魏朝宇，汪小冬，魏秀英，袁 鴻，姚紅艷，陳敦學(xué)*

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025; 2. 貴州大學(xué) 漁業(yè)資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025;3. 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室(貴州大學(xué))，貴州 貴陽 550025;4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院, 湖南 長沙 410128)

棘胸蛙Quasipaaspinosa又名石蛙、石雞等，隸屬兩棲綱Amphibian無尾目Anura叉舌蛙科Dicroglossinae棘胸蛙屬Q(mào)uasipaa，主要分布在中國南方八省[1]。由于生態(tài)環(huán)境破壞和過度捕抓，棘胸蛙野生資源急劇減少，目前已被中國物種紅色名錄列為易危等級[2-3]。棘胸蛙蛙肉具有高蛋白和低脂肪的特點，被認為是藥補、食補佳品，市場需求旺盛[4]。為了滿足人們對蛙肉的需求，減少對野生資源的消耗，我國從20世紀80年代開始進行人工養(yǎng)殖，但主要采取“野外捕撈，就地繁養(yǎng)”模式，對繁殖群體缺乏遺傳特征分析[2]，容易造成近親繁殖，導(dǎo)致棘胸蛙出現(xiàn)個頭小、抗病性差等問題[5]，因此，迫切需要對棘胸蛙養(yǎng)殖群體開展遺傳多樣性研究，評估棘胸蛙養(yǎng)殖群體的遺傳現(xiàn)狀，為提高養(yǎng)殖效益和選育棘胸蛙良種提供數(shù)據(jù)支撐。目前，養(yǎng)殖群體遺傳多樣性研究在魚類中開展得較多，普遍認為養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于野生群體[6-9]。對棘胸蛙遺傳多樣性的研究依然很少，且主要集中在野生群體的研究，例如，劉南君等[10]采用RAPD技術(shù)分析貴州省寬闊水域棘胸蛙遺傳多樣性，認為貴州省棘胸蛙具有較高水平的遺傳多樣性和環(huán)境適應(yīng)能力；王茂元等[11]采用GBS技術(shù)，證明福建南平棘胸蛙種群已表現(xiàn)出雜合度降低、遺傳多樣性下降等趨勢；Zheng等[12]運用15個SSR位點對棘胸蛙2個群體進行分析，結(jié)果揭示棘胸蛙具有較高的多態(tài)性；Ye等[13]利用線粒體基因(12S rRNA 和16S rRNA)證明棘胸蛙具有很高的遺傳多樣性。

由于缺乏對養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源的研究，目前棘胸蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展依舊存在隱患。選擇合適的分子標記將有助于我們了解物種的遺傳特征，進而推動種質(zhì)資源開發(fā)與創(chuàng)新利用[14]。微衛(wèi)星又稱簡單重復(fù)序列，主要由高突變的核心序列和保守的側(cè)翼序列組成，具有數(shù)量多、分布廣泛且均勻、雜合率高、重復(fù)性好且數(shù)據(jù)易統(tǒng)計等優(yōu)點[15]，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物種質(zhì)資源評估、群體遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定等方面[12,16]。截止2021年7月，NCBI數(shù)據(jù)庫公布的棘胸蛙SSR位點僅31個，遠不足以評價棘胸蛙遺傳多樣性。因此，本研究通過轉(zhuǎn)錄組篩選棘胸蛙9對有效SSR位點，并依托9個位點對5個養(yǎng)殖群體棘胸蛙(148個樣本)進行遺傳多樣性分析，闡明棘胸蛙養(yǎng)殖群體的遺傳現(xiàn)狀，以期為棘胸蛙種質(zhì)資源開發(fā)利用和良種培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗所用棘胸蛙蝌蚪采自江西明月山石蛙養(yǎng)殖股份有限公司(江西群體30尾)、浙江雙吉山養(yǎng)殖有限公司(浙江群體30尾)、廣西賀州全宇石蛙養(yǎng)殖專業(yè)合作社(廣西群體28尾)、廣東清遠市盈信農(nóng)業(yè)有限公司(廣東群體30尾)、福建德化雙全農(nóng)業(yè)有限公司(福建群體30尾)，共計148尾。樣本用無水乙醇浸泡，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

