陳 華

(寧德市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心， 福建 寧德 352100)

有機磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticide，OPPs)指一類含磷元素的有機酯類化合物，因其具有高效、廣譜、降解快、價格低等優(yōu)勢，廣泛運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的病蟲害防治[1]。OPPs的作用機理主要是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引發(fā)乙酰膽堿過度積累，進(jìn)而干擾害蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)[2]。然而，使用不當(dāng)?shù)腛PPs可通過食物鏈進(jìn)入人體，擾亂人體的認(rèn)知能力及神經(jīng)行為，導(dǎo)致機體出現(xiàn)震顫、出汗、畸形、內(nèi)分泌失調(diào)等中毒癥狀，重者可因呼吸麻痹而死亡[3-4]。雖然我國已明令禁止在果蔬上使用多種有機磷農(nóng)藥，并在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021《食品各農(nóng)藥最大殘留限量》中設(shè)置了最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)以限制農(nóng)藥使用[5]，但在實際檢測中依然能檢出有機磷農(nóng)藥超標(biāo)[6-7]。

當(dāng)前，對蔬菜中農(nóng)藥殘留檢測的方法主要有氣相色譜法(Gas chromatography，GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Gas Chromatography-Mass SpectrometryGC-MS/MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)等[8]。QuEChERS法是近年興起的一種樣品前處理方法，具有快速、簡單、節(jié)約、安全等特點，廣泛用于果蔬中的農(nóng)藥殘留檢測[9]。辛辣蔬菜作為一類特殊蔬菜，深受廣大人群的喜愛，同時占據(jù)著較大的市場份額[10]，但在農(nóng)殘檢測領(lǐng)域，尚未見對辛辣蔬菜有機磷農(nóng)藥檢測進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究。本研究采用QuEChERS前處理技術(shù)，以常見的7種辛辣蔬菜為研究對象，結(jié)合GC-MS/MS法探究在不同辛辣蔬菜中快速篩查有機磷農(nóng)藥殘留情況，以期為辛辣蔬菜的農(nóng)藥檢測提供借鑒經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒，樣品購于生鮮超市及農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)檢測不含試驗所研究農(nóng)藥。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 島津GCMS-TQ8040型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津制作所)；Aglient DB-5 MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)色譜柱(美國Aglient 公司)；VORTEX-5型渦旋振蕩器(海門其林貝爾公司)；Sigma 3-18KS 型高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；PL602E電子天平(瑞士METTLER公司)；Organomation EVAP-111氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2.2試劑 18種有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品(辛硫磷、滅線磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、氯唑磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷、甲拌磷亞砜、馬拉硫磷、甲拌磷砜、毒死蜱、對硫磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、三唑磷、伏殺硫磷)購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，質(zhì)量濃度100 mg·L-1；乙腈、丙酮、正己烷均為色譜純，購于上海安譜公司；氯化鈉、PSA(40～63 μm)、GCB(120～400目)購于上海安譜公司。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10.0 g樣品經(jīng)料理機充分?jǐn)囁楹笱b于50 mL離心管，加入20.0 mL的乙腈、5.0 g NaCl、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，充分震蕩混勻后超聲提取15 min，5 000 r·min-1離心3 min。離心后吸取8.0 mL上清液加入N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)100 mg、石墨化碳黑(Graphitized carbon black，GCB)10 mg、MgSO4 700 mg。渦旋振蕩1 min后5 000 r·min-1離心3 min，吸取1.0 mL上清液于10.0 mL試管，40℃氮吹至近干，加入1.0 mL丙酮與正己烷(1+1，V∶V)混合液復(fù)溶，過0. 22 μm濾膜后待 GC-MS/MS 測定。

1.3.2配制農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別取 0.4 mL的100 mg·L-1的有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液于 10 mL 容量瓶中，得到4 mg·L-1的中間儲備液。分別使用7種蔬菜的空白基質(zhì)液配制為50、100、200、500、1 000、2 000 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式，依據(jù)峰面積y對質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)，以信噪比≥10 計算定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

