宣成睿， 塔拉， 王翠艷， 徐曉艷

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 呼和浩特 010059； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科， 呼和浩特 010017； 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室， 呼和浩特 010059)

腎癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中僅次于膀胱癌的第二大致命癌癥，占所有成人惡性腫瘤的5%[1]。2018年，國(guó)際癌癥研究中心的數(shù)據(jù)顯示：在全球范圍內(nèi)，腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是男性第六大最常診斷的癌癥，在女性中排名第十，分別占所有腫瘤診斷的5%和3%[2-3]。腎細(xì)胞癌約占腎臟腫瘤的90%，其中85%為腎透明細(xì)胞癌。早期RCC 通常是無(wú)癥狀的，17% 的患者在診斷時(shí)已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。手術(shù)切除仍是臨床局限性腎癌的有效治療手段，但對(duì)于晚期腎癌，由于易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，并且RCC對(duì)常規(guī)治療方式的敏感性較差，患者5年生存率不足10%[4]。在中國(guó)，腎癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，自回歸移動(dòng)平均模型分析顯示：2025年腎癌死亡率將達(dá)到1.81/10萬(wàn)人，較2019年增加7.74%[5]。腎癌的患病率在逐年攀升，死亡率居高不下，但是腎癌致癌的分子機(jī)制仍不清楚[6]。基于早期診斷是降低患者死亡率的有效途徑，明確腎透明細(xì)胞癌診斷相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，變得尤為重要。

趨化素樣因子1(chemokine like factor 1, CKLF1)是由北京大學(xué)首次成功克隆的一個(gè)細(xì)胞因子。該因子化學(xué)性質(zhì)活潑，可對(duì)多種細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生趨化活性[7]。CKLF1的高表達(dá)與肝癌、卵巢癌的發(fā)生以及不良預(yù)后相關(guān)[8-9]，在腎癌中的作用目前未見相關(guān)報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，CKLF1在腎癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[10]，為進(jìn)一步明確CKLF1對(duì)腎癌細(xì)胞生物活性的影響，現(xiàn)通過(guò)將質(zhì)粒pEGF-N1-CKLF1轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞ACHN,實(shí)現(xiàn)CKLF1的過(guò)表達(dá)。觀察CKLF1對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN細(xì)胞周期、增殖以及凋亡的影響，并探討其發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎透明細(xì)胞癌ACHN細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院；真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-CKLF1及空載體pEGFP-N1由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫系韓文玲教授惠贈(zèng)。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海酶聯(lián)生物科技有限公司; Cyclin D1、Bcl-xL、STAT3、P-STAT3、GAPDH一抗、二抗均購(gòu)自Abcam公司。YF647A-AnnexinV 凋亡試劑盒購(gòu)自宇恒生物公司。SF細(xì)胞系4D細(xì)胞核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Lonza公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó) Heraeus 公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD公司。IncuCyte系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó) Essen BioScience 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組

實(shí)驗(yàn)分為兩組即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)組ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CKLF1質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ACHN細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)說(shuō)明書，采用MEM培養(yǎng)基加終濃度為10%胎牛血清，置于37 ℃含5% 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用Lonza公司的細(xì)胞核轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別將實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒pEGFP-N1-CKLF1和對(duì)照組質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入ACHN細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。具體操作如下:將消化好的ACHN細(xì)胞，置于高壓滅菌處理的1.5 mLEP管中，用100 μL Nucleofector電轉(zhuǎn)液重懸將細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1.0×106。將2 μg pEGFP-N1-CKLF1和2 μg pEGFP-N1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，分別加入上述電轉(zhuǎn)液中，充分混勻。將混勻后的溶液分別置于專用電轉(zhuǎn)杯，調(diào)節(jié)電轉(zhuǎn)條件及參數(shù)，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。分別向電轉(zhuǎn)完成后的各組細(xì)胞中加入400 μL含血清培養(yǎng)液，充分混勻，導(dǎo)入到加入2.5 mL含血清培養(yǎng)液的6孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡拍照,觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，及表達(dá)CKLF1的細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)比例,反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 轉(zhuǎn)染后 ACHN細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后的ACHN細(xì)胞懸液接種于96孔板,細(xì)胞密度6×103個(gè)/孔，在接種24、48、72 h后，每孔分別加入10 μL的CCK-8檢測(cè)試劑，混勻后置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀490 nm下檢測(cè)樣品吸光度值。

