陳雅靜，張桐瑋，周 俊，陳舒曼，蒲仕明*

(1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣西 桂林 541006；2.廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室(廣西師范大學(xué)),廣西 桂林 541004;3.廣西師范大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 桂林 541004;4. 廣西珍稀瀕危動物生態(tài)學(xué) 重點實驗室(廣西師范大學(xué)), 廣西 桂林 541006)

惡性黑色素瘤是最具侵襲性的癌癥之一，其發(fā)病率呈不斷增加趨勢[1-2]。近年來，黑色素瘤相關(guān)研究進(jìn)展很快，例如Nivolumab作為一種抗PD-1抗體，有助于提高對癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)，已被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期黑色素瘤[3]。其他免疫療法，例如monalizumab——一種增強NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞活性的人源化抗NKG2A抗體，也在開發(fā)中[4]。盡管使用了包括靶向療法和免疫療法在內(nèi)的不同治療方法，但黑色素瘤患者的預(yù)后仍較差。

目前，已報道了多個指導(dǎo)黑色素瘤個體化治療的預(yù)后模型[5]。研究表明，腫瘤厚度與患者存活率之間存在極高的相關(guān)性[6]。早期識別、積極治療潰瘍和密切隨訪對于黑色素瘤的預(yù)防和改善預(yù)后至關(guān)重要[7]。有無前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是臨床Ⅰ期和Ⅱ期黑色素瘤中的獨立預(yù)后因素[8]。然而，這些根據(jù)患者臨床特征，包括腫瘤的厚度、是否伴隨潰瘍和原發(fā)腫瘤的部位等基于組織學(xué)特征構(gòu)建的預(yù)后模型并不能很好地預(yù)測每個個體的腫瘤預(yù)后[9-10]。

近年來，眾多研究相繼發(fā)現(xiàn)了一系列與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志，例如特異基因的異常表達(dá)(包括蛋白質(zhì)和mRNA水平)與非編碼lncRNA和miRNA等。許多研究還發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)因子m6A通過調(diào)節(jié)lncRNA來影響癌癥的進(jìn)展和預(yù)后[11]。例如，一些lncRNAs可以區(qū)分黑色素瘤的亞型并預(yù)測其生存情況。過表達(dá)的lncRNA HCP5還可以在體外降低黑色素瘤細(xì)胞惡變的概率，這可能與RARRES3上調(diào)有關(guān)[12]；血清微miRNA作為黑色素瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[13]。然而，僅使用一種生物標(biāo)志物來預(yù)測患者預(yù)后的敏感性和特異性并不能達(dá)到理想效果，使用多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的預(yù)后模型將在黑色素瘤患者的診斷和預(yù)后中顯示出巨大的潛力。

TCPA(the cancer proteome atlas，https:∥www.tcpaportal.org/)是一個患者腫瘤樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫，TCGA(the cancer tenome atlas，https:∥portal.gdc.cancer.gov/)則是癌癥患者的臨床特征數(shù)據(jù)庫。近來，許多研究人員對這2個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聯(lián)合分析，建立了不同腫瘤的蛋白質(zhì)預(yù)后模型，發(fā)現(xiàn)可以很好地預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后。Fang等[14]利用Kaplan-Meier生存分析、單變量和多變量Cox分析，建立了肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSCC)患者的預(yù)后預(yù)測模型。根據(jù)風(fēng)險模型中每個蛋白質(zhì)的系數(shù)計算出每個患者的風(fēng)險值，能有效預(yù)測LUSCC患者的預(yù)后。 Tian等[15]通過利用TCPA、GEO(gene expression omnibus)和TCGA獲得了成人腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)患者的RPPA數(shù)據(jù)、基因表達(dá)譜和臨床信息，并結(jié)合上海癌癥中心免疫組合數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，建立綜合預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)(IPRPs)模型。該預(yù)后模型在多隊列中顯示出比其他生物標(biāo)志物(Ki-67、β-catenin等)更強的預(yù)測價值，提示了利用TCPA和TCGA等數(shù)據(jù)庫建立的疾病預(yù)后模型，對腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)風(fēng)險與腫瘤治療預(yù)后具有較好的指導(dǎo)意義。本文通過TCPA和TCGA這2個數(shù)據(jù)庫建立一個基于11種蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)預(yù)后模型，并通過B16黑色素瘤細(xì)胞系開展相關(guān)試驗，對部分蛋白質(zhì)的風(fēng)險相關(guān)性進(jìn)行驗證。該模型的建立擬為黑色素瘤患者的預(yù)后判斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

