熊曉，余理，馮園，賀豐，周銀飛

國內(nèi)2016年首次發(fā)表“流式細胞術分析外周血淋巴細胞亞群在兒科的臨床應用專家共識”，經(jīng)2019年第二次修正，經(jīng)過數(shù)年的普及推廣，已經(jīng)成為兒科臨床工作中常見的免疫評估工具[1]。常規(guī)的淋巴細胞亞群分析包括：T細胞(CD3+)、B細胞(CD3-CD19+)和NK細胞(CD3-CD16+CD56+)；T細胞又分為輔助性T細胞(CD3+CD4+)和殺傷性T細胞(CD3+CD8+)；以及各個亞群細胞的相對計數(shù)(百分比)和絕對計數(shù)，將兩者結合起來對患兒的免疫功能進行判別。一方面可以了解患兒發(fā)生疾病時免疫功能變化，提高免疫缺陷病的檢出率；另外掌握病程中患兒免疫功能變化，可以輔助指導免疫調(diào)節(jié)劑使用；而對感染后的免疫系統(tǒng)進行評估，可以了解病情的進展，判定感染者的治療效果，合理調(diào)整藥物使用。不同于成人，兒童外周血淋巴細胞絕對計數(shù)和相對百分比變化程度較大，受年齡、環(huán)境、發(fā)育和疾病等因素的影響，因此對兒童進行免疫功能的檢測十分重要。一項針對中國健康兒童淋巴細胞亞群正常參考值研究指出，CD4和CD8T細胞亞群的百分比和數(shù)量有明顯的年齡特異性變化[2]。隨年齡增長，幼稚CD4T細胞的比例逐漸減少，而記憶CD4T細胞的比例增加；幼稚B細胞在1至6個月的嬰兒中最高，在4至8歲的兒童中最低，在8-18歲的兒童中達到了一個平臺期；出生后第一年記憶B細胞稀少，這是對T細胞獨立抗原的抗體反應短暫不成熟所致，是兒童這一時期的特征性表現(xiàn)；而中國不同地理群體間的淋巴細胞主要亞群分布無統(tǒng)計學差異[2]。

1 淋巴細胞亞群在兒童感染性疾病中的應用

1.1 呼吸道感染性疾病

機體免疫系統(tǒng)是一個監(jiān)視、防護和穩(wěn)定體系，正常情況下可通過各種免疫應答反應來有效防御病原體的侵襲。不同的免疫應答途徑會使淋巴細胞亞群水平出現(xiàn)不同變化。相較于成人，兒童對感染的免疫反應通常更為活躍。有研究發(fā)現(xiàn)無論細菌感染還是病毒感染患兒，均表現(xiàn)出外周血CD3+T、CD8+T細胞減少，CD4+/CD8+升高的現(xiàn)象[3]。相比鏈球菌、流感嗜血桿菌感染，金黃色葡萄球菌感染更容易引起 CD8+T細胞減少，CD4+/CD8+比例升高，且NK比例明顯升高；與人副流感病毒感染患兒相比，呼吸道合胞病毒、腺病毒感染患兒CD8+T細胞減少更明顯。提示呼吸道感染患兒中出現(xiàn)免疫功能失調(diào)現(xiàn)象，機體對抗原的殺傷力明顯降低，無法很好地清除細菌、病毒。在免疫能力強的兒童，即使是在單純上呼吸道感染的情況下，腺病毒也能激活強大的全身炎癥反應，在感染的急性期，即使是輕癥患兒，淋巴細胞亞群也表現(xiàn)為B淋巴細胞百分比和絕對數(shù)的增加，從而引起血清炎癥因子的升高。淋巴細胞亞群的構成和血清學的改變，是腺病毒感染后引起抗生素濫用的主要原因[4]。指南建議接受化療的兒童每年接種流感疫苗，而CD4+T在正常年齡范圍的患者在接種后抗體滴度升高，且對H1N1和H3N2毒株的反應更好。在高度免疫抑制患者中，NKT樣細胞計數(shù)和流感毒株的特異性抗體反應之間存在關聯(lián)。大于1000/ul的絕對淋巴細胞計數(shù)對疫苗注射后抗體滴度的增加更有益處[5]。有研究發(fā)現(xiàn)難治性肺炎支原體肺炎(RMPP)淋巴細胞亞群異常率明顯高于普通型肺炎支原體肺炎(GMPP)。RMPP組患兒發(fā)生 CD3+T細胞及NK細胞的絕對計數(shù)和百分比減少的患兒比例顯著高于GMPP組，主要以 CD4+T細胞百分比減少為主，而兩組 CD8+T細胞變化差異無統(tǒng)計學意義。因此推測CD4+T和NK 細胞可能與MP疾病的嚴重程度相關，是參與RMPP致病的免疫機制之一[6]。活動性結核病患兒CD3+T、CD4+T細胞的百分比與絕對計數(shù)及CD8+T細胞絕對計數(shù)均低于健康對照兒童，且重型活動性結核病患兒更低于非重型患兒[7]。肺外結核病組患兒外周血 CD4+T細胞水平顯著低于肺內(nèi)結核病組，CD3+T細胞及CD4+/CD8+T細胞比值也有所下降，說明肺外結核病組患兒中存在更為強烈的免疫抑制現(xiàn)象[8]。Li等[9]在對感染2019-nCoV的患兒進行淋巴細胞亞群分析發(fā)現(xiàn)，RSV感染患兒的CD8+T細胞計數(shù)明顯低于健康對照組；與RSV肺炎患兒相比，2019-nCoV肺炎患兒CD3+CD8+T細胞計數(shù)及百分比更高；而2019-nCoV重癥肺炎患兒CD3+CD8+淋巴細胞計數(shù)及百分比均降低。推測重癥患者出現(xiàn)T細胞功能的耗竭，而有效的CD8+T細胞激活是2019-nCoV肺炎患兒肺炎癥狀大多為輕至中度的原因之一。Carsetti 等[10]在研究兒童抵抗新型冠狀病毒的免疫機制時發(fā)現(xiàn)兒童比成人體內(nèi)存在更為豐富的記憶B細胞，可結合不同未知微生物后產(chǎn)生大量天然抗體并分泌抗炎細胞因子，從而對新抗原迅速發(fā)生反應，減少肺組織的損傷。而隨著年齡增長等原因，這種固有免疫的能力逐漸降低，這或許能為解釋兒童2019-nCoV肺炎癥狀較成人輕提供新的依據(jù)。