1.3.3色譜條件 進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氦氣；程序升溫條件：初溫50℃，保持1 min，以25℃·min-1升溫至125℃，再以10℃·min-1升溫至280℃。

1.3.4質(zhì)譜條件優(yōu)化 離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；溶劑延遲時間：3.0 min。采用全掃描方式尋找目標(biāo)化合物中具有最強檢測訊號的離子碎片，采集具有最佳豐度的2～3個離子碎片，再進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描以確定最佳子離子。進(jìn)一步使用島津GC-MS/MS library軟件自動優(yōu)化各化合物的碰撞能(collision energy，CE)，得到多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式下各農(nóng)藥化合物的目標(biāo)離子、參考離子及最佳作用電壓。

1.3.5提取劑的選擇 根據(jù)待測農(nóng)藥特性和提取溶劑化學(xué)性質(zhì)考慮，以確定選用提取溶劑的原則。本研究涉及的樣品為辛辣蔬菜，其多含有較多水分，且有機磷殺菌劑多易溶于丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑，故分別使用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑。

1.3.6凈化劑的選擇 使用PSA、GCB作為主要凈化劑，設(shè)置2因素3水平試驗，每組進(jìn)行3次平行試驗，統(tǒng)計各試驗組農(nóng)藥項目的平均回收率。

1.3.7基質(zhì)效應(yīng)評價 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)評價方式采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值來定量評價。通過以下公式計算ME：

式中：Sm和Ss分別為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME<0時表示基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME>0時，表示基質(zhì)增強效應(yīng)。當(dāng)|ME|≤20 %為弱基質(zhì)效應(yīng)，20 %<|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，|ME|>50%為強基質(zhì)效應(yīng)[11-12]。本研究采用0. 10 mg·L-1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和同等濃度的丙酮與正己烷(1+1，V∶V)混合液的峰面積進(jìn)行比較，從而確定樣品基質(zhì)效應(yīng)的強弱。

1.3.8回收率和重復(fù)性測定 在陰性香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒樣品中，在 0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-13個添加水平進(jìn)行加標(biāo)試驗，單水平設(shè)置6次重復(fù)并計算回收率和重復(fù)性。

1.3.9實際樣品檢測 在市售蔬菜中抽取21批次樣品，涵蓋香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒7種樣品，依據(jù)“1.3.1”方法處理后上機檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

由圖1可知，采用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行樣品提取時，18種有機磷農(nóng)藥的平均回收率分別為87.14%、67.76%、90.77%、86.48%，以乙腈作為提取劑時18種農(nóng)藥回收率最高，故采用乙腈作為農(nóng)藥提取溶劑。

圖1 不同溶劑條件下18種有機磷農(nóng)藥的回收率(n=3)Fig.1 Recoveries of 18 kinds of organophosphorus pesticides under different solvent conditions (n=3)

2.2 凈化方法的優(yōu)化

QuEChERS試驗中常用的分散劑有PSA、GCB和C18等，其中PSA 可用于去除碳水化合物、脂肪酸、酚類和少量色素，GCB主要用于去除色素、甾醇類和非極性干擾物，而C18 主要用于去除脂肪和酯類等非極性物質(zhì)。鑒于目標(biāo)樣品中油脂含量較低，故本研究主要選用PSA、GCB對溶劑進(jìn)行凈化。由表1可知，各試驗組合回收率范圍介于83.40～93.42%，4號試驗組具有最高的回收率，據(jù)此可以確定PSA的最佳用量為100 mg，GCB的最佳用量為10 mg。

表1 分散劑中各組分含量Table 1 Content of each component in the dispersant

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

經(jīng)優(yōu)化后得到MRM模式下各農(nóng)藥化合物的目標(biāo)離子、參考離子及最佳作用電壓，各農(nóng)藥化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。配制濃度為100 μg·L-1的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣分析，獲得農(nóng)藥混標(biāo)的總離子流(total ion current，TIC)圖譜，可知多種有機磷農(nóng)藥經(jīng)色譜柱得到初步分離，并達(dá)到較好的分離效果，見圖2。

