柴嫚青 ，李香香 ，王銳 ，張靜靜 ，田琳 ，徐曉萍 ,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300392；2. 華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237）

大蒜中包含人體必需的微量元素硒、鋅、鍺等[1]，也包括脂溶性有機(jī)硫化物、硫代亞磺酸酯類等揮發(fā)性物質(zhì)[2]和水溶性有機(jī)硫化物、類固醇皂苷等非揮發(fā)性物質(zhì)等[3]。其中大蒜素是大蒜中最具有活性的物質(zhì)，圖1所示為大蒜素的結(jié)構(gòu)[2]。大蒜素為淡黃色油狀液體，有刺激性臭味。冷凍處理是所有試驗(yàn)預(yù)處理中最為穩(wěn)定的處理方式，對(duì)大蒜的活性物質(zhì)含量和抗氧化性影響微弱，可以作為工廠加工首要選擇的處理?xiàng)l件[4]。大蒜適當(dāng)延長(zhǎng)采收時(shí)間有助于大蒜素的累積并且提高其辛辣度[5]。

圖1 大蒜素結(jié)構(gòu)

目前大蒜素的提取方法有水蒸氣蒸餾法[6]、超臨界 CO2提取法[7]和有機(jī)溶劑提取法[8]。本試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取法，選用乙醇溶劑[9]，通過正交試驗(yàn)確定提取的最適宜條件，利用超聲提取以提高提取率[10]。大蒜素含量的測(cè)定方法有定硫法[11]、硝酸汞法、吸光光度法和HPLC法[12]。本試驗(yàn)采用吸光光度法測(cè)定大蒜素含量，通過測(cè)定吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大蒜素含量。

大蒜經(jīng)破碎，蒜酶活化，催化蒜氨形成大蒜素，大蒜素進(jìn)一步分解成具有強(qiáng)烈臭味的硫化物[13]，正是這些硫化物使大蒜具有抗菌消炎、抗癌、治療和預(yù)防心血管疾病、提高體細(xì)胞的免疫功能和保護(hù)肝臟[14-16]、抑制病菌的生長(zhǎng)和繁殖作用[17-18]等功效，且使病菌不易產(chǎn)生抗藥性。大蒜素在農(nóng)業(yè)上作為殺蟲劑、殺菌劑，效果顯著，是一種天然的植保劑，也用于食品[19]、飼料[20-22]、醫(yī)藥上，大蒜素使用后在植物中的殘留量遠(yuǎn)低于人體每日從大蒜中攝取的量，因此可將其用于農(nóng)藥、水果和食品保鮮，其作用強(qiáng)度相當(dāng)于甚至強(qiáng)于苯甲酸和山梨酸等化學(xué)防腐劑[23]，目前經(jīng)常使用的水果保鮮劑有用于柑橘類保鮮的碳酸氫鈉、用于梨類水果保鮮的虎皮靈和用于蘋果類保鮮的甲基托布津等[24]。閔玉濤等[25]、曹薇[26]、張黎明等[27]也研究了大蒜素在水果保鮮方面的應(yīng)用，試驗(yàn)結(jié)果顯示大蒜素對(duì)于水果保鮮確實(shí)有很好的效果。本研究擬研究大蒜素的提取工藝以及保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)儀器

FA1204B電子天平；恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用有限責(zé)任公司）；BK-600D超聲波清洗機(jī)（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；TDZ5-WS離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司）；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

1.1.2 試驗(yàn)原料與試劑

大蒜（購(gòu)于天津王頂?shù)淌袌?chǎng)）；無水乙醇（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠分析純）；標(biāo)準(zhǔn)大蒜素（上海源葉生物科技有限公司UV≥98%）。

1.2 大蒜素提取過程

本試驗(yàn)利用有機(jī)溶劑提取法提取大蒜素，有機(jī)溶劑選用 85%的乙醇溶液。先將新鮮大蒜搗碎成泥狀，稱取5 g左右的蒜泥于錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴鍋中，水浴后加入乙醇溶液進(jìn)行超聲，超聲后在3 000 r/min條件下離心15 min，將上清液置于燒杯中。取1 mL上清液于比色管中定容后再取稀釋后的溶液1 mL于比色管中定容，進(jìn)行兩次稀釋后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定大蒜提取液的吸光度。記錄各個(gè)條件下的吸光度。

1.3 大蒜素最大吸收波長(zhǎng)的確定

將大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在 85%乙醇中，制成一定濃度的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)得到紫外全波長(zhǎng)掃描圖。通過大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紫外譜圖得到大蒜素紫外最大吸收波長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)比兩個(gè)紫外譜圖。