1.2 膿毒癥

膿毒癥主要是宿主對感染的反應失調(diào)導致的危及生命的器官功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)感染后機體出現(xiàn)免疫功能抑制與膿毒癥患者發(fā)生院內(nèi)感染和死亡風險增加相關[11]。與健康兒童相比，膿毒癥患兒外周血中CD4+T細胞的數(shù)量下降，CD8+T細胞顯著增多，尤其是CD3+CD8+HLA-DR+細胞水平顯著升高[12]。住院時間更長的患兒變化更明顯。因此推測CD4+T 細胞的活化和增殖減低，以及CD8+T細胞的過度活化和增殖在膿毒癥的發(fā)病機制中起重要作用。CD3+CD8+HLA-DR+/CD3+CD4+CD25+比例升高與膿毒癥的病程延長有關。CD4+/CD8+降低提示免疫功能下降，膿毒癥院內(nèi)感染組CD4+/CD8+比例明顯低于無院內(nèi)感染組[13]。感染患者術前CD4+/CD8+越低，術后并發(fā)膿毒癥的概率越高[14]。血液病合并膿毒血癥患兒外周血 CD3+T淋巴細胞及CD3+CD4+T淋巴細胞數(shù)量較對照組明顯下降，CD3+CD8+T細胞數(shù)量明顯增多[15]。在膿毒癥患者，外周血白細胞數(shù)量在膿毒癥過程中有明顯的波動。早期白細胞或淋巴細胞減少的調(diào)節(jié)失敗與患者死亡率增加相關，雖然在膿毒癥發(fā)病后的頭2～4天內(nèi)可以觀察到中性粒細胞和單核細胞數(shù)量顯著增加，但淋巴細胞減少狀態(tài)很快就會隨著細胞因子風暴的消除而消失[16]。膿毒癥患者因細胞凋亡導致CD4+T細胞和NK細胞數(shù)量明顯減少，幸存者的淋巴細胞數(shù)量在一個月內(nèi)恢復正常，但免疫細胞的功能會在一段較長的時間內(nèi)降低，由于長期的功能損傷，先前膿毒癥患者對繼發(fā)性感染和病毒再活化的易感性增加，導致預期壽命縮短[17-18]。

