王捷頻，張雨婷，肖 東

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041；3.深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為最常見(jiàn)的兒童惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制尚不明確。其5年生存率在37%～69%之間[1]?；颊咴缙谕ǔＪ菬o(wú)癥狀，少數(shù)因腫瘤的數(shù)量及位置伴有腹痛、腹脹及便秘[2]。由于缺乏特異性的早期癥狀與腫瘤標(biāo)志物，50%的高風(fēng)險(xiǎn)患者在診斷時(shí)已伴有腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。因此，識(shí)別神經(jīng)母細(xì)胞瘤中參與腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)于早期診斷及阻斷轉(zhuǎn)移過(guò)程具有重要意義。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析識(shí)別神經(jīng)母細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)樞紐基因并分析其參與的調(diào)控過(guò)程，以期為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷及治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)下載和預(yù)處理

在GEO數(shù) 據(jù)庫(kù) （http://www.ncbi.nlm.gov/geo）中檢索種屬為人并且與神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)的測(cè)序數(shù)據(jù)集，并下載GSE90689數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集基于GPL6480平臺(tái)，包含神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和正常骨髓細(xì)胞共57例樣本。根據(jù)研究目的，我們選擇了14例來(lái)自神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)病灶的神經(jīng)節(jié)苷脂2細(xì)胞與10例來(lái)自轉(zhuǎn)移灶的神經(jīng)節(jié)苷脂2細(xì)胞的mRNA數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換及標(biāo)準(zhǔn)化處理，以進(jìn)行下一步研究。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

篩選神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的差異表達(dá)基因，利用R 3.460軟件Limma程序包進(jìn)行分析，通過(guò)樣本中各個(gè)基因的表達(dá)量的均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算出|log2FC|的閾值為0.723。根據(jù)P＜0.05與|log2FC|＞0.723條件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，將標(biāo)本間的差異表達(dá)基因?qū)С觥?/p>

1.3 功能與通路富集分析

為進(jìn)一步解釋差異表達(dá)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的作用，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http://david.ncifcrf.gov）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，以此實(shí)現(xiàn)基因與生物學(xué)功能上的連接，P＜0.05的功能與通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

采用STRING 11.0（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步研究蛋白之間相關(guān)作用的關(guān)系。將STRING中導(dǎo)出的網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)一步優(yōu)化和分析，安裝MCODE插件聚類基因富集模塊，繪制蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)。安裝Cytohubba插件，選取候選模塊中相關(guān)性高的基因，通過(guò)最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）算法篩選出神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的樞紐基因。作為Cytohubba插件中11種算法之一，MCC已被證實(shí)在蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)中對(duì)關(guān)鍵蛋白的預(yù)測(cè)具有更好的效能[4]。

1.5 樞紐基因的表達(dá)水平與生存分析

利用R2平臺(tái)分析樞紐基因在腫瘤不同分期的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間。R2平臺(tái)（http://r2.amc.nl）是由荷蘭阿姆斯特丹學(xué)術(shù)醫(yī)學(xué)中心腫瘤基因組學(xué)系開(kāi)發(fā)的基于網(wǎng)絡(luò)的基因組學(xué)分析和可視化平臺(tái)?；?0個(gè)樞紐基因高低表達(dá)組中患者的生存時(shí)間，我們?cè)谄脚_(tái)中進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析。

1.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為驗(yàn)證樞紐基因是否具有相同的表達(dá)模式，即是否存在共調(diào)控、功能相關(guān)或處于同一通路，使用R軟件的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選包，構(gòu)建差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)?；诟骰虻腜earson相關(guān)矩陣分析結(jié)果，確立β值并建立無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)層次聚類，將網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)性較高的基因分成不同模塊。計(jì)算每個(gè)模塊的特征向量值，并合并了距離近的模塊。最后計(jì)算模塊基因與腫瘤分期及是否轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，篩選出重要的模塊及其中的基因，以此驗(yàn)證樞紐基因是否屬于同一通路，共同調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.7 驗(yàn)證差異基因

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載GSE90121數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺(tái)，包含神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶共16例樣本。對(duì)比10個(gè)樞紐基因在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量，驗(yàn)證其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因

以P＜0.05與|log2FC|＞0.723篩 選 差 異 表 達(dá) 基因，共得到320個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括上調(diào)基因162個(gè)，下調(diào)基因158個(gè)（圖1與圖2）。

圖1 差異表達(dá)基因的表達(dá)熱圖

圖2 差異表達(dá)基因的韋恩圖

2.2 差異表達(dá)基因的KEGG和GO富集分析

根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能和通路的富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因生物學(xué)功能明顯富集在I型干擾素信號(hào)通路、對(duì)病毒的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂、血小板活化與血小板脫粒。細(xì)胞成分主要富集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞表面與染色質(zhì)。分子功能主要富集在蛋白結(jié)合。KEGG通路分析顯示，上調(diào)基因主要富集在礦物質(zhì)的吸收，而下調(diào)基因主要富集在造血系統(tǒng)與血小板的活化（圖3、圖4與圖5）。

圖3 上調(diào)差異表達(dá)基因的GO富集分析

圖4 下調(diào)差異表達(dá)基因的GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

2.3 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)一步分析，并通過(guò)Cytohubba插件中的MCC算法得到網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因，包括IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、MX1、RSAD2、MX2（圖6）。

