陶俊豪, 鄢慧瓊, 謝 琿, 應(yīng)華忠, 戴方偉

(杭州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310013)

泰 澤 病 原 體 （Tyzzer’s organism） 是Ernest Tyzzer［1］于1917 年 發(fā) 現(xiàn) 的 一 種 毛 發(fā) 狀 芽 孢 桿 菌（Clostridium piliforme，舊稱(chēng)Bacillus piliformis），能夠感染多種動(dòng)物，引起肝腸壞死、腹瀉及死亡（稱(chēng)為泰澤?。?。目前在小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、倉(cāng)鼠、麝鼠、兔、犬、貓和馬等體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)過(guò)泰澤病原體，此外有關(guān)鳥(niǎo)類(lèi)感染泰澤病原體的案例報(bào)告有4 篇［2-5］。Smith等［6］發(fā)現(xiàn)一例感染泰澤病原體的人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者，其體內(nèi)微生物序列與已知的泰澤病原體16 S rRNA序列只有一個(gè)堿基對(duì)不同，這是迄今人類(lèi)臨床上報(bào)告的唯一病例。國(guó)內(nèi)姚菊芳等［7］對(duì)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有密切接觸的飼養(yǎng)人員、相關(guān)人員和無(wú)關(guān)人員進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)密切接觸人員的泰澤病原體抗體陽(yáng)性率（85.7%）高于相關(guān)人員（40.5%）和無(wú)關(guān)人員（22.0%）。泰澤病原體主要呈隱性或者亞臨床感染，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和相關(guān)工作人員均存在威脅，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物泰澤病原體檢測(cè)方法》（GB/T 14926.10—2001）規(guī)定泰澤病原體是清潔級(jí)以上動(dòng)物必須排除的病原體之一。

泰澤病原體是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，無(wú)法在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只能用雞胚和選定的細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)［8］。這極大地限制了對(duì)泰澤病原體的研究。目前通常使用已經(jīng)受感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行泰澤病原體研究。鑒于此，本文從泰澤病原體的生物學(xué)特性、流行病學(xué)與疾病特征、檢測(cè)方法與進(jìn)展以及防治四個(gè)方面進(jìn)行綜述，為以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制和生物安全管理為目標(biāo)的泰澤病原體研究提供參考。

1 泰澤病原體的生物學(xué)特性

泰澤病原體是一種厭氧的專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生毛發(fā)狀芽孢桿菌，有繁殖體和芽孢兩種形態(tài)［9］。繁殖體呈絲狀或粗短桿狀。絲狀結(jié)構(gòu)的細(xì)菌邊緣由細(xì)胞質(zhì)膜、中間層和厚度為25～30 nm 的特征性細(xì)胞壁組成，富含鞭毛；粗短桿狀的細(xì)菌內(nèi)含有許多較小的空泡，細(xì)菌外壁邊緣可見(jiàn)一層額外的疏松層，厚度約為3.5 nm，完全包圍菌體，并與胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)直接接觸，寄主細(xì)胞的核糖體與其外圍相連［10］。繁殖體在體外易失活，一般以芽孢的形式傳播，可通過(guò)鞭毛感染另一個(gè)宿主細(xì)胞。

泰澤病原體最常見(jiàn)的傳播方式為糞-口傳播，動(dòng)物一般從受糞便污染的環(huán)境中攝入芽孢。垂直傳播也是泰澤病原體感染動(dòng)物的途徑之一。泰澤病原體通過(guò)細(xì)菌導(dǎo)向的宿主微絲依賴(lài)機(jī)制入侵腸上皮細(xì)胞，然后迅速逃脫吞噬小體，以與志賀菌和立克次體相似的方式在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制。與其他胞內(nèi)病原體的區(qū)別在于，泰澤病原體富有的周生鞭毛使其能夠在細(xì)胞內(nèi)快速運(yùn)動(dòng)，并可能侵入細(xì)胞核［11］。

