周丹,朱梅,韋雪嬌,胡華林,程搏幸*

太子參連作根際土壤中3株真菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

周丹1,朱梅1,韋雪嬌1,胡華林2,程搏幸1*

1. 貴州師范學(xué)院生物科學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550018 2.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥物植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550014

本文對(duì)太子參連作根際土壤分離培養(yǎng)的3株真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并從溫度、pH、碳源及光照等方面對(duì)其生物學(xué)特性影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)菌株形態(tài)進(jìn)行觀察和結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，初步判斷菌株A為卵形球托霉(，菌株F為赭綠青霉()，菌株L為尖孢鐮刀菌（)。菌株A在以D-果糖為碳源、溫度30 ℃、pH 11、連續(xù)黑暗培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好。菌株F在以糊精為碳源、溫度25 ℃、pH值5和6、12 h光暗交替培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好。菌株L以α-乳糖為碳源，溫度條件為25 ℃，堿性條件下，連續(xù)黑暗或12 h光暗培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)較好。

太子參; 土壤微生物; 生物學(xué)特性

太子參（）為石竹科植物，其異葉偽繁縷的塊根為主要經(jīng)濟(jì)部位，被國(guó)家衛(wèi)生部登記“可用于保健食品的中藥材名錄”[1]。至被貴州省列為重點(diǎn)中藥材特色產(chǎn)業(yè)以來(lái)，種植面積迅速增加，持續(xù)位居全國(guó)第一[2]。太子參產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，由于土地資源有限，連作成為太子參種植的主要方式，使得太子參種植過(guò)程中真菌病害頻發(fā)，從而導(dǎo)致其連作障礙加劇，嚴(yán)重的影響了太子參的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。連作導(dǎo)致作物土壤真菌增加，其指示真菌已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)[4,5]。高慧芳等[6]已從不同的太子參連作樣地根際土壤中檢測(cè)出優(yōu)勢(shì)屬中兩種常見(jiàn)真菌為致病菌，Chen J等[7]和Wu L等[8]已經(jīng)證實(shí)真菌中的鐮刀菌是引起太子參連作效應(yīng)的一類(lèi)高致病菌。而目前太子參連作過(guò)程的真菌研究多以葉片病原真菌、土壤微生物多樣性研究為主[6,9]，對(duì)其根際土壤真菌生物學(xué)特性的報(bào)道不夠全面。根際真菌在作物生長(zhǎng)過(guò)程中受溫度、pH、碳源等因素的影響，明確其生物學(xué)特性可為防治病害奠定基礎(chǔ)。鑒于根際土壤中病原真菌對(duì)太子參產(chǎn)業(yè)潛在的威脅，本研究從施秉縣桐木榜村太子參連作三年根際土壤中，對(duì)已篩選獲得的3株真菌進(jìn)行分離鑒定和明確其種屬類(lèi)型后，對(duì)其生物學(xué)特性研究，探究溫度、pH值、光照以及培養(yǎng)基碳源對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以期了解3株真菌的生長(zhǎng)規(guī)律，為今后進(jìn)一步探究太子參連作根際土壤中病原真菌或拮抗真菌在連作過(guò)程中對(duì)太子參的致病特性或拮抗特性的研究奠定基礎(chǔ)，也為深入開(kāi)展太子參連作過(guò)程病原真菌的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2020年6月從貴州省施秉縣桐木榜村太子參基地采集連作三年根際土，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 真菌的分離純化

將根際土壤用無(wú)菌水制備為土壤懸液后，移取0.5 mL接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)24 h。觀察并記錄菌株的菌落形態(tài)、顏色等，并對(duì)其進(jìn)行分離純化后，將菌株保存于試管斜面，4 ℃下保存[10]。

1.3 真菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察本實(shí)驗(yàn)共篩選出40余株真菌純菌株。經(jīng)多次純化后，將其中3株形態(tài)特征較為穩(wěn)定的菌株分別接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察并拍照記錄菌落顏色、菌絲特征、菌落形態(tài)特征及生長(zhǎng)情況。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定將純化的3株真菌分別接種于液體培養(yǎng)基中，置于溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)3 d。將菌絲球按照真菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）說(shuō)明書(shū)提取病原菌基因組DNA。使用PCR擴(kuò)增試劑盒、引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3）和ITS4ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）（上海生工公司合成）對(duì)所提取的菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂電泳后，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得的核苷酸序列提交至blastGenBank中的序列進(jìn)行同源比較，以FASTA格式下載后，用MEGA7.0軟件比較測(cè)序結(jié)果的同源性，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 生物學(xué)特性

