路雪萍 馬培杰 童偉楊 羅文舉 李亞嬌 趙德剛，* 王小利，，*

（1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550025）

植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程受光周期途徑的影響，該途徑主要包括光信號(hào)的輸入途徑、中央振蕩器和信號(hào)輸出途徑，其中生物鐘輸出基因GIGANTEA（GI）是光周期途徑調(diào)控開花的關(guān)鍵基因之一［1］。GI作為植物特異性核蛋白，參與擬南芥（Arabidopsis thaliana）光周期開花調(diào)控、晝夜節(jié)律控制。GI 受生物鐘的調(diào)控，同時(shí)影響生物鐘振蕩器核心元件相關(guān)基因的表達(dá)［2］。在長(zhǎng)日照和短日照條件下，GI位點(diǎn)突變影響CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1（CCA1）和LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）基因的表達(dá)［3］，同時(shí)CCA1和LHY過量表達(dá)或者突變都會(huì)干擾GI基因的表達(dá)，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的GI 蛋白分別正調(diào)控和負(fù)調(diào)控LHY基因的表達(dá)，微調(diào)生物鐘功能［2］。

在開花時(shí)間調(diào)控方面，1962年GI基因被認(rèn)為是與開花有關(guān)的基因［4］，擬南芥gi突變體在長(zhǎng)日照和短日照條件下均表現(xiàn)出晚花表型，GI基因過量表達(dá)使植物提前開花，表明GI是擬南芥開花促進(jìn)因子［3］。GI 是生物鐘與光周期開花調(diào)控因子CO（CONSTANS）之間的中介物，通過上調(diào)CO基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)植物開花。GI在光周期開花途徑中具有多重作用。首先，GI 與ZEITLUPE（ZTL）和LOV KELCH PROTEIN2（LKP2）相互作用，協(xié)同F(xiàn)KF1 降解CYCLING ODF FACTOR 2（CDF2）蛋白，GI 還能穩(wěn)定FKF1 和ZTL 蛋白［5-6］。第二，核GI 蛋白在植物體中與FT 的抑制因子形成復(fù)合物，如VEGETATIVE PHASE（SVP）、TEMPRANILLO 1（TEM1）、TEM2［6］。第三，GI 通過miR172 途徑間接誘導(dǎo)FT轉(zhuǎn)錄，miR172的表達(dá)受GI正向調(diào)控，受SVP負(fù)向調(diào)控，miR172 靶向APETALA 2（AP2）相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SCHLAFM YuTZE（SMZ）、SCHNARCHZAPFEN（SNZ）、TARGET OF EAT1（TOE1）、TOE2 的轉(zhuǎn)錄并降低其豐度［7-8］。GI除了參與開花和生物鐘調(diào)控外，還參與各種分子途徑，包括下胚軸伸長(zhǎng)、葉綠素積累、淀粉積累、非生物脅迫耐受、光和蔗糖信號(hào)傳導(dǎo)以及miRNA加工［9］。GI是調(diào)控補(bǔ)償效應(yīng)的候選基因，能減少高溫（＞27 ℃）和低溫（＜12 ℃）環(huán)境對(duì)晝夜節(jié)律功能的傷害，正常溫度下GI對(duì)晝夜節(jié)律無影響，溫度的波動(dòng)調(diào)控GI基因轉(zhuǎn)錄物的豐度［10］。有研究證明子葉的運(yùn)動(dòng)、蒸騰及對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)反應(yīng)的控制歸因于SPINDLY（SPY）和GI的協(xié)同作用［11］。在短日照條件下，GI在蔗糖信號(hào)傳導(dǎo)和生物鐘之間發(fā)揮作用［12］。在對(duì)擬南芥的研究中，脫落酸（abscisic acid，ABA）亞細(xì)胞水平在鹽、冷和干旱的脅迫下增加。GI在依賴ABA 的干旱逃逸耐受中起作用，干旱脅迫下，WRKY44被GI抑制并與TOE1相互作用，表明GI對(duì)鹽和冷脅迫耐受性的調(diào)節(jié)可能由ABA 介導(dǎo)［13］。同樣，光依賴的GI介導(dǎo)的氣孔開放反應(yīng)可能ABA是由介導(dǎo)的［14］。