1.3 傳染性單核細胞增多癥

傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)IM和慢性活動性EB病毒(Chronic active EBV，CAEBV)感染同樣存在復雜的免疫功能紊亂。與健康兒童相比，IM患兒的CD3+、CD4+、CD8+水平升高，而NK細胞和B細胞水平較低，在CAEBV組CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞和B細胞水平均降低，且NK細胞和B細胞低于IM組[19]。研究表明，EBV可以引起NK細胞喪失清除病毒的能力，促進T細胞的增殖，并形成強大的細胞免疫反應，從而識別和促進感染的B淋巴細胞凋亡[20-21]。此外，這一過程也可以抑制B淋巴細胞的增殖和分化[22]。因此，在EBV感染的急性期，患者可能會表現(xiàn)出T淋巴細胞明顯的增加，有助于EBV病毒的清除，如果沒有及時有效的治療，T淋巴細胞和B淋巴細胞之間的相互作用可以增強，并且B細胞活化進一步受到限制，使EBV難以清除，導致持久EBV感染[19]。在另一項研究中證實了IM患者外周血總T細胞、CD8+T細胞和DPT(CD4+CD8+T)細胞顯著增加，B細胞數(shù)量相對計數(shù)和絕對計數(shù)均減少[23]。有研究發(fā)現(xiàn)在IM患兒，外周血CD8+T細胞和DPT細胞的絕對數(shù)量與LDH濃度顯著正相關，而CD4+T、B、NK細胞百分比與LDH濃度呈負相關。與其他類型的急性肝炎相比，EBV相關性肝炎的LDH水平較高[24]，因此推測外周血CD8+T細胞在評估EBV相關的IM患者嚴重程度方面可能具有重要作用。短期抗病毒治療后只有DPT細胞百分比和NK細胞絕對數(shù)量趨于正常，推測這兩個值能更準確的作為輔助評價指標及時反映治療情況[23]。

感染性疾病的淋巴細胞亞群變化見表1。

表1 感染性疾病與淋巴細胞亞群變化Table 1 Lymphocyte subsets alterations in infectious diseases

2 淋巴細胞亞群在兒童免疫紊亂相關疾病中的應用

2.1 川崎病

川崎病(Kawasaki disease，KD)的病因及發(fā)病機制目前并不明確，但越來越多的證據(jù)表明KD的發(fā)病機制是先天性和適應性免疫反應異常和失衡所致。然而，KD患者外周血中適應性免疫細胞的變化和功能仍存在爭議。與正常對照組和恢復期KD患者相比，急性KD外周血標本中中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞等固有免疫細胞顯著增加，而B、T細胞等適應性免疫細胞則顯著降低。而恢復期KD患者冠狀動脈組織中適應性免疫細胞，尤其是B細胞和CD8+T細胞亞群明顯增多。這一結果表明適應性免疫細胞可以選擇性地從外周血招募到冠狀動脈，從而引起冠脈損傷[25]。有研究發(fā)現(xiàn)靜脈用免疫球蛋白(intravenous immunoglobulins，IVIG)無反應患者與IVIG敏感患者 CD8+HLA-DR+T/CD8+CD69+T 細胞比值差異有統(tǒng)計學意義。IVIG可抑制CD8+T細胞的活化，過量的CD8+T 細胞活化可引起 IVIG 無反應，推測CD8+HLADR+T/CD8+CD69+T 細胞的比值可能成為預測IVIG 敏感性的指標[26]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，急性KD患者CD8+T細胞的百分比減少，尤其是效應CD8+記憶T細胞，且這種改變不被IVIG影響。可能這種能對抗原發(fā)生快速反應的效應CD8+T細胞的缺乏是KD發(fā)生的一個危險因素[27]。有學者檢測了KD及其他發(fā)熱病人以及正常兒童的淋巴細胞亞群。相比正常兒童和其他發(fā)熱患兒，KD患兒CD3+T、CD4+T，CD8+T淋巴細胞顯著降低，然而，KD組與其他發(fā)熱患兒組比較沒有統(tǒng)計學差異。在IVIG注射前，注射完及注射后2周分別檢測淋巴細胞亞群，在IVIG敏感組，注射后CD4+T細胞及CD8+T細胞均上升，且維持至2周后，而IVIG抵抗組在注射完后有短暫的上升后，2周后檢測即發(fā)現(xiàn)細胞群的降低。但在3個不同的時間點，IVIG敏感組及IVIG抵抗組兩組間淋巴細胞亞群比較，沒有統(tǒng)計學差異。雖然各亞型NK細胞IVIG敏感組和抵抗組均呈增加趨勢，但是在丙球注射前，CD56-CD16+NK細胞在兩組間有顯著差異。同樣猜想CD56-CD16+NK可能成為預測 IVIG 敏感性的指標[28]。在 KD患者中，IVIG輸注后活化的Treg細胞和CD25+CD56brightNK細胞比例增加，多個淋巴細胞亞群顯示淋巴組織歸巢受體CD62L表達增加。且IVIG治療降低了細胞毒性CD56dimNK細胞中CD107a脫顆粒標志物的表達頻率，顯著減少了靶細胞的殺傷和多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。因此IVIG在治療KD免疫失調(diào)患者時發(fā)揮著多重作用，尤其是對NK細胞亞群和CD4+T細胞[29]。