取少量的肌肉，用基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技有限公司)并參照說明書進行DNA提取，提取后的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星DNA引物設(shè)計與合成

用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)棘胸蛙潛在的SSR位點，選擇SSR兩端序列長度≥50 bp且堿基重復(fù)類型為2堿基重復(fù)與3堿基重復(fù)的序列，primier 5.0進行引物設(shè)計；隨機挑選50對引物進行驗證，以浙江(ZJ)群體棘胸蛙基因組DNA為模板擴增，以產(chǎn)生穩(wěn)定擴增條帶且條帶大小與預(yù)期一致為篩選依據(jù)。共篩選到15對引物，進而將擴增產(chǎn)物用 8% 非變性聚丙烯酰胺電泳和硝酸銀染色觀察，根據(jù)條帶穩(wěn)定情況，篩選出9對引物(見表1)。

表1 9對微衛(wèi)星位點信息Tab. 1 Information of 9 microsatellite loci

1.4 PCR擴增

將篩選得到的9對引物分別在148個樣品中進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Tap PCR Master Mix(MT201，博邁德生物，中國)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，引物在各自合適的退火溫度下退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠檢測擴增效果。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染

擴增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，產(chǎn)物上樣量為2 μL，內(nèi)外電泳槽各加入1×TBE電泳緩沖液，設(shè)置電壓180 V，電流150 mA，電泳5 h后，硝酸銀染色并觀察其條帶情況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Popgen32軟件計算各位點的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、近交系數(shù)(Fis)、遺傳分化系數(shù)(Fst)及Hardy-Weinberg平衡檢驗。用Cervus計算各位點的多態(tài)信息含量(PIC)?；谌后w間的Nei’s遺傳距離使用MEGA構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點的多態(tài)性

9對引物在棘胸蛙5個養(yǎng)殖群體中共檢測到46個等位基因，詳見表2。各位點等位基因數(shù)為4～9個，平均為5.111個。其中，引物W115檢測到的等位基因數(shù)最多，為9個。各位點的有效等位基因數(shù)介于1.731～5.291，均值為2.702。觀測雜合度在0.007～0.322，平均值為0.182。期望雜合度介于0.423～0.815，平均值為0.589。9對引物的多態(tài)信息含量介于0.392～0.789，平均值為0.536。其中，引物W128、W115、W212和W103表現(xiàn)為高度多態(tài)位點，其余為中度多態(tài)性。

表2 9個位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 2 Genetic diversity indices of 9 microsatellite loci in five cultured populations

從群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)和遺傳分化系數(shù)(Fst)來看，近交系數(shù)在引物W276(-0.147)表現(xiàn)為負值，其余均為正值，平均值為0.523。遺傳分化系數(shù)在0.070～0.717，平均值為0.332。位點W326的遺傳分化系數(shù)為中度分化(0.05～0.15)，其余位點均為高度分化。平均總遺傳分化系數(shù)為0.332(遺傳分化系數(shù)大于0.15)，屬于高度分化。

2.2 棘胸蛙群體的遺傳多樣性

分析9個SSR位點在5個養(yǎng)殖群體中的多態(tài)性，結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)5個群體的平均等位基因數(shù)(Na)為2.889～3.444，其中廣東群體最少，江西群體最多。有效等位基因數(shù)(Ne)平均為1.737～2.131，江西群體最少，廣西群體最多，5個養(yǎng)殖群體的總體平均值為1.945。5個群體 PIC值平均在0.312～0.400，平均值為0.355，其中江西群體最低，浙江群體最高。5個養(yǎng)殖群體的觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.130～0.230和0.353～0.468。其中浙江群體的Ho和He均達到最大值，而觀測雜合度和期望雜合度的最小值分別出現(xiàn)在福建群體和江西群體(表3)。

表3 5個群體在9個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 3 Genetic diversity indices of 9 microsatellite loci in different cultured populations