高羊茅（Festuca elataKeng ex E.Alexeev）是主要的冷季型牧草和草坪草，具有易建坪、四季常綠、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性［15］。高羊茅作為牧草，花序和莖稈的形成會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量下降；作為草坪草，生長(zhǎng)季抑制其生殖枝的形成，對(duì)草坪持久性有重大意義［16］。因此，推遲開花和延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期是目前草類植物主要的育種目標(biāo)。為明確GI基因在高羊茅生物鐘晝夜振蕩節(jié)律調(diào)控與光周期開花應(yīng)答中的作用機(jī)制，本研究在前期FaGI基因表達(dá)及啟動(dòng)子分析的［17］基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀探究FaGI與FaCO的相互作用，以擬南芥（Col-0）、p1300-FaGI 過表達(dá)擬南芥植株、擬南芥gi（N694170）為材料進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，初步探討FaGI參與調(diào)節(jié)光周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)制，以期為高羊茅光周期育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高羊茅（Festuca elataKeng ex E.Alexeev）品種獵狗五號(hào)購(gòu)自百綠草種公司（貴陽(yáng)），擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col-O，WT）由貴州省草業(yè)研究所保存，擬南芥gi（N694170）由AraShare 科技服務(wù)中心（福州）饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析

選取籽粒飽滿均一的高羊茅種子，用75%的酒精浸泡1 min，蒸餾水沖洗3～4 次，再用84 消毒液浸泡2 min，超純水沖洗3～4 次，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)室中催芽。待種子自然萌發(fā)后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致且無病害的幼苗，采用育苗穴盤（上口徑60 mm，底部28 mm，深度53 mm）花盆規(guī)格高25 cm、直徑30 cm，置于光照培養(yǎng)箱給予長(zhǎng)日照（long-days，LD）和短日照（short-days，SD）處理，相對(duì)濕度60%，溫度（22±2）℃。長(zhǎng)日照處理?xiàng)l件：光照/黑暗16 h/8 h，短日照處理?xiàng)l件：光照/黑暗8 h/16 h。待播種28 d后，取根、莖和葉片樣品，在液氮中迅速研磨成粉，使用Axyprep 試劑盒（愛思進(jìn)生物技術(shù)公司，杭州）按照說明書步驟提取總RNA。利用GoScript 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京）對(duì)總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照GoTaq?qPCR Master Mix 試劑盒（Promega，北京）說明書進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，分析基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系20.0μL：正、反向引物各0.3μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 7.4μL，SYBR Mix 10.0μL。擴(kuò)增程序：96 ℃預(yù)變性6 min；96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 酵母雙雜交檢測(cè)

根據(jù)FaGI和FaCO基因的全長(zhǎng)和載體圖譜，分別設(shè)計(jì)一對(duì)帶有EcoRI 和BamHI 酶切位點(diǎn)的引物，構(gòu)建融合表達(dá)載體（pGBKT7-FaGI和pGADT7-FaCO），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌［Escherichia coli（Mig.）Cast.&Chalm.］DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證其正確性。將pGBKT7-FaGI質(zhì)粒分別與空AD 質(zhì)粒、pGADT7-FaCO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株Y2Hgold，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（pGADT7-T/pGBKT7-P53） 和陰性對(duì)照組（pGADT7-T/pGBKT7-lam）。收集轉(zhuǎn)化后酵母細(xì)胞，棄上清，加入300 μL 0.9% NaCl 溶液輕輕懸浮酵母細(xì)胞，將上述懸浮酵母細(xì)胞涂布于選擇性的二缺（SD/-Leu/-Trp）和四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）培養(yǎng)基的平板上，用刮鏟涂開至無流動(dòng)液體，SD/-Leu/-Trp 培養(yǎng)基上長(zhǎng)出克隆后，挑取單克隆擴(kuò)繁后在SD/-Leu/-Trp，SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（x-α-gal）培養(yǎng)基上點(diǎn)板，30 ℃恒溫箱培養(yǎng)3～5 d。觀察酵母的生長(zhǎng)情況。

