林港華，李 歡，韓玉瑩，薛 婷，李龍玉，代容春，林榮華，陳建楠，陳由強，余雪兵

(1.福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350117;2.福建師范大學南方海洋研究院， 福建 福州 350117)

海洋微藻能夠生物合成多種高價值代謝產(chǎn)物，如生理活性物質(zhì)巖藻黃素、多不飽和脂肪酸等，在生物能源、藥品、化妝品或營養(yǎng)領域中備受歡迎。球等鞭金藻Isochrysisgalbana是一種單細胞微藻[1]，它在生長過程中能夠生產(chǎn)巖藻黃素及二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸，因此被應用于營養(yǎng)保健領域、燃料及水產(chǎn)養(yǎng)殖領域，成為生物能源。巖藻黃素是最豐富但幾乎未開發(fā)的類胡蘿卜素資源，能夠參與植物細胞葉綠體光合作用并具有廣泛的生物活性和健康益處(如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖和抗糖尿病等多種生理活性)[2]。DHA是一種長鏈多不飽和脂肪酸，對于新生嬰兒大腦和視網(wǎng)膜發(fā)育中有著不可或缺的作用，另外DHA還具有抗血栓形成、降血壓、抗動脈粥樣硬化和抗纖維化作用[3]。

近年來較多學者使用基因工程和分子生物學的方法提高微藻產(chǎn)量以富集其高價值產(chǎn)物的含量[5]，同時還研究了控制其培養(yǎng)條件(例如光的可用性)來提高其生理活性物質(zhì)[6]。光質(zhì)作為影響微藻生長代謝的最重要光環(huán)境因素之一，藻種的差異對不同光質(zhì)的響應有較大的差異[7]。BOROWAIK等[8]通過調(diào)節(jié)紅光、藍光及白光的比例控制雨生紅球藻的生長及實現(xiàn)蝦青素的高效生產(chǎn)；DUARTE等[9]發(fā)現(xiàn)藍光可以促進小球藻的細胞生長及類胡蘿卜素的積累；KIM等[10]也證明了藍光是促進微藻細胞生長的有效刺激因子，油脂積累也可通過藍光刺激來提高；DHA含量的提高可通過藍光與白光同時照射實現(xiàn)[11-13]。然而，LATSOS等[14]研究發(fā)現(xiàn)與藍光相比，隱藻在綠光培養(yǎng)下更有利于生長；MOHSENPOUR等[15]表明紅光不利于藍藻生長，綠光促進其生長。大多數(shù)學者的研究集中于紅光及藍光，綠光及單色光質(zhì)對球等鞭金藻生長及代謝調(diào)控卻鮮有報道。

因此，本研究以球等鞭金藻為研究對象，探究不同光質(zhì)對球等鞭金藻生長、巖藻黃素及脂肪酸含量的影響，以期為球等鞭金藻的最適生長條件、巖藻黃素及DHA積累提供最佳試驗條件依據(jù)，同時研究結(jié)果為光質(zhì)影響球等鞭金藻的巖藻黃素及脂肪酸代謝途徑提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻種來源：球等鞭金藻來源于本實驗室保種。本研究中所使用的巖藻黃素、C8-C22及DHA脂肪酸標準品購買于SIGMA-ALDRICH公司，甲醇、正己烷等均為色譜純(購自麥克林公司)，甲苯、氯仿等均為分析純(購自國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 藻種培養(yǎng)

球等鞭金藻于白光下培養(yǎng)至對數(shù)期，以1∶10的接種比例接種至新配制的液體f/2培養(yǎng)基。試驗組為紅光、綠光、藍光培養(yǎng)組，培養(yǎng)期間分別置于紅光、綠光、藍光光質(zhì)培養(yǎng)箱內(nèi)，光暗比12 h∶12 h，光照強度63 μmol·m-2·s-1，溫度(20±1)℃。每天搖瓶2次。白光培養(yǎng)組作為對照組,放置于白光培養(yǎng)箱內(nèi)。其他培養(yǎng)條件同上，每3 d進行1次取樣。

1.3 細胞數(shù)測定

取1 mL對照組和試驗組的藻液，利用細胞計數(shù)儀進行藻細胞數(shù)的測定。

1.4 干細胞重量測定

微藻生物量的提取方法根據(jù)BESSON等[35]提出的方法改進。稱取10 mL離心管備用。取180 mL藻液離心，用蒸餾水洗滌2次將藻泥轉(zhuǎn)移至備用的10 mL離心管中，放入-80℃冰箱中冷凍，放入真空冷凍干燥機中48 h，使藻泥充分干燥，測定其干細胞重量。