泰澤病原體的繁殖體在45 ℃加熱15 min即可被殺滅；芽孢能夠在56 ℃下存活，在60 ℃加熱30 min 滅活，在80 ℃加熱15 min滅活。泰澤病原體在－80 ℃能保存數(shù)年，其感染力與菌株種類(lèi)、芽孢數(shù)量有關(guān)，一般至少需要50～100 個(gè)芽孢才能達(dá)到半數(shù)感染量。甲醛、過(guò)氧乙酸、次氯酸鈉、碘酚、苯酚可滅活芽孢。

泰澤病原體有多種菌株，不同宿主的菌株具有不同的抗原表位，同一宿主的不同分離株在蛋白質(zhì)和抗原表型上存在差異，單個(gè)鞭毛抗原不能用于感染所有分離株的動(dòng)物的血清學(xué)測(cè)試。但各分離株之間均有共同表位，這可能是泰澤病原體為了適應(yīng)不同宿主所出現(xiàn)的遺傳進(jìn)化［12-13］。

2 泰澤病的流行病學(xué)與疾病特征

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔、小鼠、大鼠、沙鼠等對(duì)泰澤病原體均易感。有研究表明，從小鼠體內(nèi)分離的M 株、大鼠體內(nèi)分離的R 株以及兔體內(nèi)分離的K 株對(duì)小鼠致病性是相同的［14］。泰澤病原體接種小鼠后，小鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素-12 表達(dá)上升，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和Th1 反應(yīng)在感染和介導(dǎo)免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［15-16］。而且無(wú)胸腺的小鼠比有胸腺的小鼠更容易感染泰澤病原體［17］，這可能是由于無(wú)胸腺的小鼠免疫力更低。泰澤病原體毒力因子的成分為蛋白質(zhì)，不同的分離株能引起不同程度的細(xì)胞毒性，表明不同的泰澤病原體菌株可以誘導(dǎo)不同的臨床表現(xiàn)［18］。

泰澤病的癥狀一般在動(dòng)物死亡前不久才出現(xiàn)，而且通常是非特異性的，在個(gè)體之間存在差異，但都會(huì)出現(xiàn)肝臟和腸道病變。鼠類(lèi)感染泰澤病原體后，通常會(huì)出現(xiàn)肝腸病變，偶爾出現(xiàn)心臟病變及腦炎［3，19］。小鼠對(duì)泰澤病原體的易感性隨宿主年齡、免疫狀態(tài)和感染菌株的不同而出現(xiàn)差異。倉(cāng)鼠和沙鼠在死亡前很少有或無(wú)跡象，有一些病例會(huì)出現(xiàn)腹瀉、肛周糞便污染、抑郁、脫水、毛發(fā)粗糙等癥狀，并且幼年動(dòng)物無(wú)法成長(zhǎng)［20］。實(shí)驗(yàn)幼兔對(duì)泰澤病原體非常易感，臨床表現(xiàn)為不同程度的胃腸道癥狀，體征包括食欲不振、嗜睡、腹脹、盲腸嵌塞、腹瀉、脫水等［21］。自發(fā)性腦炎是一種罕見(jiàn)的泰澤病表現(xiàn)，在沙鼠和雀形目動(dòng)物中有報(bào)告［2-3，22］。研究還發(fā)現(xiàn)，泰澤病原體感染后的沙鼠［22］和普通狨猴［23］的中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)發(fā)生病變。

