譚瑞娜 郝昕理永霞馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所)(東北林業(yè)大學(xué))

松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)作為松材線蟲病的病原，嚴(yán)重威脅東亞和歐洲等地的森林生態(tài)系統(tǒng)安全[1]。截至2021年末，松材線蟲病已在我國18個省731個縣級行政區(qū)發(fā)生，發(fā)生面積171.65萬hm2，導(dǎo)致1 407.92萬株松樹死亡，并且表現(xiàn)出向西和向北快速擴(kuò)散的態(tài)勢，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的生態(tài)破壞[2]。目前科研人員把研究重點聚焦于對松材線蟲的防治和探索松材線蟲病的致病機(jī)理，而對松材線蟲發(fā)育相關(guān)機(jī)制的研究相對較少[3-4]。

泛素化調(diào)控是一個由泛素化和去泛素化協(xié)同調(diào)控的動態(tài)平衡可逆過程。去泛素酶(DUBs)是介導(dǎo)蛋白質(zhì)去泛素化過程的蛋白質(zhì)家族，它在生物體生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[5]。作為去泛素化酶的一種，USP在生物體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育、信號傳遞、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移及一些免疫反應(yīng)等方面均發(fā)揮著重要的作用[6]。在人體中USP7可以介導(dǎo)免疫信號傳遞、修復(fù)DNA損傷以及腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[7-8]；斑馬魚的USP5基因通過調(diào)節(jié)下游基因激活對病毒的免疫反應(yīng)[9]。另一方面，一些USP基因還參與了生物體雌雄個體之間的分化，如人體中USP9Y基因與男性精子的產(chǎn)生密切相關(guān)[10]；小鼠USP19基因參與調(diào)節(jié)雄鼠的骨骼肌的強(qiáng)度，促進(jìn)雌雄個體分化[11]。此外，在對線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，USP基因參與線蟲和昆蟲的免疫、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育[12-15]。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)松材線蟲泛素特異性蛋白酶的報道。

為探索USP在松材線蟲免疫和發(fā)育過程中的功能，本文通過對松材線蟲泛素特異性蛋白酶USP家族進(jìn)行分析。首先通過松材線蟲基因組數(shù)據(jù)篩選松材線蟲USP家族成員，隨后對其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、保守基序和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并分析USP在松材線蟲各發(fā)育階段中的表達(dá)模式。為進(jìn)一步揭示USP家族成員在松材線蟲生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的重要功能提供理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 松材線蟲USP家族成員鑒定

首先通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫查詢并下載秀麗線蟲的USP基因序列，隨后利用秀麗線蟲USP基因序列在Wormbase數(shù)據(jù)庫(https://parasite.wormbase.org/)中結(jié)合松材線蟲最新全基因組SAMEA7232845的相關(guān)數(shù)據(jù)獲得松材線蟲USP候選基因序列[16]。隨后在NCBI-Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[17]和Pfam(http://pfam.xfam.org/)[18]上鑒定所得候選蛋白序列是否具有USP保守結(jié)構(gòu)域，刪除冗余序列，獲得松材線蟲USP家族成員蛋白序列。利用在線軟件Expasy(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)[19]分析松材線蟲USP家族成員的理化性質(zhì)。

為了解松材線蟲USP家族成員與其他線蟲中USP家族的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 11.0對8個秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)、8個馬來絲蟲(Brugiamalayi)、5個Caenorhabditisbriggsae和4個遠(yuǎn)交線蟲(Caenorhabditisremanei)中的USP蛋白序列進(jìn)行多序列比對，并根據(jù)多序列比對結(jié)果及校正的Akaike信息準(zhǔn)則(AICc)和Bayesian信息準(zhǔn)則(BIC)構(gòu)建最大似然進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗1 000次。比對結(jié)果通過iTOL在線工具(https://itol.embl.de/)進(jìn)行美化。

1.2 松材線蟲USP家族系統(tǒng)發(fā)育分析及保守基序

通過松材線蟲基因結(jié)構(gòu)注釋文件提取松材線蟲Bx-usps基因結(jié)構(gòu)，利用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化分析[20]。同時，應(yīng)用MEME在線網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/)[21]對松材線蟲USP家族成員的保守基序分布進(jìn)行分析，motif數(shù)值設(shè)為5，其它參數(shù)默認(rèn)，隨后將最大似然樹與MEME結(jié)果結(jié)合繪制基因結(jié)構(gòu)圖和保守基序結(jié)構(gòu)圖。

1.3 松材線蟲USP家族染色體分布與結(jié)構(gòu)

