賈 栗，范瑞棋，，張婉君，，陳義強(qiáng)，苑曉燕

（1.解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京 100071；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

傳統(tǒng)的化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估測試主要以動(dòng)物模型為研究對象，隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則的不斷深入實(shí)施，以及2007年美國國家科學(xué)院開創(chuàng)性文件《21世紀(jì)的毒性測試：愿景與策略》（Tox21）和2009年《科學(xué)與決策：推進(jìn)風(fēng)險(xiǎn)評估》的發(fā)表，再到2019年美國環(huán)境保護(hù)署（Environmental Protection Agency，EPA）發(fā)布將于2035年停止進(jìn)行或資助針對哺乳動(dòng)物開展的研究均表明，近20年來，毒理學(xué)測試方法已從傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向非動(dòng)物替代方法的開發(fā)和運(yùn)用。新的化合物不斷涌現(xiàn)，替代方法產(chǎn)生了大量體外測試數(shù)據(jù)，迫切需要開發(fā)快速高效的用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估的新技術(shù)方法（new approach methodologies，NAM）[1]。美國EPA 在 2018年定義了NAM的范圍：包括各種非動(dòng)物新技術(shù)、替代策略、理想的預(yù)測模型及大量化學(xué)危害和風(fēng)險(xiǎn)評估產(chǎn)生的相關(guān)數(shù)據(jù)和信息。這些新數(shù)據(jù)復(fù)雜且多樣化，來自高通量測試、毒代動(dòng)力學(xué)測試、分子流行病學(xué)、組學(xué)技術(shù)、暴露科學(xué)、計(jì)算化學(xué)和新動(dòng)物模型等[2]。NAM目前主要應(yīng)用于快速高效地識別化學(xué)品的危害特征并收集劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)，對大量的化學(xué)品進(jìn)行優(yōu)先順序排列，從中篩選出需要深入測試評估的化學(xué)品，大大提高了化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估的效率。NAM的大規(guī)模開展和實(shí)施為化學(xué)品的危害表征和風(fēng)險(xiǎn)評估提供了適合的科學(xué)基礎(chǔ)，為更多與人類相關(guān)的安全評估提供信息。本文就目前國內(nèi)外開發(fā)的NAM及其在化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估方面的應(yīng)用、NAM整合測試策略、存在問題等方面進(jìn)行綜述，為我國化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估NAM的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 適用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估的NAM

為了應(yīng)對不斷涌現(xiàn)的化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估及大量的信息整合處理工作，多種NAM應(yīng)運(yùn)而生。目前國內(nèi)外比較關(guān)注的用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估的NAM主要有計(jì)算方法學(xué)、體外測試策略和體外生物動(dòng)力學(xué)等。

1.1 計(jì)算方法學(xué)

計(jì)算方法學(xué)是近年來毒理學(xué)非?；钴S的研究領(lǐng)域，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。幾乎所有的毒理學(xué)研究和風(fēng)險(xiǎn)評估都使用了計(jì)算機(jī)工具，其中包括龐大的化學(xué)品毒理學(xué)特征數(shù)據(jù)庫、用于模擬生物系統(tǒng)和分子動(dòng)力學(xué)的計(jì)算機(jī)模型以及用于預(yù)測毒性的建模軟件[3]等。