1.4 正交試驗(yàn)

提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲溫度以及超聲時(shí)間對(duì)于大蒜素的提取率都有影響，料液比在 1∶5、1∶6[8，28-29]，提取的適宜溫度在 40～45 ℃，時(shí)間在 60～70 min 范圍內(nèi)[8，12，30]，超聲的溫度在 35～45 ℃，時(shí)間在 50～60 min[12，28，30-31]，因此選用五因素四水平制定正交表格（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)。并依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定大蒜素提取的最適宜條件。

表1 正交試驗(yàn)影響因素水平表

1.5 依據(jù)紅外光譜確定大蒜素結(jié)構(gòu)

在45 ℃提取50 min，加入30 mL 85%乙醇混合均勻后在600 W，45 ℃條件下超聲50 min得到大蒜提取液，將提取液在R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到淡黃色油狀液體，利用FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)大蒜提取液進(jìn)行紅外測(cè)定，利用液膜法，取1～2滴大蒜提取液置于兩個(gè)圓形鹽片中間，形成一層液膜，放入光路檢測(cè)，得到大蒜提取液紅外譜圖。將20 mg大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL的容量瓶中制成0.2 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，與大蒜提取液同樣的方法，利用紅外測(cè)定大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖。對(duì)比大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紅外譜圖和紅外譜圖確定大蒜提取液的官能團(tuán)。

1.6 室溫下大蒜素保存時(shí)間試驗(yàn)

將大蒜樣品在 45 ℃水浴鍋中水浴提取 80 min，加入25 mL 85%乙醇在40 ℃溫度下超聲40 min后離心，取上清液稀釋后測(cè)定吸光度，將在該條件下得到的大蒜提取液再放置幾天后測(cè)定吸光度計(jì)算大蒜素含量，觀察在室溫下大蒜素含量變化情況。

1.7 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對(duì)比

發(fā)芽的大蒜是將新鮮大蒜去掉外皮后在冰箱放置20 d后大蒜根部長(zhǎng)出白芽，取一定量新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜，分別在表2所示的條件下測(cè)定對(duì)應(yīng)吸光度并計(jì)算大蒜素含量。

表2 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對(duì)比條件

1.8 大蒜提取液對(duì)蔬菜和水果保鮮效果試驗(yàn)

試驗(yàn)在溫度為 21 ℃，相對(duì)濕度為 25%的條件下進(jìn)行。設(shè)置噴灑大蒜提取液、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇溶液以及空白對(duì)照，做6組平行試驗(yàn)，對(duì)新鮮的菠菜、蘋果和香蕉進(jìn)行保鮮試驗(yàn)。觀察樣品的情況。根據(jù)樣品表面的腐壞情況判斷大蒜素提取液對(duì)蔬菜和水果的保鮮效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素最大吸收波長(zhǎng)

將大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長(zhǎng)掃描得到的紫外光譜圖進(jìn)行對(duì)比如圖2所示，大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液均在198 nm和212 nm有吸收峰，最大吸收峰在198 nm，所以大蒜素的最大吸收波長(zhǎng)為198 nm，兩個(gè)紫外光譜圖重合程度較好，吸收峰均相同。

圖2 大蒜提取液與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長(zhǎng)掃描圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在測(cè)定出大蒜提取液的吸光度后，想要確定大蒜素含量則需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照2.5所述的方法制備大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 0.2 mg/mL 的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL比色管中，定容后制成0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.020和0.024 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.25 mL 0.2 mg/mL的大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL容量瓶中定容制成0.001 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)濃度大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出線性回歸方程，系統(tǒng)誤差為0.102，去除系統(tǒng)誤差后線性回歸方程為y＝23.946 0x＋0.057 8，R2＝0.994 2，相關(guān)性較好（圖3）。

圖3 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過進(jìn)行五因素四水平的正交試驗(yàn)，得到各個(gè)正交條件下大蒜素的提取率，試驗(yàn)結(jié)果如表 3所示。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)表3中K值大小可知，大蒜素提取率最高的組合是A4B3C2D1E2，即大蒜素提取的最適宜條件是提取溫度50 ℃，提取時(shí)間70 min，料液比1∶5，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間50 min。且依據(jù)R值得到大蒜素提取率影響因素的影響大小是 A＞C＞E＞B＞D，即提取溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞提取時(shí)間＞超聲溫度。在最適宜條件下進(jìn)行大蒜素提取得到吸光度為 0.416，大蒜素提取率為4.60%。