黑色素瘤蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)據(jù)集TCGA-SKCM-L4于2020年3月23日從TCPA下載，該數(shù)據(jù)集由354個樣本組成。與之相關(guān)的臨床特征數(shù)據(jù)從TCGA下載，并選擇TCGA和TCGA-SKCM選項。該數(shù)據(jù)集由344個樣本組成，包含各種臨床特征的信息，包括生存狀態(tài)(0=存活，1=死亡)、生存時間(d)、年齡、性別、分級和TNM分期。

1.2 生物信息學(xué)分析

本文使用R語言生存包中Kaplan-Meier(KM)和Cox比例風(fēng)險分析統(tǒng)計方法，確定蛋白質(zhì)表達(dá)與黑色素瘤預(yù)后的關(guān)系。簡單地說，根據(jù)蛋白質(zhì)中位表達(dá)水平將樣本分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。比較低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存狀態(tài)和生存時間，用KM統(tǒng)計方法計算P值，P<0.05被視為有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Cox法計算P值，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用Cox方法計算危險比(HR)和P值，并用于生成火山圖，使用ggplot2和ggrepel軟件包將數(shù)據(jù)繪制在圖表上。HR值>1的蛋白質(zhì)被認(rèn)為與高風(fēng)險相關(guān)，HR值<1的蛋白質(zhì)被認(rèn)為與低風(fēng)險相關(guān)。

采用多因素Cox分析，以生存狀態(tài)和生存時間為因變量，以蛋白質(zhì)表達(dá)為自變量，生成基于蛋白質(zhì)的預(yù)后模型。采用雙向步驟對模型作進(jìn)一步優(yōu)化。利用11種蛋白質(zhì)及其系數(shù)建立預(yù)測模型。隨后，使用這種預(yù)后模型計算所有患者的風(fēng)險評分和中位風(fēng)險評分，并將患者分組：患者風(fēng)險評分大于中位風(fēng)險評分的為高危組，其余患者為低危組[16-17]。

使用survival和survminer軟件包進(jìn)行基于預(yù)后模型中的11種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)生存分析。計算中位蛋白質(zhì)表達(dá)量，將蛋白質(zhì)水平高于中位的患者歸為高表達(dá)組，其余患者分為低表達(dá)組；比較高、低表達(dá)組的生存狀態(tài)和存活時間，使用每個患者的風(fēng)險評分進(jìn)行風(fēng)險生存分析，并比較高危和低?；颊叩纳鏍顟B(tài)和生存時間。

風(fēng)險分析是通過對患者的風(fēng)險評分進(jìn)行排序而實現(xiàn)[18]。按照排序，將每個患者的蛋白質(zhì)表達(dá)情況和生存狀態(tài)顯示在熱圖中。生存包用于單因素Cox和多因素Cox模型的單因素和多因素獨立預(yù)后分析，這些因素對生存狀態(tài)和時間的影響用HR值和P值顯示，并使用森林圖進(jìn)行可視化。

采用生存ROC軟件包繪制ROC曲線。基于KM分析，使用危險度評分和其他因素來預(yù)測生存狀態(tài)和時間，估計時間為1 a。隨后，計算假陽性率和真陽性率，繪制ROC曲線，計算AUC值。蛋白質(zhì)共表達(dá)分析采用相關(guān)性檢驗，以預(yù)測與模型中蛋白質(zhì)共表達(dá)的其他蛋白質(zhì)。相關(guān)系數(shù)和P值濾波器分別為0.4和0.001。對滿足過濾條件的蛋白質(zhì)進(jìn)行保存并繪制相關(guān)圖。使用ggplot2和ggalluvial繪制桑基圖，以顯示蛋白質(zhì)與預(yù)后模型中蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

使用添加10%胎牛血清的RPMI-1640進(jìn)行B16黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)。GATA6和X1433ZETA過表達(dá)慢病毒購自南京Abmgood公司，并使用MOI為10的比例進(jìn)行慢病毒感染。在熒光顯微鏡下監(jiān)測GFP的表達(dá)，確定基因轉(zhuǎn)移效率。

1.4 細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移實驗如文獻(xiàn)[19]所述。將感染GATA6、X1433ZETA或?qū)φ章《镜募?xì)胞接種到含有聚乙烯吡咯烷酮涂層的聚碳酸酯過濾器(8 μm孔徑)的24孔小室中，并評估其遷移能力。小室下方的孔中加入添加0.1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞(無血清)接種到小室。培養(yǎng)24 h后，固定小室下方的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色。