注：A為辛硫磷；B為滅線磷；C為甲拌磷；D為特丁硫磷；E為二嗪磷；F為氯唑磷；G為甲基對硫磷；H為殺螟硫磷；I為馬拉硫磷；J為甲拌磷砜；K為毒死蜱；L為甲拌磷亞砜；M為對硫磷；N為水胺硫磷；O為甲基異柳磷；P為丙溴磷；Q為三唑磷；R為伏殺硫磷圖2 GC-MS/MS中18種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液TIC譜圖Fig.2 TIC chromatogram of the standard solutions of 18 kinds of organophosphorus pesticides by GC-MS/MS

表2 18種有機磷農(nóng)藥質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectrometry information of 18 kinds of organophosphorus pesticides

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

通過與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)品比較，發(fā)現(xiàn)相同濃度的基質(zhì)液的農(nóng)藥出峰面積大于在溶劑中的出峰面積， |ME|值介于5.23～228.49%，主要表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。為保證定量結(jié)果準(zhǔn)確，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來準(zhǔn)確定量。

2.5 方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

經(jīng)考察其線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于 0.99，表明在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)7種農(nóng)藥的線性關(guān)系均良好，能較好地克服樣品提取、凈化及上機測定過程造成的誤差。以辣椒為代表基質(zhì)，使用辣椒空白樣品作為基質(zhì)添加濃度為100 μg·L-1的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品后按“1.3.1”方法進(jìn)行試驗操作，以信噪比≥10計算LOQ，經(jīng)過計算該法的LOQ介于0.004～0.009 mg·kg-1，低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113-2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法》[13]LOQ的限值，能滿足日常檢測的需求。

2.6 方法的回收率和重復(fù)性

由表3可知，在添加水平為0.05 mg·kg-1時，各供試樣品對不同農(nóng)藥項目的回收率介于60%～120%，在添加水平為0.10、0.50 mg·kg-1時，各供試樣品對不同農(nóng)藥的回收率介于80%～110%，檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)均小于5，表明本研究建立方法得到的數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

表3 18種農(nóng)藥在7種辛辣蔬菜中的回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 18 kinds of pesticide residues at 7 kinds of pungent vegetables (n=6)

續(xù)表3

2.7 實際樣品檢測

對抽檢的21批次樣品進(jìn)行檢測，在1份生姜檢出毒死蜱，濃度為0.018 mg·kg-1，其檢出值皆在其線性濃度范圍之內(nèi)，根據(jù)GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》國家標(biāo)準(zhǔn)，含量低于MRL。

3 討論和結(jié)論

乙酸乙酯、甲醇、丙酮和乙腈均為農(nóng)殘分析常用的提取溶劑，乙酸乙酯易于提取蠟質(zhì)、脂肪等非極性提取物，但其不溶于水，對水中溶解度稍大的目標(biāo)物回收率較低；甲醇的極性最強，但對部分農(nóng)藥的提取率卻不如乙腈；丙酮易于提取樣品中的色素，但因其與水互溶較難分離[14]，乙腈作為主流提取溶劑具有最佳的提取效果。凈化劑中的PSA 用于吸附極性有機酸、脂類和糖類，GCB用于吸附甾醇和色素類雜質(zhì)，但過量的GCB會吸附平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，造成部分農(nóng)藥回收率降低[15]。本研究確定PSA的最佳用量為100 mg，GCB的最佳用量為10 mg，回收率最高達(dá)到93.42%，表現(xiàn)出較好的回收效果。18種有機磷農(nóng)藥在0.05～2.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好(r2>0.99)；在0.05、0.10 和 0.50 mg· kg-1水平的平均回收率介于61.25%～119.68%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)均小于5.0%，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。

本研究建立了運用GC-MS/MS 前處理技術(shù)，結(jié)合GC-MS/MS對常見18種有機磷農(nóng)藥進(jìn)行分析檢測，通過改善提取溶劑、質(zhì)譜參數(shù)、不同分散劑比例，取得較好的檢測效果。該方法具有簡便高效、經(jīng)濟節(jié)約、結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適合有機磷農(nóng)藥在香蔥、大蒜、洋蔥、生姜、韭菜、青椒和紅椒等樣品中的定量檢測與分析。