1.4 雙分子熒光互補(bǔ)

將FaGI基因構(gòu)建至含有N 端黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）的pUC-SPYNE載體，構(gòu)建FaGI-nYFP；同樣將FaCO基因構(gòu)建至含有C 端YFP 的pUC-SPYCE載體上，構(gòu)建FaCO-cYFP。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。挑取陽(yáng)性單菌落接種至添加利福平和氨芐霉素的Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中，將侵染液從葉片下表皮注射到本氏煙草葉片內(nèi)。培養(yǎng)72 h 后取樣，通過LSM 510 激光共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）觀察黃色熒光蛋白信號(hào)。

1.5 免疫共沉淀

以1300-GFP、1300-35S-3*FLAG 為空載，對(duì)含有FaGI、FaCO基因的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得該克隆片段，并與酶切的載體通過無縫克隆方法連接，構(gòu)建FaGI-1300-GFP和FaCO-35S-3*FLAG載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證其正確性。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，組合農(nóng)桿菌混合后，將侵染液從葉片下表皮注射到本氏煙草葉片內(nèi)。取葉片加入液氮研磨后，加入500 μL 蛋白免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）緩沖液，取過濾的50μL上清作為Input對(duì)照組（陽(yáng)性對(duì)照），用于共轉(zhuǎn)化的檢測(cè)。按照考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，一般蛋白質(zhì)濃度控制在5～10 mg·mL-1。加入20 倍體積預(yù)冷的TBS（tris buffered saline）緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 值7.5；150 mmol·L-1NaCl）以平衡Anti-Flag 親和凝膠（Anti-FLAG M2 Affinity Gel），將蛋白質(zhì)加入到已平衡的Anti-FLAG M2 Affinity Gel，4 ℃條件下孵育過夜。加入1 500μL預(yù)冷的IP緩沖液洗脫凝膠。加入約40μL 2倍上樣緩沖液，100 ℃條件下變性5 min，稍離心，取適量體積進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)（western blot，WB），分別用商品化FLAG 標(biāo)簽（FLAG-tag）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)簽抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

采用同源重組法將FaGI與pCAMBIA1300-35S 載體進(jìn)行體外連接轉(zhuǎn)化，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥（Col-0），將其置于光照培養(yǎng)箱長(zhǎng)日照條件下常規(guī)培養(yǎng)，定期澆水。收獲的T0代種子經(jīng)消毒、洗滌后，均勻平鋪在具有潮霉素抗性（50 mg·L-1）的1/2 Murashige and skoog（MS）培養(yǎng)基上，春化48 h 后，將其置于光照培養(yǎng)箱長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)。待植株生長(zhǎng)10 d左右可將陽(yáng)性植株移栽到花盆土中篩選T1代植株種子，繼續(xù)篩選直至得到純合的FaGI-OE轉(zhuǎn)基因植株。

1.7 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

光周期的感知發(fā)生在葉片中，為研究擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化，取長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)的WT、FaGI-OE 和gi擬南芥蓮座葉片進(jìn)行RNA-seq 試驗(yàn)。取3 片葉混樣，3 次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍。將葉片樣品分成2 份，1 份用于轉(zhuǎn)錄組分析（委托蘇州諾米代謝公司完成），1份用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以長(zhǎng)日照條件下WT vs FaGIOE、WT vsgi光周期相關(guān)差異表達(dá)基因?yàn)橐罁?jù)，挑選在3 份材料中顯著上調(diào)或下調(diào)的9 個(gè)候選基因進(jìn)行qRTPCR 驗(yàn)證，引物由擎科生物科技有限公司（重慶）合成（表1）。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 稀釋4 倍作為模板，ACTIN為內(nèi)參，設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，3 次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.9 WT、FaGI-OE和gi的表型鑒定