1.5 凋亡測定

細(xì)胞凋亡檢測方法如文獻(xiàn)[20]所述。先重懸細(xì)胞，隨后用5 μL Annexin-V和5 μL PI孵育15 min(避光)。流式細(xì)胞術(shù)分析各組凋亡早期細(xì)胞(Annexin V+/PI-)和晚期細(xì)胞(Annexin V+/PI+)的比例。

1.6 腫瘤生長分析

腫瘤生長分析如文獻(xiàn)[21]所述。將1.5×106個GATA6或X1433ZETA過表達(dá)的B16黑色素瘤癌細(xì)胞注射到6～8周齡的雌性C57BL/6J小鼠皮下。一周后，每隔一天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，計算公式為:體積=0.5×寬2×長。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定黑色素瘤預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)

使用Kaplan-Meier (KM)和Cox(比例風(fēng)險模型)生存包分析與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)，樣本分組為高表達(dá)或低表達(dá)(相對于中位表達(dá))。比較低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存時間和狀態(tài)。計算P值和HR值，HR值>1表明與高危相關(guān)，HR值<1表明與低風(fēng)險相關(guān)，用P值和HR值繪制火山圖。如圖1所示，與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)的蛋白質(zhì)有52個，其中蛋白質(zhì)高表達(dá)和低表達(dá)的患者預(yù)后有顯著差異(P<0.05為顯著差異，有統(tǒng)計學(xué)意義)。

圖1 黑色素瘤預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)的火山圖Fig. 1 Volcano map of melanoma prognosis-related proteins

2.2 構(gòu)建蛋白質(zhì)預(yù)測模型

采用生存包中多因素Cox分析構(gòu)建蛋白質(zhì)預(yù)后模型，鑒定出11個蛋白質(zhì)及其系數(shù)(表1)，其中GATA6、P27、S6、CD20的系數(shù)較小，X1433ZETA、P21、YAP的系數(shù)較大，表明GATA6與低風(fēng)險相關(guān)，X1433ZETA與高風(fēng)險相關(guān)。

表1 黑色素瘤預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)及其系數(shù)Tab. 1 Melanoma prognosis-related proteins and their coefficients

患者風(fēng)險評分計算方法:風(fēng)險評分=∑[表達(dá)(蛋白)×系數(shù)]。根據(jù)每個患者的風(fēng)險評分以及中位風(fēng)險評分，將患者分為高風(fēng)險組或低風(fēng)險組。通過比較蛋白質(zhì)表達(dá)水平高的患者和表達(dá)水平低的患者的預(yù)后，該模型的有效性得到了驗證。圖2顯示：LCK、P27、S6、SRC_pY416、CD20、CD49B和GATA6與低風(fēng)險相關(guān)，因為這些蛋白質(zhì)水平高的患者預(yù)后較好；CKIT、P21、YAP和X1433ZETA與高危相關(guān)，這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平高的患者預(yù)后較差。

圖2 黑色素瘤預(yù)后與11種預(yù)后模型蛋白質(zhì)表達(dá)的關(guān)系Fig. 2 Prognosis of melanoma in relation to protein expression in 11 prognostic models

2.3 利用蛋白質(zhì)預(yù)后模型確定預(yù)后

首先，為檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，本文進(jìn)行了風(fēng)險分析，結(jié)果如圖3所示：風(fēng)險評分高的患者預(yù)后較差。低風(fēng)險評分患者的5年生存率大于75%，而高風(fēng)險評分患者的5年生存率低于50%(P=5.49×10-6)。這顯示了該模型的可靠性。

圖3 黑色素瘤預(yù)后與風(fēng)險評分的關(guān)系Fig. 3 Prognosis of melanoma in relation to risk score

接下來，使用這個模型分析每個病人的預(yù)后。如圖4所示，根據(jù)風(fēng)險評分對患者進(jìn)行排序，風(fēng)險評分的增加與死亡的增加相關(guān)。此外，這11種蛋白在低?；颊吆透呶；颊咧械谋磉_(dá)存在顯著差異。高危相關(guān)蛋白CKIT、P21、X1433ZETA在高危評分患者中高表達(dá)，而低危相關(guān)蛋白LCK、P27、S6、SRC_pY416、CD20、GATA6主要在低危評分患者中表達(dá)。