對(duì)感染泰澤病原體的鼠類(lèi)進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)盲腸和回腸肌層均有多灶性壞死，有多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜潰瘍旁的上皮細(xì)胞和黏膜肌層的平滑肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)叢生的細(xì)長(zhǎng)桿菌，腸系膜內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；肝臟中可觀察到直徑達(dá)1 mm的白褐色病灶，門(mén)脈周?chē)心绦愿渭?xì)胞壞死的多灶性病變，壞死灶含有細(xì)胞碎片，輕度多形核細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)紅細(xì)胞［19］。在感染最嚴(yán)重時(shí)期的大鼠肌間神經(jīng)叢內(nèi)通常出現(xiàn)空泡化或缺失，而在病情較輕的動(dòng)物器官中僅發(fā)現(xiàn)肝門(mén)管區(qū)周?chē)休p微的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)［24］。胃腸道、肝臟和心臟的壞死性和炎性病變是哺乳動(dòng)物泰澤病的典型病理表現(xiàn)。病變區(qū)域和健康區(qū)域之間的過(guò)渡區(qū)很小，由1層或2層部分變性的細(xì)胞組成，對(duì)堿性和酸性染料的親和力增強(qiáng)［25］。

泰澤病的發(fā)病機(jī)制包括攝入泰澤病原體芽孢或繁殖體。動(dòng)物感染該菌后，首先在回腸-盲腸結(jié)腸區(qū)域復(fù)制，進(jìn)一步可能到達(dá)肝臟，再感染體內(nèi)其他組織或器官，偶爾也通過(guò)體循環(huán)到達(dá)心臟［26］。肝損傷可導(dǎo)致肝臟氨基酸清除率降低，這可能是代謝性酸中毒的重要因素［27］。腸黏膜上皮損傷與肝臟損傷都可能引起低血糖。

泰澤病一般由多種因素引起，其發(fā)病率低，但致死率高。幼年動(dòng)物特別是當(dāng)免疫功能受損時(shí)最易感。在小型哺乳動(dòng)物體內(nèi)，潛伏期一般為2～10 d。Fries［28］通過(guò)對(duì)小鼠、大鼠和兔體液抗體應(yīng)答的長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，該病原體可能以持續(xù)或潛伏感染的形式存在于動(dòng)物體內(nèi)，并持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)，動(dòng)物對(duì)感染的抵抗力與抗體效價(jià)有關(guān)。泰澤病原體的感染力和致病力與宿主的種屬、健康狀況、周齡、性別、飲食和機(jī)體免疫，以及宿主所處的周邊環(huán)境均有密切關(guān)系。過(guò)度擁擠、衛(wèi)生條件差和皮質(zhì)類(lèi)固醇治療等因素可誘發(fā)泰澤病。

Ganoe等［29］認(rèn)為，泰澤病可能是在過(guò)去50年里導(dǎo)致北美麝鼠數(shù)量顯著下降的原因之一。研究還發(fā)現(xiàn)泰澤病原體在嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)具有較高的檢出率。馮麗萍等［30］、潘金春等［31］和魏杰等［32］分別對(duì)2010—2013年上海市、2013—2015年廣東省和2009—2013年北京市實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠的病原體感染情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，各年度均能檢出泰澤病原體。戴方偉等［33］對(duì)普通環(huán)境飼養(yǎng)的長(zhǎng)爪沙鼠病原感染情況進(jìn)行初步調(diào)查，泰澤病原體檢出率為6.7%。北京市及浙江省的地方標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)將泰澤病原體列入清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠必檢項(xiàng)目之一。

3 泰澤病原體的檢測(cè)技術(shù)及其進(jìn)展

泰澤病原體的檢測(cè)方法有很多，如組織病理學(xué)診斷、可的松激發(fā)試驗(yàn)、懸液芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymearse chain reaction，PCR）等，但都存在一定的缺陷［34］。例如，2001 年發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 14926.10—2001）將可的松激發(fā)試驗(yàn)作為參考方法，此法以發(fā)病動(dòng)物特有的病理改變及鏡下檢出泰澤病原體為依據(jù)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但操作繁瑣；組織病理學(xué)診斷也存在相似的缺點(diǎn)。