2.4 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜圖與大蒜提取液紅外光譜圖

大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的紅外光譜圖與大蒜提取液的紅外光譜圖對(duì)照如圖4所示。

圖4 大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品與大蒜提取液的紅外光譜對(duì)比圖

大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖在 3 383 cm-1有吸收峰，由于大蒜素由乙醇溶液溶解，所以推測(cè)是乙醇或水的羥基吸收峰，在2 974 cm-1的吸收峰推測(cè)為末端雙鍵，在1 647 cm-1有吸收峰但強(qiáng)度比C＝＝O雙鍵的弱一些，推測(cè)為硫氧雙鍵，1 381 cm-1位于指紋區(qū)，推測(cè)為S＝＝O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 087 cm-1和1 049 cm-1為S-S的吸收峰，879 cm-1為亞甲基的 C-H吸收峰，與大蒜素的結(jié)構(gòu)式基本符合。大蒜提取液的紅外譜圖在3 342 cm-1有一個(gè)寬的吸收峰，推測(cè)為乙醇或水的羥基吸收峰，2 931 cm-1的吸收峰推測(cè)為末端雙鍵，1 622 cm-1的吸收峰的強(qiáng)度沒有C＝＝O的吸收峰強(qiáng)度強(qiáng)，故推測(cè)為S＝＝O的吸收峰，1 406 cm-1位于指紋區(qū)，推測(cè)為S＝＝O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 128 cm-1和1 026 cm-1有相鄰的2個(gè)吸收峰，推測(cè)為S-S的伸縮振動(dòng)吸收峰，931 cm-1推測(cè)為亞甲基的C-H吸收峰。如圖4所示，大蒜提取液的紅外譜圖與大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖各個(gè)吸收峰的重合程度高，并且與大蒜素的結(jié)構(gòu)式符合。結(jié)合大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品和大蒜提取液的紫外譜圖對(duì)比從而可以確定提取的物質(zhì)為大蒜素，并且提取液的紅外譜圖的峰較清晰，且雜峰不多，說明提取的大蒜素中雜質(zhì)含量較少。

2.5 室溫下大蒜素保存時(shí)間試驗(yàn)

記錄室溫下放置的大蒜提取液的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出大蒜素含量如表4所示，發(fā)現(xiàn)大蒜素含量隨著放置時(shí)間的增加逐漸減少，第 8天大蒜素含量?jī)H剩 0.26%。說明大蒜素易揮發(fā)，在室溫下保存時(shí)間不長(zhǎng)，第8天大蒜素含量已經(jīng)很少了。

表4 室溫下保存時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

2.6 新鮮和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對(duì)比

根據(jù)表2設(shè)計(jì)的試驗(yàn)得到結(jié)果如表5所示，發(fā)芽大蒜里的大蒜素含量較新鮮大蒜里的大蒜素含量稍多，由于發(fā)芽大蒜中含有較多的抗氧化性的硒元素，可以減少自由基破壞，但發(fā)芽對(duì)于大蒜中大蒜素含量影響不大，最大相差 0.26%。發(fā)芽后大蒜內(nèi)的其他物質(zhì)含量有待進(jìn)一步測(cè)定。

表5 新鮮大蒜和發(fā)芽大蒜提取液中大蒜素含量對(duì)比 %

2.7 果蔬保鮮試驗(yàn)

按照 2.8的試驗(yàn)過程進(jìn)行蔬菜和水果保鮮試驗(yàn)，如圖5所示，在菠菜試驗(yàn)中，與第0天的新鮮菠菜相比，第4天空白對(duì)照有很明顯的縮水現(xiàn)象，而其他對(duì)照組的縮水現(xiàn)象不明顯，形狀幾乎沒變，噴灑乙醇溶液的菠菜變黃并且比噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)液的黃一些，大蒜素標(biāo)準(zhǔn)液的變黃程度更小一些。另外在噴灑乙醇溶液、大蒜提取液、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的菠菜中出現(xiàn)褪色現(xiàn)象，而在空白對(duì)照中并沒有出現(xiàn)，推測(cè)為乙醇溶液可以提取菠菜中的色素，如圖 6所示。到第 9天時(shí)，6組均已經(jīng)呈現(xiàn)完全風(fēng)干狀態(tài)，且空白對(duì)照組中的菠菜葉已經(jīng)明顯縮皺，而其他各組大部分葉片大小形狀均保持較好。