將FaGI-OE 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株、WT 和gi置于光照培養(yǎng)箱長(zhǎng)日照條件下常規(guī)培養(yǎng)，定期澆水。觀測(cè)記錄WT、FaGI-OE 和gi植株的表型。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)花芽開放時(shí)，記錄開花天數(shù)和蓮座葉數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FaGI基因組織表達(dá)模式分析

本研究利用qRT-PCR 檢測(cè)長(zhǎng)日照和短日照條件下FaGI基因在高羊茅不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示。FaGI在根、莖、葉中均有表達(dá)，在葉片中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是莖，在根組織中的相對(duì)表達(dá)量最低。長(zhǎng)日照條件下，F(xiàn)aGI在葉中的表達(dá)量是莖中的3.9 倍、根的4.3 倍。短日照條件下，F(xiàn)aGI在葉中的表達(dá)量是莖中的12.0倍、根的15.0倍，說明FaGI在高羊茅中存在組織差異性表達(dá)。

圖1 長(zhǎng)日照（A）和短日照（B）條件下FaGI基因在高羊茅不同組織的表達(dá)量Fig.1 Expression of FaGI gene in different tissues of Festuca arundinacea under long-day（A）and short-day（B）conditions

2.2 蛋白互作

酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2），陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組、pGBKT7-FaGI/空載AD、pGBKT7-FaGI/pGADT7-FaCO 共轉(zhuǎn)化Y2Hgold 菌株均在二缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了克隆，說明共轉(zhuǎn)化成功；將SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上的克隆挑取至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒（BD-P53/AD-T）的菌株和試驗(yàn)組pGBKT7-FaGI/pGADT7-FaCO正常長(zhǎng)出克隆，而陰性對(duì)照組（BD-lam/AD-T）、自激活組（BD-FaGI/AD）均未長(zhǎng)出克隆。說明FaGI 和FaCO 存在蛋白互作關(guān)系。

圖2 酵母雙雜交試驗(yàn)顯示FaGI和FaCO相互作用Fig.2 Yeast two-hybrid assay showing the interaction of FaGI with FaCO

為了進(jìn)一步證實(shí)FaGI 與FaCO 蛋白互作關(guān)系，在本氏煙草葉片通過瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行基于黃色熒光蛋白（yellow fluorscent protein，YFP）的雙分子熒光互補(bǔ)檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。FaGI-nYFP/FaCO-cYFP（試驗(yàn)組）、BZlP63-nYFP/BZIP63-cYFP（陽(yáng)性對(duì)照）組合共同轉(zhuǎn)化的煙草下表皮細(xì)胞觀察到Y(jié)FP 信號(hào)，F(xiàn)aGI-nYFP/35S-cYFP、35S-nYFP/FaCO-cYFP 作為陰性對(duì)照并未觀察到Y(jié)FP 信號(hào)，僅有核熒光信號(hào)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)aGI和FaCO蛋白存在互作關(guān)系。

圖3 BiFC試驗(yàn)驗(yàn)證FaGI和FaCO互作Fig.3 BiFC assay confirming the interaction of FaGI and FaCO

FaCO 蛋白帶有FLAG 標(biāo)簽，F(xiàn)aGI 蛋白帶有Myc 標(biāo)簽。將提取的蛋白分成兩部分，一份是未經(jīng)任何處理的Input，另一份蛋白通過合成抗體或轉(zhuǎn)化標(biāo)簽加入對(duì)應(yīng)抗體，稱為免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）。FLAG 抗體檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，Input 樣本均有明顯的條帶，說明共轉(zhuǎn)化成功，使用FLAG 抗體對(duì)免疫沉淀下來的產(chǎn)物進(jìn)行WB 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)也有明顯的條帶，說明IP 成功。GFP 抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，Input 樣本均有明顯的條帶，說明共轉(zhuǎn)化成功，同時(shí)使用GFP 抗體對(duì)IP 得到的產(chǎn)物進(jìn)行WB 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有明顯的條帶，結(jié)果表明FaGI和FaCO有互作。