2.3 群體間遺傳相似度和聚類分析

不同養(yǎng)殖群體棘胸蛙的遺傳相似度和遺傳距離存在較大差異，其中：廣東和廣西遺傳相似度最高(0.819)，遺傳距離最近(0.200)；福建和江西的遺傳相似度最低(0.441)，遺傳距離最遠(0.819)(表4)。利用MEGA軟件構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示，廣東群體和廣西群體聚為一支，而后再與福建群體聚在一起，而浙江和江西群體聚為一支，具有明顯的地理區(qū)系(圖1)。

圖1 基于Nei’s無偏遺傳距離構(gòu)建的5個棘胸蛙養(yǎng)殖群體UPGMA樹Fig. 1 UPGMA dendrogram of five cultured populations of Q. spinosa based on Nei’s

表4 5個棘胸蛙養(yǎng)殖群體的遺傳相似度和遺傳距離Tab. 4 Genetic distance genetic similarity of 5 cultured populations of Q. spinosa

進一步利用AMOVA軟件進行群體內(nèi)和群體間的遺傳變異分析，結(jié)果顯示，有70.95%的遺傳變異來自群體內(nèi)，而群體間的變異為29.05%，群體內(nèi)的變異大于群體間的變異(表5)。

表5 5個棘胸蛙群體的方差分析Tab. 5 AMOVA analysis among five Q. spinosa populations

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

利用Popgen軟件，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡(HWE平衡)的卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，在棘胸蛙5個養(yǎng)殖群體，9個多態(tài)性SSR位點組合而來的45個位點中，大部分都偏離了平衡狀態(tài)，呈現(xiàn)極顯著偏離 HWE 平衡(30個位點)，僅有11個位點未偏離HWE 平衡，另有4個位點為單倍性位點，未進行HWE 平衡分析(表6)。江西、浙江、廣西、廣東和福建5個養(yǎng)殖群體中，分別有5、8、8、5、4個位點偏離了HWE 平衡。此外，有2對引物(W326和W115)在5個養(yǎng)殖群體中均偏離HWE 平衡。

表6 5個群體在9個微衛(wèi)星位點的Hardy-Weinberg平衡分析Tab. 6 Hardy-Weinberg equilibrium of 5 populations at 9 microsatellite loci

3 討論

3.1 多態(tài)信息含量及基因雜合度分析

多態(tài)性信息含量是描述遺傳多樣性的指標，標志著群體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力和生存能力[17-18]。一般認為，多態(tài)性信息含量大于0.5時，該位點表現(xiàn)為高度多態(tài)性；當多態(tài)性信息含量介于0.25與0.5之間時，為中度多態(tài)性；而當多態(tài)性信息含量小于0.25時，則表現(xiàn)為低多態(tài)性[19]，不適合直接作為育種材料。本文選取的9個SSR位點中，多態(tài)信息含量平均值為0.536，其中有5個位點屬于中度多態(tài)性，4個位點屬于高度多態(tài)性，據(jù)此我們認為5個棘胸蛙養(yǎng)殖群體整體呈現(xiàn)中度偏高的多態(tài)性。本文結(jié)果與課題組利用SSR長度多態(tài)性分析研究的結(jié)果[20 ]一致。Zheng等[12](微衛(wèi)星標記)和劉南君等[10](RAPD分析)均認為棘胸蛙具有較高的遺傳多樣性，由于實驗群體為人工養(yǎng)殖群體，因人為干擾、近親繁殖等，導(dǎo)致多態(tài)性下降。類似現(xiàn)象在其他物種中也有報道，例如斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus[21]、斑節(jié)對蝦Penaeusmonodon[22]、許氏平鲉Sebastesschlegeli[23]和金邊鯉Cyprinuscarpiovar. Jinbian[24]等。