然后，我們使用單因素Cox和多因素Cox模型進(jìn)行單因素和多因素獨立預(yù)后分析，以確定預(yù)后相關(guān)因素。在單因素獨立預(yù)后模型中，腫瘤分期、TNM分型、風(fēng)險評分與預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。而在多因素獨立預(yù)后分析中，風(fēng)險評分和TNM分型與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)；風(fēng)險評分的HR值為1.759(1.329～2.328)，大于其他因素。采用ROC曲線分析進(jìn)行預(yù)測效率評價，風(fēng)險評分的AUC得分最大，為0.761分(圖4c)，說明風(fēng)險評分相對于其他特征因素是更好的預(yù)測因子。

圖4 單因素和多因素獨立預(yù)后分析及與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)因素的ROC曲線Fig. 4 Univariate and multifactorial independent prognostic analyses and ROC curves of factors associated with melanoma prognosis

因為這11種蛋白質(zhì)不是分泌蛋白質(zhì)，它們的水平只能在腫瘤組織中測量，因此，我們作進(jìn)一步分析，以確定是否有分泌蛋白質(zhì)與這11個蛋白質(zhì)共表達(dá)。為了避免共表達(dá)蛋白質(zhì)過多，相關(guān)系數(shù)和P值過濾分別設(shè)置為0.4和0.001。上述過濾條件鑒定出了與11個模型蛋白質(zhì)共表達(dá)的65個蛋白質(zhì)，與11個模型蛋白質(zhì)高度相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)有4個，詳見圖5。

圖5 通過相關(guān)分析鑒定了與預(yù)后模型共表達(dá)的4個分泌蛋白質(zhì)Fig. 5 Four secreted proteins co-expressed with the prognostic model were identified by correlation analysis

?；鶊D(圖6)顯示了蛋白質(zhì)共表達(dá)模式。其中GATA6與最多的蛋白質(zhì)共表達(dá)，而X1433ZETA僅與PEA15共表達(dá)。

左側(cè)為預(yù)后模型里的蛋白質(zhì)，右側(cè)是與模型蛋白質(zhì)共表達(dá)的蛋白質(zhì)。有最多共表達(dá)蛋白質(zhì)的是GATA6，X1433ZETA僅與PEA15共表達(dá)圖6 共表達(dá)蛋白質(zhì)與預(yù)后模型蛋白質(zhì)的相關(guān)性Fig. 6 Correlation of co-expressed proteins with prognostic model proteins

2.4 確定X1433ZETA蛋白質(zhì)和GATA6蛋白質(zhì)作用

為了驗證GATA6和X1433ZETA蛋白質(zhì)的作用，采用慢病毒感染方法在B16黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)GATA6和X1433ZETA，然后檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移。結(jié)果顯示，過表達(dá)GATA6可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而X1433ZETA過表達(dá)對細(xì)胞凋亡無影響；過表達(dá)X1433ZETA可促進(jìn)細(xì)胞遷移，但過表達(dá)GATA6可抑制細(xì)胞遷移(圖7)。

圖7 GATA6和X1433ZETA過表達(dá)對B16黑色素瘤細(xì)胞凋亡和遷移的影響Fig. 7 Effect of GATA6 and X1433ZETA overexpression on apoptosis and migration of B16 melanoma cells

我們使用X1433ZETA和GATA6過表達(dá)細(xì)胞建立了黑色素瘤皮下異種移植小鼠模型，發(fā)現(xiàn)X1433ZETA過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤生長，GATA6過表達(dá)則抑制腫瘤生長。同時，與對照組相比較，X1433ZETA過表達(dá)縮短小鼠存活時間，而GATA6過表達(dá)則會延長小鼠的存活時間。結(jié)果詳見圖8。

圖8 GATA6和X1433ZETA過表達(dá)對B16黑色素瘤小鼠腫瘤生長曲線及存活率的影響Fig. 8 Effect of GATA6 and X1433ZETA overexpression on tumor growth curve and survival rate in B16 melanoma mice