圖4 免疫共沉淀驗(yàn)證FaGI和FaCO在煙草葉肉細(xì)胞中的相互作用Fig.4 Co-immunoprecipitation assay confirming the interaction of FaGI and FaCO in N.benthamiana tobacco mesophyll cells

2.3 FaGI-OE轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的鑒定

將WT 和FaGI-OE 的擬南芥播種在含50 mg·L-1潮霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基上，播種7 d 后觀察到陽(yáng)性株會(huì)正常發(fā)芽、生根、葉片舒展，而非轉(zhuǎn)基因株系WT 逐漸黃化死亡（圖5）。以篩選出的潮霉素抗性植株的基因組DNA 為模板，進(jìn)行潮霉素抗性基因PCR 檢測(cè)（圖6），結(jié)果顯示，以WT未出現(xiàn)特異性條帶，而具有潮霉素抗性植株可擴(kuò)增到與目的片段大小一致的條帶，說明目的基因已整合到擬南芥基因組中。

圖5 含50 mg·L-1 潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上野生型和轉(zhuǎn)基因的表型差異Fig.5 Phenotypic differences between wild-type and transgenic on 1/2MS medium containing 50 mg·L-1 hygromycin

圖6 轉(zhuǎn)基因植株中潮霉素抗性基因的PCR驗(yàn)證Fig.6 PCR validation of hygromycin resistance gene in transgenic plants

2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)處理

2.4.1 RNA-seq 序列分析 為明確gi、FaGI-OE 植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平變化，對(duì)長(zhǎng)日照條件下WT、gi和FaGI-OE 株系的植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。去除低質(zhì)量下機(jī)序列（reads）后，9 個(gè)樣品均有超過90%的過濾后高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean reads）。將clean reads 與擬南芥的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR 10.dna.toplevel.fa）進(jìn)行比對(duì)，9 個(gè)樣品均有超過97%的唯一序列數(shù)目（unique reads）（表2）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，可用于后續(xù)分析。

表2 RNA-seq 的通量和質(zhì)量檢測(cè)Table 2 Throughput and quality detection of RNA-seq

2.4.2 長(zhǎng)日照條件下WT vsgi、WT vs FaGI-OE 差異表達(dá)基因比較 火山圖可直觀展示每個(gè)比較組合的差異基因分布情況。為了對(duì)同一時(shí)期過表達(dá)FaGI基因擬南芥、野生型和gi突變體之間差異表達(dá)關(guān)系進(jìn)行深入分析，利用Edge R（empirical analysis of DGE in R）軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，以表達(dá)差異倍數(shù)|log2 Fold Change|＞1、P＜0.05為篩選條件，篩選出長(zhǎng)日照條件下FaGI-OE 與WT、gi與WT 的差異基因，并用火山圖對(duì)鑒定基因進(jìn)行差異顯著性分析，WT vs FaGI-OE有1 963 個(gè)差異表達(dá)基因（differential expressed genes，DEGs），其中上調(diào)1 387 個(gè)，下調(diào)576 個(gè)；WT vsgi共有92 個(gè)DEGs，其中上調(diào)28 個(gè)，下調(diào)64 個(gè)（圖7、8）。上述結(jié)果表明，GI顯著影響葉片中的基因表達(dá)模式，為研究FaGI的生物學(xué)功能提供了理論基礎(chǔ)。

圖7 差異基因火山圖Fig.7 Differential genes volcano map

圖8 WT、FaGI-OE和gi差異基因表達(dá)基因數(shù)Fig.8 Number of differentially expressed genes in WT，F(xiàn)aGI-OE and gi