1.4.1 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響取置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，菌絲生長(zhǎng)良好的菌落平板，沿菌落邊緣用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，分別在4、10、15、20、25、30、35、40 ℃八個(gè)不同溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]，用十字交叉法測(cè)量并記錄其5 d的菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4.2 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將培養(yǎng)基的pH值設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0七個(gè)梯度，用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養(yǎng)基調(diào)到不同pH值。使用直徑為5 mm的打孔器，沿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d的菌落平板邊緣打取菌餅，接種于不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d養(yǎng)[12]，測(cè)量及培養(yǎng)方法同1.3.1，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4.3 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響本實(shí)驗(yàn)以麥芽糖、D-果糖、α-乳糖、糊精、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉為供試碳源，按比例配制不同碳源類(lèi)型培養(yǎng)基[13]。取于25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d的菌落平板，沿菌落邊緣用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，接種到不同碳源培養(yǎng)基上，培養(yǎng)及測(cè)量方法同1.3.1，每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.4.4 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響用打孔器沿菌落邊緣取出直徑為5 mm的菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基平板中，培養(yǎng)及測(cè)量方法同1.3.1，每個(gè)處理重復(fù)5次。在全光、12 h光暗交替和黑暗條件下培養(yǎng)5 d[11,14,15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察如圖1所示，3株菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的情況。菌株A菌落正面為白色，背面略呈放射輪紋狀。中間菌絲濃密，邊緣質(zhì)地薄且呈半透明狀；菌落近圓形，氣生菌絲半透明，絨毛狀平鋪，透明圓形孢子囊。菌株F菌落正面為綠松石色，邊緣為白色，菌落表面呈粉末狀，以同心徑向環(huán)的形式向外延伸，具橫隔，氣生菌絲松絮狀。在PDA培養(yǎng)基上，菌株L的菌落呈圓形、隆起、絮狀，菌絲為淡粉色或淡紫色，小型分生孢子無(wú)色，卵圓形。

圖 1 菌株A, F, L在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和顯微特征

注：a, b-菌落A形態(tài)；c-菌落A顯微形態(tài)；d, e-菌落F形態(tài)；f-菌落F顯微形態(tài)；g, h-菌落L形態(tài); i-菌落L顯微形態(tài)。

Note: a,b-Morphological characteristics of A;c-Microscopiccharacteristics of A;d,e-Morphological characteristics of F; f-Microscopiccharacteristics of F; g, h-Morphological characteristics of L; i-Microscopiccharacteristics of L.

2.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株A、F、L的ITS片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增并測(cè)序，得到的序列于BLAST中，選取同源性較高的序列，用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明，菌株A與卵形球托霉（）同源高，菌株F與赭色青霉（）同源性高，菌株L與尖孢鐮刀菌（）基因同源性高，結(jié)合形態(tài)特征初步判斷三種菌株分別為卵形球托霉（）、赭綠青霉（）、尖孢鐮刀菌（）。

圖 2 基于ITS基因序列片段構(gòu)建的菌株A,F,L系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 生物學(xué)特性

2.3.1 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同溫度條件下培養(yǎng)5 d后，3株菌株的生長(zhǎng)速度如圖3（<0.05），不同溫度條件下3株菌株生長(zhǎng)量都存在顯著差異。溫度在15 ℃以下、35 ℃以上菌絲均難以生長(zhǎng)，菌株A的最佳生長(zhǎng)溫度為25～35 ℃，平均菌落直徑為35.9～47.8 mm，平均生長(zhǎng)速度為7.18～9.56 mm/d，菌株F和菌株L的最佳生長(zhǎng)溫度為20～30 ℃，菌株F的平均菌落直徑為30.2～44.8 mm，平均生長(zhǎng)速度為6.04～8.96 mm/d，菌株L的平均菌落直徑為29.3～39.6 mm，平均生長(zhǎng)速度為5.86～7.92 mm/d。在15～35 ℃范圍內(nèi)，3株菌株菌絲生長(zhǎng)均呈現(xiàn)由弱到強(qiáng)、再由強(qiáng)到弱的趨勢(shì)。

圖 3 不同溫度對(duì)菌株A, F,L菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3.2 不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響3株菌株在不同pH條件下的菌落直徑如圖4（<0.05），在pH5～11的范圍內(nèi)3株菌株均能生長(zhǎng)。pH10和11的情況下，菌株A的菌落直徑略大于其他pH值的培養(yǎng)基。不同pH條件下菌株F生長(zhǎng)具有顯著差異，且在堿性條件下生長(zhǎng)較好。菌株L在堿性條件下平均生長(zhǎng)速率明顯大于酸性與中性培養(yǎng)基，由此可知，菌株A和菌株L適于在堿條件下生長(zhǎng)，菌株F適于在弱酸性和中性環(huán)境中生長(zhǎng)。