何靜云等［35］于2006 年證明，免疫磁珠分離技術(shù)可有效地分離和純化泰澤病原體，為特異性ELISA 診斷抗原的制備奠定了基礎(chǔ)。2008 年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 14926.10—2008） 將可的松激發(fā)試驗(yàn)刪除，IFA 和ELISA兩種方法被用來(lái)進(jìn)行泰澤病原體診斷。ELISA具有簡(jiǎn)單、可靠、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)窗口期或隱性感染動(dòng)物易漏檢；IFA 方法雖簡(jiǎn)單易行，但由于梭菌與泰澤菌有交叉反應(yīng)，可能存在非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽(yáng)性。ELISA和IFA都存在檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)方法成本高等問(wèn)題。由于泰澤病原體的分離培養(yǎng)較為困難，ELISA 等方法的假陽(yáng)性率較高，因此一般采用對(duì)患病動(dòng)物的器官組織切片后通過(guò)銀染或May-Giemsa染色來(lái)確認(rèn)該菌。

Niepceron 等［36］在2010 年建立了一種特異性強(qiáng)的巢式PCR 檢測(cè)法。該方法適用于臨床標(biāo)本，包括盲腸內(nèi)容物和肝臟，也可應(yīng)用于設(shè)備簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行泰澤病的常規(guī)診斷。丁聰?shù)龋?7］采取ELISA和IFA并結(jié)合巢式PCR 法對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠中泰澤病原體的攜帶情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ELISA 和IFA 敏感性要高于PCR，提出采用IFA 與ELISA 相結(jié)合的方法可提高檢測(cè)結(jié)果的敏感性及可靠性。馮潔等［38］對(duì)已建立的泰澤病原體巢式PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，并將優(yōu)化后的巢式NPCR 與IFA 相比，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的方法具有較高的特異性和靈敏度。PCR 或反轉(zhuǎn)錄PCR 等分子檢測(cè)方法可以克服其他檢測(cè)方法的局限性［39］，具有高特異性，能區(qū)分密切相關(guān)的非致病株和致病株的感染性病原體，但新菌株的引物位點(diǎn)的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致假陰性，并且PCR的高敏感性可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。

趙婷婷等［40］根據(jù)泰澤病原體16S rDNA 保守基因組序列設(shè)計(jì)引物和特異性探針，建立反向斑點(diǎn)雜交方法。張超超等［41］采用懸液芯片技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)兔中包括泰澤病原體在內(nèi)的常見(jiàn)病原體檢測(cè)，該方法具有快速、微量、特異、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。Tosa 等［42］建立了泰澤病原體、鼠肝炎病毒和仙臺(tái)病毒（又稱(chēng)日本血凝病毒）的多重免疫層析檢測(cè)法，此方法快速簡(jiǎn)便，能夠同時(shí)且特異地檢測(cè)多種抗原的抗體，但試紙的制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，許多實(shí)驗(yàn)室可能缺乏必要的試劑和技術(shù)。

另外，由于泰澤病在早期很少出現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)癥狀后動(dòng)物很快就會(huì)死亡，因此開(kāi)發(fā)一種早期診斷技術(shù)對(duì)泰澤病的防治至關(guān)重要。有研究者采用實(shí)時(shí)熒光PCR 法分析廢氣粉塵樣本的方法檢測(cè)小鼠嗜肺巴斯德桿菌［43］和諾如病毒（MNV）［44］，結(jié)果顯示該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的污穢墊料哨兵監(jiān)測(cè)法［45］，這為泰澤病原體檢測(cè)提供了新的思路。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification，LAMP）具有靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將其與膠體金技術(shù)結(jié)合對(duì)泰澤病原體的早期診斷可起到重要作用。生物傳感器技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和生物成像發(fā)光技術(shù)等的高速發(fā)展，也為泰澤病原體檢測(cè)帶來(lái)廣闊的前景。