交叉參照（read-across）NAM應(yīng)用最廣泛的是填充化學(xué)品危害特征及風(fēng)險(xiǎn)評估中的數(shù)據(jù)空白。交叉參照是一種數(shù)據(jù)填充技術(shù)，可用一些化學(xué)品的終點(diǎn)信息數(shù)據(jù)來預(yù)測另一種（一類）具有相似特性的化學(xué)品的終點(diǎn)信息，可免除目標(biāo)物質(zhì)的體內(nèi)試驗(yàn)，具有速度快、費(fèi)用低的特點(diǎn)[4]。其作為非測試方法中的重要策略已被歐盟和美、加、日等多國的管理機(jī)構(gòu)所接受，在我國《新化學(xué)物質(zhì)申報(bào)登記指南》中也被認(rèn)可[5]。目前已開發(fā)并使用的交叉參照模型主要有OECD QSAR Toolbox，Toxmatch和ToxRead等。歐盟EU-ToxRisk項(xiàng)目開發(fā)了特定的交叉參照案例評估這種方法的適用性，如通過使用計(jì)算數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)品危害表征，通過基于生理的毒代動(dòng)力學(xué)模型（physiologically based toxicokinetic，PBTK）解決化合物的動(dòng)力學(xué)/生物利用度在人體的差異性等[6]。如用類似物的已知毒性數(shù)據(jù)來預(yù)測2-乙丁酸90 d重復(fù)毒性試驗(yàn)，通過有害結(jié)局路徑（adverse outcome pathway，AOP）框架網(wǎng)絡(luò)確定脂肪肝變性的關(guān)鍵分子事件，并用相應(yīng)的體外測試來支持交叉參照的假設(shè)，通過證據(jù)權(quán)重方法輔助分析不確定性，然后進(jìn)行人體等效劑量的計(jì)算，以推導(dǎo)出風(fēng)險(xiǎn)評估的起點(diǎn)（point of departure，PoD）。另有案例選擇一系列具有體內(nèi)發(fā)育毒性的2-甲己酸類似物來預(yù)測2-甲己酸的生殖發(fā)育毒性，并用斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)、小鼠胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育模型和PBTK模型等進(jìn)行測試，探討類似物是否能準(zhǔn)確預(yù)測各自的體內(nèi)發(fā)育毒性，進(jìn)一步探討結(jié)構(gòu)與發(fā)育的關(guān)系。有研究者使用基于化學(xué)結(jié)構(gòu)分析和近百萬個(gè)化學(xué)性質(zhì)危害數(shù)據(jù)開發(fā)的交叉參照模型對9個(gè)化合物危害終點(diǎn)進(jìn)行分類，準(zhǔn)確度達(dá)到70%～95%[7]。交叉參照已被廣泛用于預(yù)測復(fù)雜毒性和不良反應(yīng)。然而，交叉參照的可靠性值得進(jìn)一步規(guī)范，需要整合多個(gè)NAM測試結(jié)果來驗(yàn)證，因此需要更復(fù)雜的預(yù)測模型或證據(jù)權(quán)重評估程序來整合相關(guān)信息。

1.2 體外測試方法

高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)（high-throughput transcriptomics，HTTr）篩查技術(shù)是較早開展的體外替代方法，在2007年發(fā)布的《21世紀(jì)的毒性測試：愿景與策略》中就明確了開發(fā)和利用人類細(xì)胞體外模型，開發(fā)基于通路的與毒性和計(jì)算機(jī)模型相關(guān)的細(xì)胞檢測方法。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已被生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛運(yùn)用。早期轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)用于研究化學(xué)暴露下基因組水平擾動(dòng)，為化學(xué)品毒性作用模式（modes of action，MOA）及分類提供支持。近年來，劑量依賴HTTr的應(yīng)用為化學(xué)品早期篩選提供了更加全面和高效的方法，可支持計(jì)算生物信號通路發(fā)生擾動(dòng)的PoD。有人提出，基于HTTr數(shù)據(jù)的劑量反應(yīng)模型可被納入風(fēng)險(xiǎn)評估框架，作為化學(xué)品危害評估的一種手段[8]。隨著HTTr的不斷應(yīng)用和發(fā)展，科學(xué)家們在此基礎(chǔ)上開發(fā)出更多新穎的、適用性強(qiáng)的方法進(jìn)行化學(xué)品危害評估。Harrill等[9]以MCF-7細(xì)胞為模型，采用測序讀出模板核苷酸（TempO-Seq）分析方法對44種環(huán)境化合物進(jìn)行HTTr分析，并開發(fā)了一種新的基于基因表達(dá)特征的劑量反應(yīng)建模方法，以確定基因表達(dá)開始出現(xiàn)擾動(dòng)的閾值。TempO-Seq技術(shù)特點(diǎn)在于與細(xì)胞裂解物相容性較好、無需額外RNA純化、僅需皮克量RNA就能生成多重測序文庫，適用于高通量環(huán)境化學(xué)品危害評估。我國學(xué)者新開發(fā)的劑量依賴的人簡化轉(zhuǎn)錄組學(xué)（human reduced transcriptomics，RHT）方法可評估基于通路擾動(dòng)的單一化學(xué)品，并開發(fā)了基于單一化學(xué)品預(yù)測模型的混合物的基準(zhǔn)效應(yīng)評估方法，這種方法可對環(huán)境化學(xué)物/混合物干擾的生物信號擾動(dòng)進(jìn)行定性和定量評估[10]。另有研究者用大型公共毒理基因組數(shù)據(jù)庫（TG-GATEs）已發(fā)表數(shù)據(jù)開發(fā)了一個(gè)基于web的交互式瀏覽器MoAviz，通過可視化方式展示化學(xué)品擾動(dòng)的信號通路，為識別化學(xué)品毒作用模式提供了系統(tǒng)框架[8]。體外轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)會(huì)產(chǎn)生大量復(fù)雜數(shù)據(jù)集，如何收集、評估和解釋轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)具有非常大的挑戰(zhàn)性，如如何實(shí)現(xiàn)可視化和解釋數(shù)據(jù)、如何選擇細(xì)胞和組織，需要測試細(xì)胞或組織的數(shù)量、是否需要增加其他測試以獲得更具生物學(xué)相關(guān)性的代表性數(shù)據(jù)等[8]。針對上述問題，美國EPA以MCF-7細(xì)胞為模型，使用全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)對1000多種化合物進(jìn)行劑量-效應(yīng)評估的案例及Tox21中高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)項(xiàng)目的研究案例，均可提供有價(jià)值的參考[11-12]。隨著基于組學(xué)的NAM的發(fā)展，這些都是需要進(jìn)一步探討的問題。