1.2.6 轉(zhuǎn)染后 ACHN細(xì)胞周期檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ACHN細(xì)胞用胰酶消化處理，置EP管中1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入預(yù)冷的PBS洗滌一次,吸除PBS，緩慢滴入1 mL75%預(yù)冷乙醇。緩慢搖勻，置于-20 ℃冰箱固定4 h。取出固定好的細(xì)胞置于4 ℃離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，棄掉乙醇。用預(yù)冷PBS液洗滌細(xì)胞兩次,每次1 000 r/min離心5 min。之后棄上清,加入1 mL預(yù)冷PBS緩沖液重懸細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明加入配好的碘化丙啶染色液，混勻避光30 min。上機(jī)前濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.7 轉(zhuǎn)染后ACHN凋亡檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后的腎癌ACHN細(xì)胞，分別接種于6孔板中。每組3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。將各組細(xì)胞消化，離心，用預(yù)冷的 PBS洗滌細(xì)胞，加入 500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后每組細(xì)胞各加入AnnexinV 和PI各5 μL，室溫避光放置15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

Hochest染色：將滅菌后的蓋玻片置于6孔板中，將轉(zhuǎn)染后的腎癌ACHN細(xì)胞，接種于六孔板中，進(jìn)行細(xì)胞爬片。48 h后，PBS沖洗細(xì)胞兩次， 4%的多聚甲醛室溫固定20 min。加入Hoechst 33258 染色液0.5 mL覆蓋整個(gè)蓋玻片，室溫避光染色5 min。吸除染色液，PBS清洗一次。熒光顯微鏡下拍照。

1.2.8 western blot檢測(cè)蛋白Cyclin D1、 Bcl-xL、STAT3、P-STAT3表達(dá)情況

將轉(zhuǎn)染后的腎癌ACHN細(xì)胞，分別接種于6孔板中。48 h后，將RIPA細(xì)胞裂解液加入6孔板中，裂解細(xì)胞，裂解后進(jìn)行總蛋白提取。使用酶標(biāo)儀BCA法分別測(cè)定所提取的蛋白濃度。取30 μg蛋白加入 5×Loading Buffer，沸水中煮10 min，使蛋白質(zhì)變性。常規(guī)SDS PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。加入cyclin D1一抗(1∶1 000), Bcl-xL一抗(1∶1 000)，GAPDH 一抗(1∶5 000)，STAT3(1∶1 000)、P-STAT3(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜。洗膜后加入二抗(1∶10 000)，使用Odyssey LI-COR紅外成像系統(tǒng)收集熒光信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果分析

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，90%以上的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，證明轉(zhuǎn)染效率很好。如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ACHN細(xì)胞48 h后表達(dá)情況Fig.1 Expression of ACHN cells 48 hours after plasmid transfection

2.2 轉(zhuǎn)染后 ACHN細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

CCK8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染24 h后，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值與對(duì)照無(wú)明顯差異，(P>0.05)轉(zhuǎn)染48、72 h后，實(shí)驗(yàn)組吸光度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，如圖2所示。

*表示與對(duì)照組比較P<0.05圖2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig.2 CCK8 experimental test results

2.3 轉(zhuǎn)染后 ACHN細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞周期變化如圖3所示。與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖指數(shù)(perliferation index,PI)即G2+S期細(xì)胞所占比例明顯高于對(duì)照組。如圖4所示。

圖3 轉(zhuǎn)染48h后ACHN細(xì)胞周期變化情況Fig.3 Changes of ACHN cell cycle 48 h after transfection

*表示與對(duì)照組相比較P <0.01圖4 ACHN細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖指數(shù)變化情況Fig.4 Changes of proliferation index of ACHN cells after transfection

2.4 CKLF1過(guò)表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN凋亡的影響

Hochest染色結(jié)果顯示:對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均呈淡藍(lán)色熒光染色，非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒；而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍(lán)色，細(xì)胞核染色增強(qiáng),熒光更為明亮,呈圓形或者固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，如圖5所示。

流式細(xì)胞的細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，如圖6和圖7所示。

紅色箭頭所指為凋亡細(xì)胞圖5 Hochest染色細(xì)胞凋亡形態(tài)變化Fig.5 Hochest staining for morphological changes of apoptosis

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況Fig.6 Flow cytometry detection of cell apoptosis after transfection

*表示與對(duì)照組比較P <0.05圖7 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率變化Fig.7 Changes in apoptosis rate after transfection

2.5 western blot 檢測(cè)蛋白cyclin D1、 Bcl-xL、STAT3、P-STAT3表達(dá)情況

western blot結(jié)果顯示CKLF1過(guò)表達(dá)48 h后，與對(duì)照組相比較細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，P<0.05(圖8)。抑制凋亡的 Bcl-xL蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比較，明顯升高P<0.05(圖9)。STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比較，無(wú)明顯差異(P>0.05)，而與對(duì)照組相比較P-STAT3的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，P<0.05(圖10)。

*表示與對(duì)照組相比較P<0.05圖8 CKLF1對(duì)蛋白CycD1表達(dá)的影響Fig.8 The effect of CKLF1 on the expression of protein CycD1

*表示與對(duì)照組相比較P<0.05圖9 CKLF1過(guò)表達(dá)對(duì)Bcl-xL蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of CKLF1 overexpression on Bcl-xL protein expression