3 討論

本文建立了一個基于11種蛋白質(zhì)表達(dá)水平的預(yù)后模型，并用來計算每個患者的風(fēng)險評分。分析表明，與低風(fēng)險評分患者相比，高風(fēng)險評分患者預(yù)后明顯較差。多因素獨立預(yù)后分析顯示，風(fēng)險評分與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)。ROC曲線分析顯示，風(fēng)險評分AUC值為0.761，表明風(fēng)險評分優(yōu)于年齡、腫瘤分期、TNM分型等其他預(yù)后指標(biāo)。通過相關(guān)性分析，本文鑒定了多個與模型蛋白質(zhì)共表達(dá)的分泌蛋白質(zhì)。體外和體內(nèi)驗證實驗表明，與高風(fēng)險相關(guān)的X1433ZETA過表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長，而與低風(fēng)險相關(guān)的GATA6過表達(dá)抑制腫瘤生長。據(jù)估計，全球黑色素瘤發(fā)病率在過去20年中翻了一番，其發(fā)病率被認(rèn)為高于任何其他類型的癌癥(3.1%/年)[22-23]。鑒于其高死亡率，需要一種有效的黑色素瘤預(yù)后模型來改善預(yù)后。

本文預(yù)后模型包括11種蛋白質(zhì)，其中LCK、P27、S6、SRC_pY416、CD20和GATA6在預(yù)后較好的患者中高表達(dá)，提示這些蛋白質(zhì)與低風(fēng)險相關(guān)。這些結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，例如，Deepak等[24]發(fā)現(xiàn)GATA6是一個星形細(xì)胞瘤腫瘤抑制基因。對于高風(fēng)險蛋白質(zhì)CKIT、P21、X1433ZETA，相關(guān)研究也提示這些蛋白質(zhì)與較差的預(yù)后相關(guān)。例如CKIT在某些癌癥的發(fā)生中起至關(guān)重要的作用，抑制CKIT激酶活性可以成為癌癥治療的靶點[25]。這些結(jié)果表明，本文模型與文獻(xiàn)[24-25]的研究結(jié)果一致，模型是可靠的。

為了驗證該模型，進(jìn)行了單因素和多因素獨立預(yù)后分析，結(jié)果顯示風(fēng)險評分較高的患者預(yù)后明顯較低。此外，使用多因素獨立預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)風(fēng)險評分與黑色素瘤預(yù)后相關(guān)。有研究報道了黑色素瘤的預(yù)后模型，例如，一些預(yù)后模型是根據(jù)患者臨床特征建立的，包括腫瘤厚度、有無潰瘍和原發(fā)腫瘤的位置[15]。然而這些模型沒有考慮蛋白質(zhì)表達(dá)，所以這些模式無法代表患者的分子生物學(xué)特征。同時，與疾病分級或TNM分期這些用于預(yù)后分析的模型相比，我們的風(fēng)險評分AUC值高于TNM分期或分級(圖4)，因而，本文所建立模型的預(yù)測能力優(yōu)于現(xiàn)有的基于TNM分期或疾病分級的預(yù)后模型。

蛋白質(zhì)預(yù)后模型是近些年開發(fā)的一種新的預(yù)后模型，其特點是可以用每個患者的某些蛋白質(zhì)的表達(dá)量來預(yù)測患者的預(yù)后，而非基于患者的臨床特征。因為基于數(shù)據(jù)庫，我們可以獲取每個患者上萬種蛋白質(zhì)的表達(dá)量，從中可以挑選若干跟預(yù)后顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)來建立預(yù)后模型，與傳統(tǒng)的基于TNM分期等模型相比，更好地代表了每個患者的腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)特征，在更深入的分子層次建立患者的預(yù)后模型，有更好的預(yù)測能力。本文研究中，比較了本文模型與TNM分期等在預(yù)后預(yù)測中的價值，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)預(yù)后模型明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的基于臨床特征的模型。正是基于上述優(yōu)點，蛋白質(zhì)預(yù)后模型已廣泛用于腫瘤患者的預(yù)后預(yù)測[26]。因此，本文模型比過去的模型更有優(yōu)勢。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，本文模型中有多個蛋白質(zhì)與這11個蛋白質(zhì)共表達(dá)。應(yīng)用嚴(yán)格的相關(guān)系數(shù)和P值過濾(0.4和0.001)鑒定出許多分泌蛋白質(zhì)與11個模型蛋白質(zhì)共表達(dá)。當(dāng)無法獲得腫瘤組織時，這些分泌蛋白質(zhì)可能特別重要，因為它們可以作為11種模型蛋白質(zhì)的替代品來預(yù)測患者的預(yù)后。

綜上所述，我們得到了一種基于蛋白質(zhì)的黑色素瘤預(yù)后模型，該模型比基于患者臨床特征的傳統(tǒng)預(yù)后模型表現(xiàn)更好，這有助于人們找到一個更優(yōu)的個體化治療方案。