基因雜合度是衡量群體遺傳變異的最適參數(shù)[25-26]，雜合度可以分為觀測雜合度和期望雜合度，當觀測雜合度與期望雜合度值相近時，表明外部環(huán)境選擇及近交等因素對該物種遺傳變異影響較小，此時群體內(nèi)處于遺傳平衡狀態(tài)[27]。本研究分析5個群體的期望雜合度和觀測雜合度，發(fā)現(xiàn)期望雜合度(0.589)遠遠高于觀測雜合度(0.182)；進一步分析每個群體間的雜合度，發(fā)現(xiàn)各個群體內(nèi)部的期望雜合度均高于觀測雜合度，其中以福建群體的期望雜合度與觀測雜合度差別最大，達到2.88倍。類似現(xiàn)象在很多人工養(yǎng)殖(選育)群體中均有發(fā)現(xiàn)，例如中華絨螯蟹[8]、黃顙魚[9]、鳙魚[28]、大口黑鱸[29]等，可能是由于人工養(yǎng)殖群體近親繁殖普遍存在而使群體發(fā)生純合反應(yīng)，導(dǎo)致雜合度降低，物種對環(huán)境變化適應(yīng)性減低[30]。因此，在人工養(yǎng)殖棘胸蛙的過程中，應(yīng)盡量擴大選育范圍，避免近親繁殖，同時，建議定期從外地良種場引進良種作為繁殖親本，以提高親本遺傳多樣性。

3.2 遺傳距離與遺傳分化系數(shù)相關(guān)性分析

遺傳距離是衡量群體間遺傳關(guān)系的指標，一般來說群體遺傳距離越近，遺傳相似度越大，則親緣關(guān)系越近[31-32]，并認為遺傳相似度大于0.5時，此時群體間的親緣關(guān)系為一級親緣關(guān)系[22]。本實驗中，廣西和江西群體、廣東和江西群體、福建和江西群體、福建與浙江群體的遺相似度較低(小于0.5)，可能與群體的地理位置有關(guān)；進一步構(gòu)建群體遺傳的UPGMA進化樹，發(fā)現(xiàn)江西與廣東、廣西、福建群體遺傳距離較遠，同時福建與浙江群體遺傳距離也較遠，聚類分析結(jié)果與地理位置分布相吻合。

基因遺傳分化系數(shù)(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。Balloux等[32]認為，當群體間Fst值大于0.25時，表示群體間的遺傳分化極大。在我們選取的5個養(yǎng)殖群體中，平均Fst值達到0.332，顯示棘胸蛙的5個養(yǎng)殖群體已經(jīng)呈現(xiàn)較大的遺傳分化。同時進行的分子方差分析結(jié)果顯示：棘胸蛙遺傳變異，大部分來自群體內(nèi)個體之間，來自群體間的僅占29.05%。

3.3 HWE平衡分析

HWE平衡檢驗被廣泛應(yīng)用于分析群體遺傳進化、結(jié)構(gòu)特征[33]以及定位重要功能基因等方面[34]。在本文構(gòu)建的45個SSR位點中，有30個位點極顯著地偏離了HWE平衡，偏離率達到66.67%，遠遠高于鱖的野生群體(21.67%)[35]。相較而言，養(yǎng)殖群體的HWE平衡偏離率往往比較高，例如軍曹魚Rachycentroncanadum偏離率達到53.13%[36]、克氏原螯蝦Procambarusclarkii偏離率達到82.5%[37]、紅羅非魚偏離率達到90%[31]、蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis偏離率達到77.5%[38]等，可能是由于人工養(yǎng)殖過程中，奠基者效益以及非隨機交配較嚴重，導(dǎo)致群體中純合子增加，雜合子缺失，使養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)遭到破壞。本文進一步分析5個養(yǎng)殖群體的偏離情況，發(fā)現(xiàn)浙江和廣西群體HWE平衡偏離率較高，人工選擇力度較低。

4 結(jié)論

本文利用9對引物在5個棘胸蛙養(yǎng)殖群體中進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示：棘胸蛙5個養(yǎng)殖群體呈現(xiàn)中度偏高的遺傳多樣性，群體間呈現(xiàn)高度分化，而群體內(nèi)部則出現(xiàn)遺傳多樣性降低的現(xiàn)象，且嚴重偏離HWE 平衡，推測可能是瓶頸效益和奠基者效益導(dǎo)致了近親繁殖現(xiàn)象。因此，建議在人工養(yǎng)殖棘胸蛙的過程中，應(yīng)盡量擴大選育范圍，避免近親繁殖，同時，定期從外地良種場引進良種作為繁殖親本，提高親本遺傳多樣性。