篩選gff3文件得到的基因家族成員在染色體的位置、起始和終止位點以及基因長度等信息，構(gòu)建松材線蟲基因注釋文件。根據(jù)松材線蟲基因注釋文件，運(yùn)用TBtools工具提取線蟲基因密度信息[22]。隨后對Bx-usps基因在染色體上的分布情況進(jìn)行分析并繪制基因染色體分布圖。應(yīng)用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)[23]對蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 松材線蟲USP家族在線蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)譜

為探索松材線蟲USP家族成員在線蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮的具體作用，結(jié)合松材線蟲USP家族基因在線蟲不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI編號：PRJDB7519和PRJDB3458)[24-25]，獲得19個松材線蟲USP基因在線蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)值(FPKMs)，使用OmicStudio tools(https://www.omicstudio.cn)的Heatmap Plots工具對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理與表達(dá)模式熱圖繪制[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BxUSP家族理化性質(zhì)

經(jīng)過Wormbase數(shù)據(jù)庫BlastX檢索比對，及NCBI-Conserved Domains和Pfam對保守結(jié)構(gòu)域驗證后，從松材線蟲基因組中獲得19個USP家族成員，依據(jù)其與其他線蟲的蛋白相似程度，將其命名為BxUSP1-BxUSP19(表1和表2)。由松材線蟲USP家族成員理化性質(zhì)結(jié)果可知，編碼BxUSP蛋白的氨基酸個數(shù)平均為795.3個。BxUSP蛋白的分子質(zhì)量平均為90.82 ku，分子質(zhì)量最低的是BxUSP6(31.53 ku)，最高的是BxUSP18(15.89 ku)。BxUSP蛋白家族的理論等電點在4.77～9.43范圍內(nèi)分布，19個BxUSPs蛋白均為親水蛋白。

表1 USP家族成員與其他線蟲USP家族成員對照表

續(xù)(表1)

表2 家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

通過松材線蟲與秀麗線蟲、馬來絲蟲、Caenorhabditisbriggsae、遠(yuǎn)交線蟲等4種線蟲的USP蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖1)，明確了松材線蟲USP基因家族成員間的關(guān)系。根據(jù)進(jìn)化樹聚類分析發(fā)現(xiàn)Bx-USP3與Bma-USP3聚為一支；Bx-USP4和Bx-USP16與其他線蟲的USP39聚為一支；Bx-USP5與其他線蟲的USP5聚為一支；Bx-USP1和Bx-USP12聚為一支；Bx-USP2、Bx-USP8和Bx-USP18和其他線蟲的USP48聚為一支；Bx-USP11和Bx-USP13聚為一支；Bx-USP14與其他線蟲的USP14聚為一支；Bx-USP15與Bma-USP33聚為一支；Bx-USP17與其他線蟲的USP46聚為一支；Bx-USP9、Bx-USP10和Bx-USP19與其他線蟲的USP50聚為一支；Bx-USP6和Bx-USP7單獨為一支。表明線蟲USP家族進(jìn)化相對保守，且發(fā)現(xiàn)松材線蟲USP家族在數(shù)量上多于土壤線蟲和動物寄生線蟲的USP。

圖1 松材線蟲與其他線蟲USP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 BxUSP家族系統(tǒng)發(fā)育分析與保守基序

根據(jù)最大似然樹最佳模型預(yù)測結(jié)果，選擇WAG+G+F模型(貝葉斯信息準(zhǔn)則(BIC)=39 051.073，赤池信息準(zhǔn)則(AICc)=38 674.152)構(gòu)建松材線蟲USP家族系統(tǒng)發(fā)育最大似然樹。通過分析松材線蟲USP基因結(jié)構(gòu)圖(圖2)，確定松材線蟲USP家族基因內(nèi)含子和外顯子的組成情況。結(jié)果顯示，19個基因中含有4～20個外顯子，其中Bxusp6只有4個外顯子，而Bx-usp1外顯子數(shù)目多達(dá)20個。松材線蟲USP家族保守基序結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，該家族具有相似的泛素特異性蛋白酶基序結(jié)構(gòu)。

圖2 松材線蟲USP家族基因結(jié)構(gòu)

圖3 松材線蟲USP家族保守基序結(jié)構(gòu)

