可以增殖形成新血管和遷移以延長血管[32]。

Liang等[33]在大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠和體外缺氧-葡萄糖剝奪腦微血管內(nèi)皮細胞(BMECs)中發(fā)現(xiàn)miRNA-26a的表達顯著增加。同時通過實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-26a mimic的BMECs增殖明顯增強,而轉(zhuǎn)染miRNA-26a inhibitor的BMECs增殖明顯抑制,提示miRNA-26a可調(diào)控腦梗死后微血管內(nèi)皮細胞和血管生成。此外,實驗還發(fā)現(xiàn)過表達miRNA-26a可增強VEGF mRNA的表達,而抑制miRNA-26a可降低VEGF mRNA的表達,提示miRNA-26a可調(diào)控VEGF。進一步實驗證實miR-26a可通過調(diào)控VEGF的表達,從而調(diào)控腦梗死后BMECs內(nèi)皮管腔形成,促進MCAO大鼠的血管生成,改善缺血性腦卒中的預(yù)后[33]。有報道稱,在MACO大鼠模型中,miR-15a和miR-16-1的表達明顯增加,而抑制miR-15a和miR-16-1發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的蛋白表達明顯增加。進一步實驗發(fā)現(xiàn)選擇性缺失miR-15a和miR-16-1可以促進血管重塑和刺激功能性血管的新生,從而增強卒中后血管生成,并增加同側(cè)腦血流量[34]。同時也有實驗以O(shè)GD/R損傷的小鼠BMEC為實驗對象,發(fā)現(xiàn)小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)可以通過調(diào)節(jié)VEGF表達來促進缺血性腦卒中后的血管生成[35]。circRNA對缺血性腦卒中后血管生成的調(diào)節(jié)作用也不容忽視。有報道在OGD/R處理的人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)模型中,發(fā)現(xiàn)環(huán)狀非編碼RNA circ_0006768表達水平下降,而過表達circ_0006768可以通過富集VEZF1來減輕OGD/R誘導(dǎo)的HBMEC損傷[36]。VEZF1可以通過增強內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管網(wǎng)絡(luò)形成來促進血管生成[37]?？傊?非編碼RNAs是可以通過調(diào)控VEGF、VEZF1等促進缺血性腦卒中后的血管生成,恢復(fù)或改善缺血區(qū)域的血液供應(yīng),緩解缺血性壞死,改善腦卒中患者的神經(jīng)恢復(fù)。

綜上所述,VEGF、VEZF1等對血管的生成具有促進作用,非編碼RANs可以通過調(diào)控VEGF、VEZF1等的生成,促進缺血性腦卒中后的血管生成,進而恢復(fù)或改善缺血區(qū)域的血液供應(yīng)。這是促進缺血性腦卒中后功能恢復(fù)的一種有效的方法,但其中的具體機制尚不是很明確,需要進一步研究。

3 總 結(jié)

本文就非編碼RNAs在缺血性腦卒中的作用機制進行了簡單地總結(jié)與概括。闡述了非編碼RNAs在細胞凋亡、氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細胞的激活和血管保護與再生中的調(diào)控機制,為提高缺血性腦卒中的臨床防治水平提供一定的理論依據(jù)和治療靶點,同時也可能作為疾病診斷和預(yù)后的非侵入性生物標志物。但目前仍然有一些問題沒有得到解決,如缺血半暗帶中的神經(jīng)元恢復(fù)的具體措施,非編碼RNAs調(diào)控VEGF、VEZF1和小膠質(zhì)細胞M1型向M2型轉(zhuǎn)移的具體機制等。現(xiàn)有的將非編碼RNAs與缺血性腦卒中聯(lián)系起來的研究大多是在MCAO嚙齒類動物模型和體外OGD/R模型中進行的,如何將研究成果轉(zhuǎn)化臨床實踐還需要大量的研究探索。