圖 4 不同pH值對(duì)菌株A,F,L菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3.3 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響培養(yǎng)5 d后，不同碳源條件下菌株A、F、L菌落生長(zhǎng)直徑如圖5（<0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3株菌株在供試的七種碳源培養(yǎng)基菌落均生長(zhǎng)良好。菌株A在不同碳源上的生長(zhǎng)速率D-果糖>可溶性淀粉>糊精>麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>α-乳糖，其中D-果糖上菌落平均生長(zhǎng)速率為9.4 mm/d，而α-乳糖上平均生長(zhǎng)速度為6.42 mm/d。菌株F在以糊精為碳源上平均生長(zhǎng)速度為8.36 mm/d，在可溶性淀粉上平均生長(zhǎng)速度為7.86 mm/d。菌株L在不同碳源條件下菌落直徑差異顯著，在不同碳源上的生長(zhǎng)速率α-乳糖>可溶性淀粉>糊精>麥芽糖>葡萄糖>D-果糖>蔗糖，在α-乳糖平均生長(zhǎng)速率達(dá)13.1 mm/d，而在蔗糖上的生長(zhǎng)速率僅為6.76 mm/d。

圖 5 不同碳源對(duì)菌株A,F,L菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3.3 不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同光照條件下培養(yǎng)5 d后株菌A、F、L菌落生長(zhǎng)情況如圖6（<0.05）。從圖中可以看出，不同光照條件對(duì)菌株A、F、L菌落生長(zhǎng)影響程度不同，但均能生長(zhǎng)良好。菌株A與菌株F菌落直徑生長(zhǎng)差異明顯，菌株A的生長(zhǎng)速率在連續(xù)黑暗>12 h光暗交替>連續(xù)光照。菌株F在12 h光暗交替條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快。菌株L對(duì)光的敏感程度低于菌株A與菌株F，在12 h光暗交替和連續(xù)黑暗條件下菌生長(zhǎng)量無(wú)顯著差異，且生長(zhǎng)速率大于連續(xù)光照條件下菌生長(zhǎng)速率。

圖 6 不同光照條件對(duì)菌株A,F,L菌絲生長(zhǎng)的影響

3 討 論

連作是導(dǎo)致太子參生長(zhǎng)發(fā)育受阻、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差、土傳病增加的主要原因之一，目前學(xué)術(shù)界關(guān)于太子參連作障的研究礙日益增多，以期為太子參事業(yè)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。本研究針對(duì)所篩選出的3株真菌展開(kāi)分子生物學(xué)鑒定與生物學(xué)特性研究，對(duì)其菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行比較分析，以了解所分離菌的生長(zhǎng)環(huán)境因子。結(jié)果表明，菌株A與卵形孢球托霉（）菌落形態(tài)相似[16]，菌株A與卵形孢球托霉（MH857761.1）同源性為96%，初步鑒定為卵形孢球托霉。菌株F與王帆等[15]所研究的赭綠青霉在形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性上具有很高的相似性，與赭綠青霉（）（MT072050.1）同源性高達(dá)99%，初步鑒定為赭綠青霉。本研究同時(shí)參考了國(guó)內(nèi)報(bào)道的三七根腐病、設(shè)施韭菜根腐、甘草根腐病等研究報(bào)道尖孢鐮刀菌的形態(tài)特征[17-21]，以及對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，菌株L與菌株（）（MW513784.1）同源性高達(dá)99.8%，初步鑒定菌株L為尖孢鐮刀菌。并結(jié)合國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道，卵形孢球托霉報(bào)道了因其產(chǎn)生乳酸使石灰石中Ca、Mg等離子溶出，從而對(duì)石灰石產(chǎn)生侵蝕作用[16]。赭綠青霉對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)、家蠶幼蟲(chóng)及柑橘全爪螨雌有一定的生防作用[19]。鐮刀屬菌則被報(bào)道為多數(shù)作物的主要致病菌之一，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量及品質(zhì)。如，汪靜等[22]在三七根腐病的研究中發(fā)現(xiàn)其中一株致病菌為尖孢鐮刀菌；肖榮鳳等[23]研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致太子參根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌。因此，可初步推測(cè)本次所分離的卵形孢球托霉和尖孢鐮刀菌侵染太子參后具有一定的致病性，而赭綠青霉可能對(duì)太子參的蟲(chóng)害存在一定防治作用，且從太子參根際土壤中分離篩選出卵形孢球托霉和赭綠青霉屬首次報(bào)道。