2.4.3 DEGs功能注釋與分析 為進(jìn)一步了解DEGs，用基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行分析，按照細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）進(jìn)行GO 分類，挑選富集最顯著的前10 個(gè)GO term條目。圖9為WT vs FaGI-OE 差異基因的GO 功能富集分析，在生物過程分類中，DEGs 主要富集在響應(yīng)刺激反應(yīng)的過程；在細(xì)胞組成分類中，DEGs 主要富集在細(xì)胞部分、細(xì)胞器部分和膜；在分子功能分類中，DEGs主要富集在結(jié)合、催化活性等功能。圖10為WT vsgiDEGs 的GO 功能富集分析，在細(xì)胞組成分類中，DEGs主要富集在植物型-細(xì)胞壁、非常規(guī)肌球蛋白復(fù)合物等部位中。在分子功能分類中，DEGs主要富集在半乳糖結(jié)合、木聚糖1，4-β-木糖苷酶活性等功能中。在生物過程分類中，DEGs 主要富集在生殖過程調(diào)控、調(diào)控胚胎后發(fā)育等過程中。

圖9 WT vs FaGI-OE差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.9 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in WT vs FaGI-OE

圖10 WT vs gi差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.10 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in WT vs gi

2.4.4 DEGs 的京都基因與基因百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析對(duì)WT vs FaGI-OE 的DEGs 進(jìn)行pathway 富集分析，結(jié)果如圖11、12 所示，這些DEGs 主要涉及植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、α-亞麻酸代謝、晝夜節(jié)律-植物等通路。其中涉及淀粉和蔗糖代謝通路的DEGs有16個(gè)。WT vsgi差異表達(dá)基因進(jìn)行pathway 富集分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs主要涉及過氧化物酶體、MAPK信號(hào)通路-植物、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、晝夜節(jié)律-植物等通路。說明在擬南芥中過表達(dá)FaGI-OE 會(huì)影響植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、α-亞麻酸代謝、晝夜節(jié)律-植物等通路。

圖11 WT vs FaGI-OE差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.11 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in WT vs FaGI-OE

圖12 WT vs gi差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.12 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in WT vs gi

2.4.5 與光周期相關(guān)DEGs 的分析 對(duì)WT vs FaGIOE 和WT vsgi中的DEGs 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖13、14所示。WT vs FaGI-OE 中，發(fā)現(xiàn)與光周期途徑相關(guān)上調(diào)的DEGs 有EFL3、MYB75、RUP1、ERD7、INVC、RVE8、BT2、GATA8、SMXL2、BZIP63、RVE1、RVE2、TEM1、RAV2、RTFL1、CDF2、SMZ，與光周期相關(guān)下調(diào)的DEGs有APRR5、ADO3（FKF1）、PRR1、FTIP1；WT vsgi中發(fā)現(xiàn)與光周期相關(guān)上調(diào)的DEGs 有COR15A、MAF5，與光周期相關(guān)下調(diào)的DEGs有GI、BT2、RVE2。

圖13 WT vs FaGI-OE的光周期途徑相關(guān)差異基因熱圖分析Fig.13 Heatmap analysis of photoperiod pathway-related differential genes in WT vs FaGI-OE

圖14 WT vs gi的光周期途徑相關(guān)差異基因熱圖分析Fig.14 Heatmap analysis of photoperiod pathway-related differential genes in WT vs gi

2.4.6 植物-病原體相互作用相關(guān)差異基因 在植物-病原體相互作用中，GI通過介導(dǎo)SA 信號(hào)通路參與擬南芥的疾病耐受性植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子既可作為植物基礎(chǔ)抗病的正調(diào)控因子，也可作為負(fù)調(diào)控因子［18-19］。WT vs FaGI-OE 中，對(duì)所有DEGs 進(jìn)行KEGG 富集，發(fā)現(xiàn)共有38 個(gè)與植物-病原體相互作用途徑相關(guān)的DEGs（圖15），其中上調(diào)基因有37個(gè)，下調(diào)基因1個(gè)；共注釋到14個(gè)CML基因，7個(gè)CPK基因，4個(gè)WRKY基因。14個(gè)CML基因中，13 個(gè)為上調(diào)基因，1 個(gè)為下調(diào)基因；7個(gè)CPK基因和4個(gè)WRKY基因均上調(diào)。