2.2 過敏性紫癜和腎病綜合征

過敏性紫癜(henoch-Schonlein purpura，HSP)患兒體內(nèi)存在淋巴細胞功能紊亂，與正常對照組相比，在紫癜腎炎(HSPN)組和HSP組，外周血CD3+、CD4+、CD8+T和NK細胞水平顯著減少，CD19+B水平顯著升高，而HSPN組變化比HSP組更大。提示HSPN患兒免疫功能障礙具體表現(xiàn)為細胞免疫功能低下，導致炎性介質(zhì)分泌增多，激活B細胞，進而使免疫球蛋白分泌增多，導致小血管炎的發(fā)生[30]。目前HSP診斷和治療主要根據(jù)臨床癥狀決定，但在尿常規(guī)沒有異常時早期腎臟損害并不能及早發(fā)現(xiàn)，對癥治療雖然能夠緩解皮膚紫癜的癥狀，但其他癥狀尤其是腎臟損害的癥狀并沒有緩解。臨床研究證明，年齡越小的HSP患兒，如果在早期能夠接受針對性的治療，其腎臟損害的危險性就會降低，并能夠減少紫癜性腎炎的發(fā)病概率[31-32]。有研究發(fā)現(xiàn)血清胱抑素C(CysC)和血栓調(diào)節(jié)素(TM)與CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+呈顯著負相關，與CD8+水平呈顯著正相關。聯(lián)合CysC、TM、T淋巴細胞亞群的檢測可提高對HSP患兒的準確診斷率，及早進行免疫學的干預[33]。腎病綜合征(Nephrotic syndrome，NS)是兒童常見的腎小球疾病，其發(fā)病機制仍然是不清楚的。既往研究發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+T細胞的平衡在NS發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[34]。NS患兒CD3+T，CD4+T，CD4+/CD8+顯著降低，且可能與疾病的發(fā)展和預后有關[35]。此外，NS患者的B淋巴細胞、NK細胞和NKT細胞明顯減少[36]。在激素敏感型腎病綜合(SSNS)和激素依賴(SDNS)/頻復發(fā)(FRNS)腎病綜合征中，外周血CD3+，CD4+，CD4+/CD8+均下降，其中SDNS/FRNS患兒降低更明顯[37]。提示需要重視免疫細胞失衡在NS發(fā)病及激素治療中的作用。

2.3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡和幼年特發(fā)性關節(jié)炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種復雜的、異質(zhì)的免疫介導疾病。免疫紊亂在疾病的表型和預后結果中具有關鍵作用。與對照組相比，SLE患者CD4+T、yδT、NK細胞比例明顯降低，CD8+T、NKT、CD19+B細胞比例明顯升高。狼瘡性腎炎(LN)中Treg的百分率顯著低于非LN患兒和正常兒童，隨訪6個月時，Treg百分比顯著升高。yδT細胞和NK細胞升高與黏膜潰瘍明顯相關，而CD4+T細胞升高與關節(jié)炎顯著相關，NKT細胞升高與自身免疫性溶血性貧血相關，CD8+T細胞減低則主要與血管炎有關[38]。SLE可引起多種臨床癥狀，有部分患兒以關節(jié)疼痛為首發(fā)表現(xiàn)，這與關節(jié)型JIA臨床表現(xiàn)有相似之處。但兩者可能有不同的炎癥途徑和免疫調(diào)節(jié)特征。有研究發(fā)現(xiàn)SLE患兒以CD8+T淋巴細胞異常表達為主，并與疾病活動正相關。幼年特發(fā)性關節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)患兒則以CD4+T淋巴細胞異常升高為主，并且與JIA患兒關節(jié)滑膜炎癥及局部關節(jié)軟骨破壞有關。SLE患兒外周血中B淋巴細胞比例明顯升高，引起自身抗體和細胞因子的過度分泌，導致患兒多系統(tǒng)損害。兩者NK細胞比例均明顯低于對照組，SLE組較JIA組降低卻更為顯著，這可能是導致SLE患兒更易并發(fā)感染，重者甚至導致死亡的重要原因[39]。