微生理系統(tǒng)（microphysiological system，MPS）有時(shí)也被稱為器官芯片或人體芯片，是指在芯片上構(gòu)建的器官生理微系統(tǒng)，它以微流控芯片為核心，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)等多種方法，在體外模擬構(gòu)建多種組織器官微環(huán)境。這種微縮的組織器官模型可在體外接近真實(shí)地重現(xiàn)人體器官的生理、病理活動(dòng)，預(yù)測人體對外界刺激的反應(yīng)，成為近年來發(fā)展迅速的前沿科學(xué)。美國于2011年率先啟動(dòng)人體芯片（human-on-chip）計(jì)劃后，歐洲部分國家也紛紛開展了器官芯片的研究項(xiàng)目[5]。MPS模型包括潛在的生物學(xué)和毒理學(xué)AOP中的關(guān)鍵事件，可提供與化學(xué)品安全評估相關(guān)的信息[13]。如“微型大腦”或大腦類器官是原代細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的3D培養(yǎng)物，可定向發(fā)育成神經(jīng)組織，并應(yīng)用于人腦組織的藥物毒性研究[14-15]。目前正在開發(fā)能模擬體內(nèi)肺結(jié)構(gòu)的人源體外組織培養(yǎng)物如體外氣液界面細(xì)胞培養(yǎng)模型，用于評估一些吸入毒理學(xué)終點(diǎn)[16]。但這些方法還在發(fā)展初期，需要進(jìn)一步改進(jìn)和驗(yàn)證[17-18]。此外，腸細(xì)胞類器官和體外腎小管樣結(jié)構(gòu)組織也已建立，這些體外技術(shù)雖還不能完全重現(xiàn)這些器官的復(fù)雜性，但依然可進(jìn)行一些毒性評價(jià)探索，同樣需要進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證[19-20]。MPS模型的開發(fā)已逐漸從單器官模型向相互關(guān)聯(lián)的多器官模型邁進(jìn)[21-22]，“人體芯片”是一種多通道的3D微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，劃定特定的微環(huán)境、3D細(xì)胞聚集培養(yǎng)模擬體內(nèi)多個(gè)器官，從而設(shè)計(jì)一個(gè)全身的仿生裝置[23]。但目前的MPS模型還存在技術(shù)壁壘，包括但不限于無法合理重現(xiàn)器官系統(tǒng)之間的相互作用、未能適當(dāng)模擬藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程、無法評估長期暴露的毒性效應(yīng)和無法基于體外暴露藥物濃度來準(zhǔn)確估計(jì)人體劑量等。基于PBTK研究建模和體外-體內(nèi)外推（in vitro-in vivoextrapolation，IVIVE）方法可嘗試解決這些問題。