圖15 WT vs FaGI-OE的植物-病原體相互作用相關(guān)差異基因Fig.15 Differential genes associated with plant-pathogen interactions in WT vs FaGI-OE

2.5 qRT-PCR檢驗(yàn)

為了進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，從DEGs中隨機(jī)抽取9 個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 檢驗(yàn)（圖16）。結(jié)果表明，BT2、GATA8、TEM1、BZIP63、RVE2在FaGI-OE中的相對(duì)表達(dá)量高于WT，APRR5、FKF1 在FaGI-OE中的相對(duì)表達(dá)量低于WT；COR15A 在gi中的相對(duì)表達(dá)量高于WT，BT2、GI、RVE2在gi中的相對(duì)表達(dá)量低于WT。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和DEGs 數(shù)據(jù)與定量驗(yàn)證結(jié)果相符，進(jìn)一步表明分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖16 通過qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)Fig.16 Validation of RNA-seq data by qRT-PCR

2.6 FaGI基因促進(jìn)擬南芥開花

以野生型WT（Col-0）擬南芥為對(duì)照，對(duì)陽(yáng)性擬南芥植株FaGI-OE 和gi突變體擬南芥植株的花期進(jìn)行記錄，結(jié)果如圖17所示。長(zhǎng)日照條件下，在相同的環(huán)境下培養(yǎng)，F(xiàn)aGI-OE植株表現(xiàn)出早花表型，野生型開花時(shí)間為27.60 d，F(xiàn)aGI-OE 植株開花時(shí)間開花時(shí)間為26.46 d，比野生型Col-0 提前約1.24 d，與野生型蓮座葉相比，過表達(dá)FaGI基因擬南芥蓮座葉數(shù)量為11，突變體gi屬于晚花表型播種52 d后開花，表明FaGI基因促進(jìn)擬南芥提前開花。

圖17 轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時(shí)間、蓮座葉數(shù)量及生長(zhǎng)表型Fig.17 Flowering time，number of rosette leaves and growth phenotype in transgenic Arabidopsis

3 討論

前人研究表明，GI在CO/FT 調(diào)節(jié)模塊中的影響可能發(fā)生在多個(gè)層面，例如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA 相互作用［6，20］。GI 與CO 直接相互作用，F(xiàn)KF1、GI和CO可能形成三聚體復(fù)合物并穩(wěn)定CO［21-22］。本研究通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀三種方法，證明FaGI和FaCO在體內(nèi)和體外互作，推測(cè)FaGI在CO/FT模塊中有相似的調(diào)控機(jī)制。