2.4 Graves病

Graves病(Graves’ disease，GD)是一種與T細胞和B細胞反應密切相關的自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)在GD患兒血清ALT水平與CD8+T細胞百分比呈正相關；在發(fā)生凸眼癥的患兒，其CD19+B細胞百分比和CD4/CD8比率較高，在有或沒有血尿組之間比較，淋巴細胞亞群無差異。提示CD8+T細胞可能在GD患兒肝功能障礙的發(fā)病機制中起重要作用[40]。在自身免疫性甲狀腺疾病中，Treg細胞通過調(diào)節(jié)局部免疫反應，活化CD8+T細胞促進甲狀腺細胞的凋亡，由細胞裂解產(chǎn)物進一步促進T細胞增殖[41-42]。其中CD4+CD25+Forxp3+Treg能通過細胞因子和失能的T細胞抑制過強的免疫反應，升高循環(huán)血液中CD4+T細胞的數(shù)量和降低CD8+T細胞的數(shù)量來控制甲狀腺的免疫損傷[43]。提示外周血淋巴細胞亞群免疫表型可為進一步了解自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病機制提供依據(jù)。

2.5 兒童HIV感染

暴露于人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的未感染嬰兒(HIV-exposed，uninfected，HEU)的淋巴細胞亞群與未接觸和未感染HIV的嬰兒(HIV-unexposed and uninfected，HUU)不同。與HUU嬰兒相比，HEU嬰兒在6～12月時CD4+T細胞計數(shù)更高，在3～12月時CD19+B細胞的絕對數(shù)量和百分比更高。B細胞可能在預防圍產(chǎn)期HIV病毒傳播中發(fā)揮保護作用[44]。長期非進展(long-term non-progressor，LPNT)與非長期非進展組(non-long-term non-progressor，nLTNPs)HIV 感染兒童的淋巴細胞亞群研究發(fā)現(xiàn)，nLTNPs中CD4+T細胞的絕對計數(shù)和百分比低于LTNPs。與對照組相比，兩組細胞毒性T細胞都很高，自然殺傷(NK)細胞明顯降低，幼稚B細胞升高[45]。在進展緩慢的HIV感染兒童中調(diào)節(jié)性T細胞活性增強和T細胞穩(wěn)態(tài)信號轉(zhuǎn)導增強，從而維持這些個體保持正常年齡段CD4計數(shù)水平，使疾病進展延緩[46]。有研究發(fā)現(xiàn)，在每日給予含干酪乳桿菌(LCS)的發(fā)酵乳(6.5×109CFU)8周后，外周血CD4+T細胞和Th2計數(shù)均明顯增加，CD8+T細胞從27.5%下降到13.2%，血漿HIV載量下降[47]。

2.6 普通變異型免疫缺陷病

普通變異型免疫缺陷病(common variable immunodeficiency，CVID)的特點是反復感染，自身免疫，淋巴細胞增生，低γ球蛋白血癥，抗體產(chǎn)生缺陷。兒童期起病的CVID比成人少見且淋巴細胞亞群異常未被徹底評估。兒童CVID患者CD19+B細胞的絕對數(shù)量和百分比以及CD4+/CD8+比值明顯低于年齡匹配的健康對照組。其CD4+T細胞、CD4+CD45RA+naive T細胞、RTE細胞比例較對照組降低。T，B和NK細胞異常與患者臨床表型的關系為：CD8+T細胞比例上升，CD19+B細胞和NK細胞的下降和CVID患者發(fā)生支氣管擴張相關；naiveCD4+T細胞和RTE細胞百分比的降低是兒童CVID患者發(fā)生慢性腹瀉的危險因素。具有自身免疫性疾病或淋巴細胞增生的CVID患者與無自身免疫性疾病或淋巴細胞增生的患者在各型細胞亞群上無顯著差異[48]。盡管潛在的遺傳缺陷可能會對觀察到的改變產(chǎn)生影響，但這些B細胞和T細胞間中的一些異常似乎與某些終末器官功能受損有關。

免疫相關性疾病的淋巴細胞亞群變化見表2。

表2 免疫相關性疾病與淋巴細胞亞群變化Table 2 Lymphocyte subsets alterations in immunological disorder

綜上所述，兒科許多疾病中存在免疫功能紊亂是毋庸置疑的，但淋巴細胞亞群的變化在其中扮演的角色以及與臨床癥狀之間的相關性并沒有明確結論。目前淋巴細胞亞群分析是臨床除免疫球蛋白及補體檢測外最能評估患兒免疫功能狀態(tài)的指標，本文概述了兒科常見感染性疾病及免疫紊亂相關疾病中淋巴細胞亞群的情況，為更好的應用和掌握淋巴細胞亞群分析這一免疫評估工具提供了有效的參考依據(jù)。未來的研究期待能進一步闡明免疫紊亂與不同疾病臨床表型之間的關系，為更好地進行臨床管理提供有效依據(jù)。