1.3 體外生物動(dòng)力學(xué)方法

生物動(dòng)力學(xué)NAM主要包括體外方法（優(yōu)選使用人體組織試驗(yàn)材料或細(xì)胞）、計(jì)算（計(jì)算機(jī)）方法，及兩者的組合。如使用人結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco-2、犬腎細(xì)胞MDCK或豬腎細(xì)胞LLC-PK1研究腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；使用人造皮膚用于皮膚吸收研究；使用人胚胎絨毛癌BeWo細(xì)胞建立代謝模型，開展人體血漿蛋白結(jié)合測定及胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)等[24-25]。器官芯片模型也是最新研究熱點(diǎn)，通過更好的生理相似性及在一個(gè)平臺內(nèi)整合不同器官的方法提高檢測準(zhǔn)確性[26-29]。計(jì)算方法（模型）主要有基于生理學(xué)的動(dòng)力學(xué)（physiologically based kinetic，PBK）和基于生理學(xué)的藥動(dòng)學(xué)（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）模型[30-32]。如使用人體細(xì)胞或組織體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合，使用計(jì)算分配系數(shù)，以參數(shù)化PBPK模型來預(yù)測人體生物動(dòng)力學(xué)[30，33]。生物動(dòng)力學(xué)技術(shù)將在下一代毒性測試中發(fā)揮重要作用，用于生物動(dòng)力學(xué)的NAM將在體外毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

化學(xué)物質(zhì)的毒代動(dòng)力學(xué)（毒動(dòng)學(xué)）參數(shù)在人體和動(dòng)物間差異顯著，需要發(fā)展以人為基礎(chǔ)的體外模型，從而有效預(yù)測化學(xué)物質(zhì)的人體危害。因此PBPK模型應(yīng)運(yùn)而生，其是根據(jù)機(jī)體解剖學(xué)和生理學(xué)知識，按照臟器（如肝和腎）解剖學(xué)結(jié)構(gòu)或組織（如脂肪和肌肉）類型等進(jìn)行分區(qū)的生物動(dòng)力學(xué)模型。主要用于綜合預(yù)測化合物的吸收、分布、代謝和消除過程及體內(nèi)毒性。預(yù)測器官組織中化合物濃度、代謝產(chǎn)物的變化過程和化合物毒性劑量在動(dòng)物種屬中的外推。在制藥領(lǐng)域，PBPK模型在人體用藥初始劑量選擇和藥物相互作用預(yù)測中被廣泛應(yīng)用。

在毒理學(xué)領(lǐng)域，PBPK模型主要作用是將受試化合物的體外數(shù)據(jù)推到人體內(nèi)，也叫做定量IVIVE。有學(xué)者采用體外肝微粒體孵化和Caco-2轉(zhuǎn)運(yùn)研究中獲得的計(jì)算機(jī)衍生參數(shù)和生物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)開發(fā)了基于PBPK模型的NAM，通過反向劑量法預(yù)測草藥生物堿伊波加因堿（ibogaine）及其代謝產(chǎn)物降伊波加因堿（noribogaine）的人類心臟毒性，同時(shí)也驗(yàn)證了這種NAM的適用性[34]。

2 NAM在化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估中的應(yīng)用

近年來，多種NAM已廣泛應(yīng)用于高通量化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估中，并取得了很好的效果。而關(guān)于混合化學(xué)物或復(fù)雜化學(xué)物的風(fēng)險(xiǎn)評估，NAM的應(yīng)用才剛起步，并且逐漸成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