4 泰澤病的防治

泰澤病原體的感染是由多種因素導(dǎo)致，目前還沒(méi)有針對(duì)泰澤病原體的疫苗，對(duì)泰澤氏病的治療尚不完善。由于該病發(fā)病迅速，在發(fā)現(xiàn)時(shí)動(dòng)物往往很快就死亡，因此難以進(jìn)行早期的診斷治療。目前，僅有兩例報(bào)告［27，46］通過(guò)靜脈注射葡萄糖、廣譜抗生素、抗菌和抗炎藥物成功治療泰澤病原體感染的馬；但大多數(shù)情況下通過(guò)靜脈注射藥物的方法使患有疾病的幼馬短暫性好轉(zhuǎn)后，還會(huì)很快惡化，最終死亡［46］。一般認(rèn)為，四環(huán)素對(duì)泰澤病有部分療效，而氯霉素治療需要大劑量［47］。有研究者認(rèn)為，針對(duì)泰澤病原體這類(lèi)細(xì)胞內(nèi)寄生型病原體的治療藥物研發(fā)，可參考同樣作為胞內(nèi)寄生菌的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和布魯桿菌（Brucella）［48］。例如，結(jié)核分支桿菌的治療藥物貝達(dá)喹啉是針對(duì)ATP 合成酶［49］；Q203 則屬于咪唑并吡啶類(lèi)化合物，可作用細(xì)胞色素bcl 復(fù)合物，抑制ATP合成，影響結(jié)核分枝桿菌的能量代謝［50］。上述兩種藥物均可為泰澤病的治療提供參考。

監(jiān)測(cè)潛在的帶菌動(dòng)物，如沙鼠和倉(cāng)鼠等嚙齒動(dòng)物，是一項(xiàng)預(yù)防泰澤病的重要措施。一旦發(fā)現(xiàn)動(dòng)物被感染，芽孢很可能會(huì)在個(gè)體之間快速轉(zhuǎn)移，因此對(duì)小鼠和大鼠的感染群體應(yīng)及時(shí)進(jìn)行生物凈化或淘汰處理。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日常飼養(yǎng)工作中，預(yù)防泰澤病的具體措施包括：使用含氯、含碘消毒劑進(jìn)行消毒，制定嚴(yán)格的洗手規(guī)章制度，增加更換防護(hù)用品的頻率，改變動(dòng)物的喂食順序和清洗順序，對(duì)進(jìn)出飼養(yǎng)地的人員進(jìn)行嚴(yán)格限制和培訓(xùn)管理［51］。

5 展望

近年來(lái)，針對(duì)泰澤病原體的工作主要集中于檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)、臨床癥狀、病理特征研究和疾病治療方面，而基礎(chǔ)性研究并不多見(jiàn)。例如，關(guān)于泰澤病原體基因組方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)告。另外，泰澤病原體難以進(jìn)行人工培養(yǎng)和分離純化，致使其深入研究相對(duì)困難。而且，由于無(wú)法體外獲得大量純化的抗原，使得國(guó)內(nèi)泰澤病原體檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)面臨困境，進(jìn)口試劑盒供應(yīng)雖能暫時(shí)緩解國(guó)內(nèi)檢測(cè)材料供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，但在新冠病毒肺炎全球大流行的環(huán)境下，進(jìn)口試劑采購(gòu)的不便性勢(shì)必會(huì)對(duì)檢測(cè)工作產(chǎn)生不利影響。因此，泰澤病原體基因組序列的確定是研究泰澤病原體生物學(xué)特性的理論基礎(chǔ)，人工培養(yǎng)泰澤病原體的體系優(yōu)化也是必須要解決的難題之一，在此基礎(chǔ)上才能為其生物學(xué)特性研究及疫苗研制等工作奠定基礎(chǔ)，從而減少泰澤病原體感染，避免不必要的經(jīng)濟(jì)損失，保證我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技事業(yè)穩(wěn)步健康發(fā)展。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

陶俊豪和鄢慧瓊檢索和整理文獻(xiàn)，撰寫(xiě)文章；謝琿對(duì)文章框架及內(nèi)容進(jìn)行修改，并提供重要意見(jiàn)；應(yīng)華忠提供資金，對(duì)文章內(nèi)容進(jìn)行檢查并提出意見(jiàn)；戴方偉修改文稿，提供資金。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。