3 討論與結(jié)論

腎癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)生 RCC 的終生風(fēng)險(xiǎn)在1.3%～1.8%。根據(jù)世界衛(wèi)生組織提供的最新數(shù)據(jù)，每年有超過(guò) 14 萬(wàn)例腎細(xì)胞癌相關(guān)死亡病例[11]。目前臨床治療中尚無(wú)有效的早期診斷腎細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物，腎癌發(fā)病的分子機(jī)制尚不清楚。因此，更好地了解 RCC發(fā)生 的分子機(jī)制并制定有效的診療策略對(duì)患者來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

正常情況下，機(jī)體通過(guò)神經(jīng)、體液等機(jī)制，對(duì)體內(nèi)一切細(xì)胞的增殖、分化、凋亡起著精確的調(diào)節(jié)作用。自主性增殖、凋亡受阻是腫瘤發(fā)生以及病程進(jìn)展的關(guān)鍵。大量研究證實(shí)，細(xì)胞因子對(duì)腎癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后具有重要調(diào)控作用。腎細(xì)胞癌患者外周血漿中，細(xì)胞因子IL-22的異常表達(dá)有可能促進(jìn)RCC的臨床進(jìn)展、細(xì)胞因子IL-22的表達(dá)水平可能與RCC的惡性程度相關(guān)[12]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào),且與病理分期呈負(fù)相關(guān)[13]。胰島素樣生長(zhǎng)因子 1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)與其相應(yīng)的配體結(jié)合對(duì)腎透明細(xì)胞癌的增殖和進(jìn)展起重要作用。在缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和在缺氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)同時(shí)存在的情況下，缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子(Factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1,FIH-1)可以通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α下游基因的表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞的增殖[14]。在對(duì)腎癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控中：沉默趨化因子受體7(CXC chemokine re-ceptor 7，CXCR7)后，可抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制腎癌細(xì)胞的凋亡[15]。微小RNA-93靶向大型腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2,LATS2)調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖及凋亡[16]。

通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)了CKLF1在腎癌細(xì)胞ACHN的過(guò)表達(dá)。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CKLF1可明顯促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步檢測(cè)的細(xì)胞周期變化也同樣證實(shí)了這一結(jié)果。轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯升高。CyclinD1在細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮重要的正調(diào)節(jié)作用。CyclinD1與其相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，檢測(cè)了轉(zhuǎn)染48 h后CyclinD1蛋白表達(dá)水平的變化。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，CKLF1明顯促進(jìn)了CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。與凋亡相關(guān)的檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48 h后，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率明顯減低，而凋亡抑制蛋白Bcl-xL 的表達(dá)明顯升高，提示CKLF1過(guò)表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞的凋亡。

JAK-STAT信號(hào)通路由3個(gè)部分組成：接收信號(hào)的酪氨酸激酶相關(guān)受體、傳遞信號(hào)的酪氨酸激酶JAK和產(chǎn)生效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子STAT。STAT3是STAT 家族的成員之一，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，STAT3可被多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子激活，這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子通過(guò)糖蛋白 130 (gp130) 發(fā)出信號(hào)。為響應(yīng)這些信號(hào)，Janus 激活激酶 (JAK) 家族的成員在 Tyr705 處磷酸化 STAT3，使 STAT3 二聚化二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過(guò)程。早期的研究表明， STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。對(duì)乳癌癌組織的研究顯示，P-STAT3表達(dá)明顯上調(diào)，EGFR 通過(guò) STAT3 磷酸化和 JAK/STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[17]。STAT3是人肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞保持活力、存活和遷移所必需。通過(guò)一種非肽類小分子 STAT3 抑制劑 LY5降低 STAT3 下游靶基因表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[18]。此外STAT3激活增加與 RCC 中晚期轉(zhuǎn)移性疾病和較差的存活率相關(guān)。這種增加的活性主要是由于生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)增加形成[19-21]。CyclinD1 、Bcl-xL均是 p-STAT3 靶基因,CKLF1可刺激CyclinD1 、Bcl-xL蛋白表達(dá)， 因此可以推斷，作為細(xì)胞因子之一的CKLF1可能通過(guò)此途徑發(fā)揮其對(duì)增殖、凋亡的調(diào)控作用。Western blot結(jié)果顯示：CKLF1過(guò)表達(dá)48 h后，與對(duì)照組相比較，JAK-STAT 信號(hào)通路的下游蛋白P-STAT3的表達(dá)水平明顯升高，提示，CKLF1可能通過(guò)JAK-STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)了其對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。

趨化素樣因子1過(guò)表達(dá)后，可明顯促進(jìn)腎癌細(xì)胞ACHN的增殖、抑制其凋亡，此效應(yīng)可能通過(guò)激活JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。CKLF1在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能是重要的促癌基因，可作為腎透明細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn)。