對(duì)于一種連作障礙嚴(yán)重的作物，明確其連作過(guò)程根際土壤真菌物種的同時(shí)，了解其生物學(xué)特性是開(kāi)展連作障礙機(jī)理和緩解效應(yīng)研究的前提，不僅可以明確其真菌在環(huán)境種的適應(yīng)能力，也有利于了解連作障礙發(fā)生與環(huán)境因素之間的聯(lián)系。本試驗(yàn)不同溫度、pH值、碳源和光照條件下對(duì)3株真菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行了了解，發(fā)現(xiàn)3株菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求均不嚴(yán)格，在所有供試培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)。關(guān)于菌株A的生物學(xué)特性研究報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)其以D-果糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)速度最快，最適生長(zhǎng)溫度25～35 ℃，適合在堿性條件下生長(zhǎng)。本研究得出菌株F的生長(zhǎng)速度最快的碳源為糊精，與前人研究差異較大[15]，這可能是赭綠青霉在不同環(huán)境下利用碳源的差異較大；最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，適宜于弱酸性和中性環(huán)境中生長(zhǎng)。關(guān)于菌株L的生物學(xué)特性研究，研究者們認(rèn)為其適宜多種碳源[17,24]，但少有關(guān)注以糊精為碳源的生長(zhǎng)情況，本研究得出其在糊精為碳源培養(yǎng)基也能較好的生長(zhǎng)，但α-乳糖為最佳碳源；其適宜培養(yǎng)溫度與敬雪敏等[24]研究結(jié)果基本一致，適宜于堿性條件。同時(shí)，3株菌株在三種光照條件下均能較好生長(zhǎng)，說(shuō)明光照對(duì)其的生長(zhǎng)影響較小。

本研究通過(guò)菌落形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)太子參連作三年根際土壤中3株真菌進(jìn)行了初步鑒定，并通過(guò)生物學(xué)特性試驗(yàn)初步明確了3株真菌菌絲的最適條件，對(duì)其生活習(xí)性有了初步的了解，為今后進(jìn)一步探究太子參連作根際土壤中病原真菌或拮抗真菌在連作過(guò)程中對(duì)太子參的致病特性或拮抗特性的研究奠定基礎(chǔ)，也為深入開(kāi)展太子參連作過(guò)程病原真菌的防治提供一定的理論依據(jù)。但卵形孢球托霉和尖孢鐮刀菌對(duì)太子參的侵染機(jī)制，以及赭綠青霉對(duì)太子參是否具有生防作用還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

（1）通過(guò)對(duì)菌株形態(tài)進(jìn)行觀察和結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，初步判斷菌株A為卵形球托霉()，菌株F為赭綠青霉()，菌株L為尖孢鐮刀菌（)；

（2）菌株A在以D-果糖為碳源、溫度30 ℃、pH值11、連續(xù)黑暗培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好。菌株F在以糊精為碳源、溫度25 ℃、pH值5和6、12 h光暗交替培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好。菌株L以α-乳糖為碳源，溫度條件為25 ℃，堿性條件下，連續(xù)黑暗或12 h光暗培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)較好。

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Isolation, Identification and Biological Characteristics of Three Fungi from Continuous Cropping Rhizosphere Soil of

ZHOU Dan1, ZHU Mei1, WEI Xue-jiao1, HU Hua-lin2, CHENG Bo-xing1*

1.550018,2.550014,

Three strains of fungi isolated from Continuous Cropping RhizosphereSoil ofwere identified by molecular biology, and the effects of temperature, pH, carbon source and light on their biological characteristics were studied. The results showed that strain A was identified asand strain F was identified asby morphological observation and phylogenetic tree analysis. Strain L was. Strain A grew well under continuous dark culture condition with D-fructose as carbon source, temperature 30 ℃, pH 11. Strain F grew well under the condition of alternating light and dark culture with dextrin as carbon source, temperature 25℃, pH 5, 6, 12 h. Strain L grew well with α-lactose as carbon source under the condition of 25 ℃, alkaline, continuous dark or 12 h light dark culture.

;soil microbe;biological characteristics

S154.3

A

1000-2324(2022)06-0839-06

2022-10-21

2022-12-21

貴州省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2021]一般245);貴州省青年科技項(xiàng)目(黔教合KY字[2021]242);貴州師范學(xué)院“大地論文工程”科研成果(貴師院發(fā)[2020]99號(hào));食用菌黑腹果蠅綠色防控關(guān)鍵技術(shù)研究(黔科合支撐[2019]2334)

周丹(1979-),女,碩士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要從事連作障礙工作. E-mail:zhoudan_213@163.com

Author for correspondence. E-mail:kama225cbx@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.004