2.1 環(huán)境混合污染物

目前大部分的風(fēng)險(xiǎn)評估主要針對單一化學(xué)品，但事實(shí)上，人類在環(huán)境或職業(yè)中往往同時(shí)暴露于多種化學(xué)物，而它們之間的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致暴露風(fēng)險(xiǎn)復(fù)雜化[35]，因此，混合物的風(fēng)險(xiǎn)評估面臨重大挑戰(zhàn)。濃度加和（concentration addition，CA）和獨(dú)立作用（independent addition，IA）模型預(yù)測是目前常用的混合物風(fēng)險(xiǎn)評估方法[36]，但這種模型預(yù)測具有一定的不適用性和不確定性。而使用NAM測試策略進(jìn)行混合物風(fēng)險(xiǎn)評估可能會(huì)更好的降低混合物暴露對健康影響的不確定性[37]。Hsieh等[38]采用人體多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞5種體外模型，對42種單一環(huán)境污染物及其8種混合物進(jìn)行體外細(xì)胞毒性測試，構(gòu)建濃度-反應(yīng)關(guān)系，再用貝葉斯概率方法進(jìn)一步模擬上述環(huán)境污染物暴露-效應(yīng)模式的可能性；同時(shí)采用CA和IA模型預(yù)測混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，并與實(shí)際檢測的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，由“低毒”或“安全”的單一化合物構(gòu)成的混合物均表現(xiàn)出顯著的生物活性，盡管CA預(yù)測混合物風(fēng)險(xiǎn)比IA更為準(zhǔn)確，但在有些情況下，混合物的生物活性遠(yuǎn)大于其組分加和的生物活性。當(dāng)所有成分的數(shù)據(jù)都可用時(shí)，CA是預(yù)測混合物毒性的首選，但這種預(yù)測的準(zhǔn)確性因不同的細(xì)胞而產(chǎn)生差異，因此在評價(jià)復(fù)雜混合物聯(lián)合毒性時(shí)依然需要結(jié)合實(shí)際測試數(shù)據(jù)。而NAM則可快速提供大量體外測試數(shù)據(jù)，以用于多種混合物的風(fēng)險(xiǎn)評估，降低混合物風(fēng)險(xiǎn)評估的不確定性，為完善環(huán)境污染物風(fēng)險(xiǎn)評估提供了更多的可能性。

2.2 復(fù)雜或未知化學(xué)物

最近更新的美國EPA有效有毒物質(zhì)控制清單（https：//www.epa.gov/tscainventory/how-accesstsca-inventory#download）中大約20%化學(xué)品是未知物質(zhì)、成分可變的物質(zhì)或復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)物，研究此類復(fù)雜物質(zhì)存在重大挑戰(zhàn)。未知或可變的成分、復(fù)雜的反應(yīng)產(chǎn)物通常包含許多不同的單獨(dú)成分，每種成分可能具有不同的物理化學(xué)和毒理學(xué)特性[39]。而在當(dāng)前的化學(xué)品監(jiān)管制度下很少有既定的評估框架[40]。House等[41]測試了141種石油物質(zhì)在15種人類細(xì)胞類型中的作用，以推導(dǎo)出一套綜合的表型，從而根據(jù)物質(zhì)的體外生物活性對其進(jìn)行分組。結(jié)果表明，NAM數(shù)據(jù)可用于對單個(gè)復(fù)雜混合物進(jìn)行排序，這種方式與基于化學(xué)成分預(yù)測體內(nèi)潛在危害的結(jié)果高度一致。進(jìn)一步表明復(fù)雜混合物的生物活性分析是表征復(fù)雜物質(zhì)“足夠相似性”的可行途徑，旨在測試是否及如何使用體外生物活性數(shù)據(jù)為復(fù)雜混合物分組提供信息。

Wetmore等[42]使用BioMAP分析評估了30種有機(jī)種植水果和蔬菜提取物的生物活性，評估了其濃度響應(yīng)。然后將結(jié)果與ToxCast中測試的農(nóng)用化學(xué)品結(jié)果進(jìn)行比較，認(rèn)為這些提取物是安全的。這項(xiàng)研究的結(jié)果部分得到了美國化學(xué)理事會(huì)的長期研究計(jì)劃的支持。結(jié)果表明：①水果和蔬菜中的化合物影響多個(gè)體外毒性終點(diǎn)；②與ToxCast單一化學(xué)物質(zhì)相比，提取物在定性和定量上表現(xiàn)出不同的生物活性特征（可能因提取物是生物活性植物化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜混合物）；③劑量反應(yīng)源于對復(fù)雜物質(zhì)中不同成分的反應(yīng)疊加；④化學(xué)物的生物活性不一定是不良反應(yīng)，強(qiáng)化了體外生物活性并不等同于一對一的不良健康影響。鑒于此類有益健康的物質(zhì)在體外會(huì)產(chǎn)生多種生物活性，因此在使用高通量毒性測試方法評估危害表征時(shí)需要注意[42]。