1.5 巖藻黃素含量測定

本試驗以甲醇作為提取巖藻黃素的溶劑。將1 mL甲醇、1顆鋼珠(直徑為3 mm)加入已冷凍干燥的藻細胞中，放入研磨儀，設定研磨頻率55 Hz，研磨時間180 s。研磨完成后，于黑暗條件下靜置，15～20 min上下顛倒1次，共顛倒3次，保證巖藻黃素充分浸出。靜置結(jié)束后8 000 r·min-1，離心10 min，取上清液過膜后注入液相進樣瓶，用于高效液相色譜儀(HPLC)檢測[16]。

1.6 脂肪酸含量測定

配置氯仿∶甲醇(V∶V=2∶1)溶液，向已冷凍干燥的藻細胞加入2 mL氯仿：甲醇溶液，置于研磨儀中，55 Hz研磨180 s。研磨完成后，8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，立即用氮吹儀吹干。將樣品進行甲酯化處理：加入1 mL甲苯進行溶解，隨即加入200 μL的1 mg·mL-1BHT防止油脂氧化，加入2 mL乙酰氯：甲醇溶液(V∶V=1∶10)，50℃水浴過夜，加入1 mL正己烷溶液(含有1 mg·mL-1十九酸甲酯)，震動混勻后靜置分層，取上層溶液過膜，注入進樣瓶，進行氣相色譜儀(GC)檢測[17]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS 26進行單因素方差分析，Excel繪圖。所有試驗均重復進行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對球等鞭金藻細胞數(shù)的影響

由圖1可知，第3 d時藍光培養(yǎng)組球等鞭金藻的細胞數(shù)與白光培養(yǎng)組(CK)相差不顯著，第6 d后藍光培養(yǎng)組的細胞數(shù)均顯著性高于白光培養(yǎng)組(CK)，最大值為4.07×106個·mL-1，而紅光培養(yǎng)組的細胞數(shù)與白光培養(yǎng)組(CK)相差不顯著。綠光培養(yǎng)組的球等鞭金藻細胞數(shù)于第15 d 達到最大值2.54×106個·mL-1，顯著低于白光培養(yǎng)組(CK)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下圖同圖1 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的細胞數(shù)Fig.1 Cell number of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.2 不同光質(zhì)對球等鞭金藻干細胞重量的影響

由圖2可知，白光、藍光、綠光和紅光培養(yǎng)組的球等鞭金藻最大干細胞重量分別為0.15、0.13、0.10和0.14 g·L-1。其中，在綠光、紅光培養(yǎng)組第9 d的干細胞重量顯著低于白光培養(yǎng)組(CK)。

圖2 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的干細胞重量Fig.2 Stem cell weight of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.3 不同光質(zhì)對球等鞭金藻巖藻黃素含量的影響

由圖3可知，球等鞭金藻中巖藻黃素的含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。在4種光質(zhì)培養(yǎng)下，最高巖藻黃素的含量表現(xiàn)為：藍光>白光>綠光>紅光。藍光培養(yǎng)組中最高巖藻黃素的含量為白光培養(yǎng)組(CK)的1.23倍(4.51 mg·L-1)，綠光、紅光培養(yǎng)組低于白光培養(yǎng)組(CK)，最高巖藻黃素含量分別為：3.17、2.68 mg·L-1。

圖3 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的巖藻黃素含量Fig.3 Fucoxanthin content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.4 不同光質(zhì)對球等鞭金藻脂肪酸含量的影響

由圖4可知，白光培養(yǎng)組的球等鞭金藻脂肪酸含量隨著時間而增加，藍光培養(yǎng)組的脂肪酸含量在第12 d達到最高，綠光、紅光培養(yǎng)組的脂肪酸含量在第3、6、9和12 d顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)，并于第12 d達到頂峰，最大值分別為16.31、17.05 mg·L-1。

圖4 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的脂肪酸含量Fig.4 Fatty acid content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

2.5 不同光質(zhì)對球等鞭金藻脂肪酸組分及含量的影響

由圖5可知，球等鞭金藻在白光培養(yǎng)組(CK)下檢測到8種脂肪酸組分，分別為肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)和DHA，其中C18∶0含量隨著時間延長而降低。而C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3和DHA的含量隨著時間的延長而增加。在綠光、紅光培養(yǎng)組中，同樣也鑒定出了8種脂肪酸，其脂肪酸的成分含量變化規(guī)律與白光培養(yǎng)組(CK)相似。

圖5 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的各脂肪酸百分含量Fig.5 Percentage content of each fatty acid in Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

與其他3種光質(zhì)處理不同的是：藍光培養(yǎng)組中的球等鞭金藻鑒定出了9種脂肪酸成分，分別為C14∶0、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C22：1和DHA，其中C18∶2、C18∶3、C22∶1和DHA含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，C16∶0與C18∶0含量隨著時間延長而降低。藍光培養(yǎng)組中獲得最高含量的DHA和C18∶3，這表明在藍光培養(yǎng)下，球等鞭金藻中的油脂向不飽和脂肪酸及長鏈脂肪酸方向合成。