圖5 菠菜保鮮試驗(yàn)各個(gè)對(duì)照組結(jié)果對(duì)比圖

圖6 菠菜保鮮試驗(yàn)中特殊脫色現(xiàn)象結(jié)果對(duì)比圖

如圖7所示，在蘋果的抗氧化試驗(yàn)中，在30 min后，空白對(duì)照和噴灑乙醇溶液的蘋果表面有很明顯的氧化現(xiàn)象，噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果表面氧化現(xiàn)象不明顯，60 min后，各個(gè)對(duì)照組都有不同程度的氧化現(xiàn)象，氧化程度由大到小為：對(duì)照組，噴灑乙醇溶液組＞噴灑大蒜提取液組＞大蒜素純品溶液組。如圖8所示，在蘋果的表皮保鮮試驗(yàn)中，到第4天，空白對(duì)照的蘋果表面有明顯縮水現(xiàn)象，噴灑乙醇溶液的蘋果有部分縮水現(xiàn)象，其他兩組的縮水現(xiàn)象不明顯，噴灑大蒜提取液和噴灑大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果表面形成一層黏膜，減少水分流失以及與空氣的接觸，使得噴灑大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的蘋果縮水現(xiàn)象不明顯，比噴灑乙醇溶液和空白對(duì)照的保鮮效果好。

圖7 蘋果抗氧化試驗(yàn)各個(gè)對(duì)照組結(jié)果對(duì)比圖

圖8 蘋果表皮保鮮試驗(yàn)各個(gè)對(duì)照組結(jié)果對(duì)比圖

在香蕉保鮮試驗(yàn)中，如圖9所示，第4天時(shí)表皮有些許變黑，第9天時(shí)香蕉表皮已經(jīng)大面積變黑，但是噴灑有大蒜提取液和大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的香蕉表皮變黑面積較其他兩組對(duì)照少，第9天香蕉的內(nèi)部圖看出空白對(duì)照組有5組已經(jīng)壞掉，呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第1組已腐壞到不成型，噴灑乙醇溶液的對(duì)照組有4組呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第5組和第6組的香蕉頭部有明顯變黑現(xiàn)象，噴灑大蒜提取液的對(duì)照組有2組是呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，并且沒有其他組的那么嚴(yán)重，噴灑大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的對(duì)照組有 3組是呈現(xiàn)發(fā)黃并且黏手的狀態(tài)，其中第2組徹底壞掉，形狀軟榻。從以上水果試驗(yàn)結(jié)果可以看出，大蒜素對(duì)于水果有很好的保鮮效果，并且在放置幾天后大蒜的味道仍有殘留，說明大蒜素并未完全揮發(fā)。大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液和大蒜提取液的效果不能很好的區(qū)分可能是由于濃度的差異，后續(xù)可以進(jìn)行不同濃度大蒜素對(duì)于水果保鮮的效果試驗(yàn)。

圖9 香蕉保鮮試驗(yàn)各個(gè)對(duì)照組結(jié)果對(duì)比圖

3 結(jié)論

大蒜素紫外最大吸收波長(zhǎng)為198 nm。大蒜素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果較準(zhǔn)確，可用于測(cè)定大蒜素提取液中大蒜素含量。通過正交試驗(yàn)的方法對(duì)大蒜提取液進(jìn)行吸光度的測(cè)定和數(shù)據(jù)分析，得到大蒜素提取的最適宜提取條件是提取溫度為 50 ℃，提取時(shí)間為70 min，料液比1∶5，超聲溫度為30 ℃，超聲時(shí)間為50 min。在最適宜條件下進(jìn)行大蒜素提取得到吸光度為0.416，大蒜素提取率為4.60%。大蒜素提取率影響因素的影響大小為提取溫度＞料液比＞超聲時(shí)間＞提取時(shí)間＞超聲溫度。通過菠菜、蘋果和香蕉的保鮮試驗(yàn)，得到大蒜素對(duì)蔬菜和水果有很好的保鮮和抗氧化效果。

4 展望

本研究初步對(duì)蔬菜水果進(jìn)行保鮮和抗氧化試驗(yàn)研究，由于大蒜便宜易得，且大蒜素對(duì)人體有較多益處，所以將大蒜素用于蔬菜水果保鮮有很大的應(yīng)用前景。提取得到的大蒜素是油狀液體，提純時(shí)在進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，液體會(huì)黏在燒瓶的瓶壁上，造成誤差較大，純度測(cè)定結(jié)果不可靠，所以本試驗(yàn)未進(jìn)行純度測(cè)定，在后續(xù)大蒜素的研究中大蒜素的提純是很好的研究方向。