2.3 BxUSP家族染色體分布與結(jié)構(gòu)

染色體排布結(jié)果表明，松材線蟲19個Bx-usps均勻分布在松材線蟲前6條染色體上。其中Bx-usp5、Bx-usp16和Bx-usp18位于第1條染色體的中部和低端；Bx-usp1、Bx-usp2和Bx-usp3均勻分布于第2條染色體中下部；Bx-usp4、Bx-usp6和Bx-usp17位于第3條染色體下部；Bx-usp7和Bx-usp8位于第4條染色體上部；Bx-usp9、Bx-usp10和Bx-usp19位于第5條染色體中上部；其余5個基因分布于第6條染色體中部和下部(圖4)，對蛋白二級結(jié)構(gòu)分析表明：19個α-螺旋(23.59%～60.36%)、β-折疊(11.50%～21.32%)、β-轉(zhuǎn)角(2.14%～8.07%)和無規(guī)則卷曲(23.21%～55.70%)所占比值相近(表3)。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖5)，松材線蟲USP家族蛋白結(jié)構(gòu)具有一定的相似性。

圖4 松材線蟲USP家族染色體定位

表3 松材線蟲USP家族結(jié)構(gòu)分析

圖5 松材線蟲USP蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 BxUSP家族在松材線蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)

通過分析松材線蟲在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得不同發(fā)育階段Bx-usps基因表達(dá)值，并繪制基因表達(dá)譜。結(jié)果表明，不同發(fā)育階段Bx-usps基因表達(dá)趨勢差異明顯。其中Bx-usp1、Bx-usp7、Bx-usp9、Bx-usp11、Bx-usp18在線蟲雌雄線蟲中的表達(dá)差異明顯，表明這5個Bx-usps可能主要與線蟲雌雄分化相關(guān)；Bx-usp4、Bx-usp5、Bx-usp6、Bx-usp10、Bx-usp13、Bx-usp15、Bx-usp16、Bx-usp17、Bx-usp19在線蟲卵中表達(dá)量較其他時期較高，表明這7個Bx-usps可能參與松材線蟲卵孵化；Bx-usp2、Bx-usp3、Bx-usp5、Bx-usp12在2齡線蟲中表達(dá)量較高，表明這4個Bx-usps可能與松材線蟲的生長發(fā)育有關(guān)；有趣的是，所有Bx-usps中只有Bx-usp14在3齡松材線蟲中表達(dá)量最高，表明該家族中只有Bx-usp14參與線蟲的成熟。所有Bx-usps均呈現(xiàn)隨發(fā)育階段增長表達(dá)量下降的整體趨勢，但是Bx-usp8卻表現(xiàn)出與其他Bx-usps相反的趨勢，且Bx-usp8在抗逆態(tài)4齡線蟲中表達(dá)量最高，推斷Bx-usp8可能在線蟲生長發(fā)育過程中表現(xiàn)為負(fù)反饋調(diào)節(jié)(圖6和表3)。

圖6 松材線蟲USP基因在松材線蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)譜

3 結(jié)論與討論

松材線蟲傳入我國以來，由其引起的松材線蟲病對我國的森林生態(tài)體系造成了嚴(yán)重破壞。研究松材線蟲的生理生化機(jī)制有助于闡釋松材線蟲的發(fā)育規(guī)律，為防治松材線蟲引發(fā)的松材線蟲病提供理論依據(jù)。

本研究利用松材線蟲基因組數(shù)據(jù)完成了松材線蟲USP基因家族的鑒定與分析工作，共鑒定出19個松材線蟲USP基因家族成員。理化性質(zhì)分析表明，松材線蟲USP基因家族成員的氨基酸組成在280～1 384個，分子質(zhì)量在31.53～158.94 ku。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，松材線蟲USP基因家族成員和其他線蟲USP基因家族成員之間存在一定的相似性。根據(jù)基因在染色體上的分布分析，松材線蟲USP基因家族成員不均勻的分布在6條染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)及保守基序分析表明，各亞家族成員之間差異較大，但同一亞家族的成員間具有相似的基因結(jié)構(gòu)及保守基序，說明在線蟲進(jìn)化過程中USP基因家族保守區(qū)域具有保留和丟失。本研究還分析了USP基因在松材線蟲各發(fā)育階段中的表達(dá)模式，推測松材線蟲體內(nèi)的泛素特異性蛋白酶在其生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要的作用，為后期進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證實了松材線蟲USP基因家族成員在線蟲胚胎發(fā)育、生長發(fā)育、雌雄分化過程中確實發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但其與松材線蟲免疫過程中的作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步探索與發(fā)現(xiàn)。鑒于目前為止，尚無人細(xì)致描述松材線蟲USP基因家族成員的促生作用，因此本研究為探索USP在松材線蟲胚胎發(fā)育、生長發(fā)育、雌雄分化和防治等方面提供了新的方向與思路。