3 NAM整合測試策略

NAM的種類繁多，發(fā)展迅速，但單一的替代方法有其局限性和適用范圍，不可能建立一對一的替代方法完全替代傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此需要將多種NAM及不同來源的信息整合使用，更精準(zhǔn)地完成風(fēng)險(xiǎn)評估。關(guān)于如何將適用的NAM整合并用于不同目的的風(fēng)險(xiǎn)評估，Andersen等[44]提出了一個(gè)方法路線圖（圖1），描述了在不同風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境中應(yīng)用NAM的級別和場景。級別1為計(jì)算機(jī)篩選。這個(gè)層級的NAM可估計(jì)化學(xué)品物理特征、推斷可能產(chǎn)生的毒性（如QSAR平臺、毒理學(xué)關(guān)注閾值等）、預(yù)測可能的代謝物、并評估在預(yù)期使用條件下的暴露情況。目的是利用已知相似屬性化合物信息對新的化學(xué)品信息進(jìn)行數(shù)據(jù)填充，可快速進(jìn)行大量的化學(xué)品篩選。級別2為高通量體外篩查。若在級別1中確定有毒性但未能確定可信的暴露安全閾值，則需要進(jìn)行級別2的NAM測試。級別2的NAM主要以體外高通量測試為主，主要參考Tox21和EPA的ToxCast中的測試方法。近年來廣泛應(yīng)用的方法有基于細(xì)胞檢測基因表達(dá)的HTTr技術(shù)[43]，評價(jià)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的高內(nèi)涵成像技術(shù)、基準(zhǔn)劑量分析和MOA分析的通路可視化方法，如動(dòng)作可視化軟件MoAviz[44]。理想情況下，2級檢測應(yīng)針對監(jiān)管終點(diǎn)而定制，明確如何適用于已知的MOA或AOP。使用IVIVE將ADME數(shù)據(jù)與生物活性測定數(shù)據(jù)整合轉(zhuǎn)換成半數(shù)抑制濃度、人等效劑量值，并與暴露估計(jì)值進(jìn)行比較，生成暴露模式。級別3為目的性更強(qiáng)的檢測和安全性評價(jià)。是在級別2基礎(chǔ)上更加精細(xì)的暴露評估。預(yù)計(jì)級別3未來會(huì)廣泛應(yīng)用，可能會(huì)使用更復(fù)雜的多維或多細(xì)胞分析的NAM，比如與人體相關(guān)的符合目標(biāo)的測試（human-relevant fit-for-purpose，F(xiàn)FP）。FFP平臺主要開發(fā)細(xì)胞靶向檢測[45]。FFP檢測平臺多種多樣，有復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，如“迷你大腦”[46]，各種組織的衍生細(xì)胞三維培養(yǎng)等檢測平臺等，與高內(nèi)涵技術(shù)集成可同時(shí)評估多個(gè)毒性終點(diǎn)。級別4為更完整的檢測系統(tǒng)。在高劑量下，化學(xué)品在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中動(dòng)力學(xué)呈非線性，且動(dòng)物與人體的差異性等問題，不能簡單地將體外數(shù)據(jù)推導(dǎo)到體內(nèi)，因此該層級應(yīng)設(shè)計(jì)更加復(fù)雜的檢測，包括多細(xì)胞和多維檢驗(yàn)、人類芯片、組織替代物檢測平臺，以檢測代謝物的肝代謝、組織間循環(huán)以及細(xì)胞或亞細(xì)胞組分代謝物生成[47-48]。一系列平臺整合可進(jìn)行更綜合的毒性測試[49]，將暴露信息及各種體外測試數(shù)據(jù)與每個(gè)級別相結(jié)合進(jìn)行整合評估，可實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)決策。

圖1 新技術(shù)方法整合測試策略層次圖[1].QSAR：定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系；HT：高通量；MOE：暴露邊界；IVIVE：體外到體內(nèi)外推；MOA：作用模式；PBPK：基于生理的藥代動(dòng)力學(xué).