2.6 不同光質(zhì)對球等鞭金藻DHA含量的影響

由圖6可知，白光、藍光和紅光培養(yǎng)組的DHA含量變化都呈現(xiàn)出一種趨勢，即隨著培養(yǎng)時間的延長而升高，均在第15 d含量達到最大。白光、藍光、綠光和紅光培養(yǎng)組的最高DHA含量分別為0.53、0.58、0.42和0.50 mg·L-1。綠光培養(yǎng)組中第3、6 d的DHA含量顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)；紅光培養(yǎng)組第3、6和9d的DHA含量顯著高于白光培養(yǎng)組(CK)；藍光培養(yǎng)組的DHA含量始終高于白光培養(yǎng)組(CK)。

圖6 球等鞭金藻在不同光質(zhì)培養(yǎng)下的DHA含量Fig.6 DHA content of Isochrysis galbana cultivated in different light qualities

3 結(jié)論與討論

微藻中擁有不同的光感受器，它們對特定的光質(zhì)產(chǎn)生反應，導致不同的光合作用和光誘導行為[18]。本試驗探究了4種不同的光質(zhì)(白光、藍光、綠光和紅光)對球等鞭金藻巖藻黃素和脂肪酸含量的影響。球等鞭金藻在藍光培養(yǎng)組的細胞數(shù)始終高于白光培養(yǎng)組(CK)，紅光培養(yǎng)組次之。球等鞭金藻最大干細胞重量表現(xiàn)為白光>紅光>藍光>綠光。SIRISUK等[19]表明藍光培養(yǎng)下微藻細胞數(shù)上升；MIKI等[20]同樣證明了藍光對Sargassumpatens等大型藻類有顯著促進生長的作用；KUWANO等[22]以單色光培養(yǎng)Ulvacompressa，發(fā)現(xiàn)僅在紅光或綠光照射下的藻細胞生長速率顯著下降。王祎哲等[23]報道藍光培養(yǎng)下的纖細裸藻的細胞數(shù)最高，綠光最低。孫建瑞等[24]觀察到Chlamydomonassp.在藍光下的生物量積累達到最大，而紅光下最低；尹繼龍等[21]發(fā)現(xiàn)小球藻在藍光培養(yǎng)下利于其生物量的積累。這可能是由于藍光具有更高的光合電子傳輸率，從而提高藻細胞的光合性能，進而提高藻細胞內(nèi)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量，為球等鞭金藻的生長提供更多的碳源。

不同光質(zhì)對高價值化合物的生產(chǎn)率有著重大影響。在本試驗中，4種光質(zhì)培養(yǎng)下球等鞭金藻的巖藻黃素最大含量均在第15 d達到最大值，其中藍光>白光>綠光>紅光。藍光培養(yǎng)組的巖藻黃素最高含量可達白光培養(yǎng)組(CK)的1.23倍。紅光培養(yǎng)組的脂肪酸含量最高，綠光培養(yǎng)組次之。DHA含量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，其中藍光培養(yǎng)組的DHA含量最高。研究人員[25-27]表明，在海洋環(huán)境中，短波光是底棲生物可獲得的主要光質(zhì)，并且目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微藻具有能夠接受藍光的光感受器。藍光感受器不僅可以增強微藻細胞對藍光的吸收能力，而且還能夠參與生物生命節(jié)律調(diào)節(jié)及捕光色素合成等重要生物過程，對微藻生長及相關代謝活動產(chǎn)生重要影響[28-30]。LOREDO等[31]研究表明藍光利于三角褐指藻中巖藻黃素的積累，并且在其他微藻中也觀察到了這樣的現(xiàn)象[32]；PARKES等[33]發(fā)現(xiàn)Stauroneissp在藍光培養(yǎng)組中的巖藻黃素含量最高，紅光培養(yǎng)組最低，與本實驗結(jié)果相符；SUN等[34]探究光質(zhì)對Crypthecodiniumsp脂肪酸和DHA含量的影響，結(jié)果表明白光和綠光可提高其脂肪酸含量，紅光能夠誘導脂肪酸積累，而藍光對脂肪酸的積累無明顯影響；SAAVEDRA等[36]發(fā)現(xiàn)藍光培養(yǎng)組中Tisochrysislutea的DHA含量上升。本試驗中藍光培養(yǎng)組的DHA含量始終高于白光培養(yǎng)組(CK)。目前，球等鞭金藻如何接受特定光質(zhì)的信號，并且通過何種途徑影響藻細胞內(nèi)巖藻黃素及脂肪酸的合成有待進一步揭示。

綜上所述，藍光培養(yǎng)組的細胞數(shù)、巖藻黃素和DHA含量始終高于其他3種光質(zhì)，紅光促進藻細胞脂肪酸的積累，白光培養(yǎng)組獲得藻細胞的干細胞重量最大。這些結(jié)果可為我們深入探究光質(zhì)對球等鞭金藻光合作用，巖藻黃素和脂肪酸積累等差異性的機理提供科學參考。