Zhang 等［23］發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥RVE2基因受到不同光照處理后，其表達(dá)模式發(fā)生了顯著變化，在擬南芥中過表達(dá)RVE2可以影響光周期相關(guān)基因EPRI、Lhcb和CAT3等表達(dá)，使擬南芥開花時(shí)間提前，表明RVE2可能是植物光周期調(diào)節(jié)通路中重要基因之一。此外，其他研究發(fā)現(xiàn)，RVE8通過與啟動(dòng)子的晚間元件（evening element，EE）直接結(jié)合，促進(jìn)PRR5和TOC1以及其他晚間基因，包括LUX、ELF4和GI的表達(dá)，RVE8基因與PRR5基因可以形成負(fù)反饋通路，二者呈相互抑制關(guān)系，共同參與影響植物生物鐘［24-25］。本研究通過比較WT和FaGI-OE差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，RVE1、RVE2、RVE8均上調(diào)，表明FaGI通過影響RVE轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物光周期途徑和晝夜節(jié)律。CDF2被報(bào)道是控制花期的CO轉(zhuǎn)錄抑制因子，F(xiàn)KF1 可以在藍(lán)光下與GI 結(jié)合，GIFKF1 復(fù)合體可導(dǎo)致開花抑制子CDF1 及CDF2 的泛素化降解［26］。FT基因在維管束和葉肉細(xì)胞表達(dá)受體內(nèi)TEM1和TEM2的抑制［27］，GI 蛋白與FT啟動(dòng)子區(qū)緊密聯(lián)系，該區(qū)域是FT抑制子TEM1和TEM2的結(jié)合位點(diǎn)。GI通過阻止FT抑制子結(jié)合FT基因啟動(dòng)子區(qū)而中和其對(duì)FT基因的抑制作用，或者是影響抑制子的活性和穩(wěn)定性，來調(diào)控FT基因的表達(dá)［28］。FTIP1在長(zhǎng)日照下能調(diào)控?cái)M南芥的開花，過量表達(dá)可能會(huì)引起FT蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)混亂，被移除韌皮部，無法進(jìn)入篩管而導(dǎo)致晚花［29］。本研究在比較WT 和FaGI-OE 光周期途徑差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)TEM1、CDF2上調(diào)，APRR5、FKF1、PRR1、FTIP1下調(diào)，未觀察到下游基因CO和FT存在表達(dá)差異，這表明在從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過渡到生殖生長(zhǎng)的過程中存在其他因素，該結(jié)果表明了光周期途徑調(diào)控的復(fù)雜性。

GI涉及植物的許多生理過程，在其他重要的生物學(xué)功能中也有報(bào)道，例如非生物脅迫、蔗糖代謝和細(xì)胞壁沉積［12］。在擬南芥中，GI可以通過SOS 途徑負(fù)調(diào)節(jié)耐鹽性［2］，并通過不依賴CBF 的途徑正向調(diào)節(jié)低溫馴化［30］。此外，GI對(duì)ABA 依賴性干旱耐受性具有重要意義，并且參與了由miR172-WRKY44 介導(dǎo)的干旱耐受性途徑［31］。GI 能夠通過穩(wěn)定DELLA 蛋白來控制赤霉素（gibberellins，GAs）信號(hào)，并通過與擬南芥中的EEL蛋白相互作用來調(diào)節(jié)ABA合成以增強(qiáng)耐旱性［32］。Viana等［33］的研究結(jié)果表明bZIP63在能量狀態(tài)和晝夜節(jié)律之間起作用，用以響應(yīng)淀粉降解和能量壓力，通過晝夜循環(huán)微調(diào)碳利用。在晝夜循環(huán)中，bZIP63突變體表現(xiàn)出生長(zhǎng)受損、淀粉降解速率發(fā)生變化。此外，bZIP63被證明通過參與糖的夾帶而直接影響生物鐘［34］，生物鐘則反饋調(diào)節(jié)bZIP63表達(dá)。通過比較WT和FaGI-OE差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)bZIP63上調(diào)，推測(cè)過表達(dá)FaGI影響擬南芥淀粉的降解。Pritha 等［35］研究表明，在擬南芥和小麥中，GI可能是斑點(diǎn)病防御的負(fù)調(diào)節(jié)劑，GI表達(dá)與擬南芥和小麥對(duì)斑點(diǎn)病菌感染的易感性呈正相關(guān)。通過轉(zhuǎn)錄組分析，WT vs FaGI-OE 差異基因富集在植物-病原體相互作用、激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)、對(duì)刺激的反應(yīng)等相關(guān)的生物過程和代謝通路，這說明FaGI參與非生物脅迫、蔗糖代謝、病原體防御等生理過程，也說明FaGI基因功能的多樣性。

4 結(jié)論

本研究通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和免疫共沉淀證實(shí)了FaGI 和FaCO 在體內(nèi)和體外存在互作關(guān)系，在長(zhǎng)日照條件下過表達(dá)FaGI基因促進(jìn)擬南芥開花；轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，推測(cè)FaGI基因除了參與光周期途徑外，還參與非生物脅迫、蔗糖代謝、病原體防御等生理過程。