4 NAM應(yīng)用中存在的問題及解決方案

NAM已成為全球生物醫(yī)藥大發(fā)展背景下的熱門領(lǐng)域，但多數(shù)情況下，NAM在各國和組織間獨(dú)立發(fā)展，可信度的規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)未能得到規(guī)范。在風(fēng)險(xiǎn)評估中使用NAM的障礙是人們無法普遍認(rèn)可這些新工具和數(shù)據(jù)，解決方案是需要建立評估NAM可信度的方法。針對此問題，美國衛(wèi)生與環(huán)境科學(xué)研究所組織多個(gè)相關(guān)行業(yè)的專家共同提出了一個(gè)框架，提供了一套標(biāo)準(zhǔn)來評估NAM的適用性，同時(shí)提供了一種系統(tǒng)方法來評估當(dāng)前可用的NAM，并確定它們對監(jiān)管的適用性。此框架主要包括3個(gè)步驟：①確定應(yīng)用目的。確定NAM是用于優(yōu)先排序、危害識別還是風(fēng)險(xiǎn)評估。②解決核心原則。包括方法的準(zhǔn)確性（如假陽性和陰性檢測）、透明度（明確的預(yù)測模型和算法等）及了解其局限性和適用范圍。③定義適合用途的標(biāo)準(zhǔn)。包括化學(xué)品適用范圍、方法描述、數(shù)據(jù)集質(zhì)量的驗(yàn)證、同行評審、預(yù)測的終點(diǎn)或途徑、機(jī)制說明、穩(wěn)定性測定、數(shù)據(jù)可訪問性、與體內(nèi)數(shù)據(jù)（動(dòng)物或人類）的生物學(xué)比較、模型的統(tǒng)計(jì)評估、預(yù)測的確定性水平、生物變異性和關(guān)注的亞群等。同時(shí)一些已被驗(yàn)證的應(yīng)用案例可供研究者們參考借鑒[50]。

5 結(jié)語

使用整合的NAM可快速識別化學(xué)品毒性，從而更易關(guān)注到有潛力的化學(xué)品并開展更進(jìn)一步的風(fēng)險(xiǎn)評估。NAM的使用進(jìn)一步突出了共享數(shù)據(jù)和方法以及協(xié)調(diào)化學(xué)品優(yōu)先排序和評估資源的必要性，使得整體化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估更高效、更精準(zhǔn)。

目前，NAM主要應(yīng)用于化學(xué)品的篩選和優(yōu)先排序這類風(fēng)險(xiǎn)評估過程中的早期步驟，未來還將深入應(yīng)用于風(fēng)險(xiǎn)評估的各個(gè)階段。其發(fā)展尚需解決以下問題：①全球化學(xué)品安全立法復(fù)雜且多樣化，而大部分國家當(dāng)前法律僅允許和（或）鼓勵(lì)少量新技術(shù)應(yīng)用，需要重新思考當(dāng)前的立法程序，使之足夠嚴(yán)謹(jǐn)且適用于新技術(shù)規(guī)范。②目前全球數(shù)據(jù)共享不完整，缺乏許多類型的毒理學(xué)數(shù)據(jù)和信息，需要各相關(guān)行業(yè)開展數(shù)據(jù)共享，不斷優(yōu)化技術(shù)和信息學(xué)結(jié)構(gòu)，增加數(shù)據(jù)的可用性，做到符合可查找、可訪問、可互操作和可再利用的原則，應(yīng)鼓勵(lì)建立全球可自由訪問的免費(fèi)的共享數(shù)據(jù)庫。③目前有許多計(jì)算機(jī)模型和其他一些NAM可用于風(fēng)險(xiǎn)評估，但這些NAM均處于開發(fā)、驗(yàn)證或接受的不同階段[51]，需要確定哪些方法適用于化學(xué)品安全評估，如何開發(fā)更有前途的NAM，以及發(fā)展如何讓NAM達(dá)到可接受水平的決策框架。我國的NAM正處于發(fā)展階段，更加需要相關(guān)政策的制定和規(guī)范，也需要更多的研究人員投入到該領(lǐng)域中來，使NAM在風(fēng)險(xiǎn)評估方面的應(yīng)用發(fā)揮更大作用。