圖6 蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 樞紐基因的生存預(yù)后與表達(dá)分析

通過(guò)R2平臺(tái)獲得10個(gè)樞紐基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中的預(yù)后分析。其中，在IFI44L、HERC5、USP18、MX1、MX2高表達(dá)患者中，總體生存率更高。MX2是唯一一個(gè)在不同分期中表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的樞紐基因（P=0.02）（圖7）。

圖7 生存分析與不同分期的表達(dá)水平

2.5 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將320個(gè)差異表達(dá)基因納入共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，定義網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋽M合指數(shù)為0.8，得到最佳軟閾值β=8時(shí)的鄰接矩陣。基因按照相關(guān)性被分成10個(gè)模塊，經(jīng)模塊間相關(guān)性分析合并后得到9個(gè)模塊，其中與臨床性狀（是否轉(zhuǎn)移）和腫瘤分期相關(guān)性最高的為灰色模塊，且蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)中10個(gè)樞紐基因皆從屬于灰色模塊（圖8）。

圖8 加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

2.6 樞紐基因篩選后驗(yàn)證

通過(guò)數(shù)據(jù)集GSE90121不同樣本差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示10個(gè)樞紐基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中表達(dá)量存在差異。在轉(zhuǎn)移灶中以IFI44L、IFI44的高表達(dá)及MX2、MX1、USP18、ISG15、RSAD2、HERC5、DDX60的低表達(dá)為主（圖9）。

圖9 外部數(shù)據(jù)集中樞紐基因的表達(dá)熱圖

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤作為兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患兒死亡的重要危險(xiǎn)因素，然而其轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不明確。本研究通過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，篩選神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的差異表達(dá)基因，并通過(guò)蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)對(duì)基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選，確定了10個(gè)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的樞紐基因?；谘芯康慕Y(jié)果，我們旨在尋找潛在的治療靶點(diǎn)，以減少患者早期轉(zhuǎn)移的可能。

我們研究中共篩選出320個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括上調(diào)基因162個(gè)與下調(diào)基因158個(gè)。進(jìn)行GO、KEGG富集分析，以探究差異表達(dá)基因之間的相互作用。上調(diào)基因主要富集在干擾素相關(guān)的信號(hào)通路與對(duì)病毒的反應(yīng)。研究表明，干擾素通路的激活可以影響不同腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]。還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為Ⅰ型干擾素是由惡性細(xì)胞產(chǎn)生的，可以通過(guò)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在或外在的方式引發(fā)免疫反應(yīng)[6]。至于對(duì)病毒的反應(yīng)，我們認(rèn)為與通過(guò)Ⅰ型干擾素所引發(fā)的免疫反應(yīng)有關(guān)。在Xin等[7]的研究表明CD200在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的過(guò)度表達(dá)，可下調(diào)機(jī)體的抗腫瘤免疫，調(diào)節(jié)腫瘤的免疫微環(huán)境。相比之下，下調(diào)基因主要富集于細(xì)胞黏附過(guò)程。細(xì)胞黏附過(guò)程在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，整合素作為主要的細(xì)胞黏附受體，決定了腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的定植位置[8]。此外下調(diào)的基因也富集于血小板的活化和脫粒。Stone等[9]證明P-選擇素介導(dǎo)的血小板結(jié)合促進(jìn)了肺小細(xì)胞癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移。

研究中最終獲得10個(gè)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐基因，分別是IFI44L、IFI44、HERC5、HERC6、USP18、DDX60、ISG15、RSAD2、MX1、MX2。通過(guò)分析樞紐基因的主要功能，我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素在其中扮演著關(guān)鍵角色[10]。為了研究10個(gè)樞紐基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)篩選分析并定位每個(gè)樞紐基因所在的模塊，10個(gè)樞紐基因皆屬于灰色模塊，說(shuō)明樞紐基因可能通過(guò)I型干擾素信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中共表達(dá)。Ⅰ型干擾素被認(rèn)為是癌癥治療的雙刃劍[11]。據(jù)報(bào)道，干擾素特征基因在腫瘤的進(jìn)展中起著不同的作用。Kim等[12]報(bào)道，干擾素誘導(dǎo)雙鏈RNA依賴蛋白激酶在黑色素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化中高度表達(dá)。Ⅰ型干擾素還可以上調(diào)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的表達(dá)水平，抑制劑對(duì)程序性死亡受體1通路治療的阻斷具有抗性[13]。干擾素-α不僅可以增強(qiáng)程序性死亡受體1的表達(dá)，還可以在持續(xù)的免疫反應(yīng)中對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)造成衰減[14]。然而，一些研究表明在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，Ⅰ型干擾素具有抗腫瘤作用。Streck等[15]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤小鼠模型中測(cè)試了I型干擾素的抗血管生成活性。在干擾素-α治療的小鼠中，皮下和腹膜后的腫瘤明顯變小。他們還發(fā)現(xiàn)干擾素-α可以降低瘤內(nèi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平[16]。Dedoni等[17]報(bào)道干擾素-β可以通過(guò)調(diào)節(jié)P38 MAPK誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡。這些研究表明，干擾素特征基因高表達(dá)的原因可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展中機(jī)體的自身免疫反應(yīng)。我們認(rèn)為干擾素特征基因可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒潛在的預(yù)后標(biāo)志物與治療的分子靶點(diǎn)。

總而言之，我們通過(guò)一系列生物信息學(xué)研究識(shí)別了10個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐基因。這些基因與Ⅰ型干擾素信號(hào)通路關(guān)系密切，具有作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的潛能。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)揭示神經(jīng)母細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展具有重要意義。