和媛，張燁，王夢琛，崔斌，李延，樊海明

西北大學化學與材料科學學院，化學國家級教學實驗示范中心(西北大學)，西安 710127

化學生物學實驗是許多化學專業(yè)本科生的必修課程之一[1,2]。與有機化學實驗、無機化學實驗、材料化學實驗等基礎(chǔ)實驗課程相比，化學生物學實驗因其主要研究對象是生物分子，樣品制備存在操作步驟多、耗時長、原理抽象等特點。如何在有限的課時安排下，既保證實驗教學效果，又提高教學效率，全面發(fā)展學生的知行能力，是化學生物學實驗教學面臨的重要挑戰(zhàn)。虛擬仿真技術(shù)以計算機模擬技術(shù)為基礎(chǔ)，將儀器結(jié)構(gòu)、實驗過程與工作原理等以人機交互的方式呈現(xiàn)，是實現(xiàn)“互聯(lián)網(wǎng)+化學”的一種新型表達形式。虛擬仿真實驗既可以彌補傳統(tǒng)實驗教學在空間、時間、實驗條件等方面的缺憾，又可以對傳統(tǒng)實驗進行延伸和補充[3,4]。但是，虛擬實驗在培養(yǎng)學生動手能力和分析解決問題能力方面又存在局限性。為此，本文針對本科生化學生物學綜合實驗“金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的表達和動力學表征”，對原實驗教學內(nèi)容與教學方式進行了創(chuàng)新性改進，探索了線上線下混合教學模式在該實驗教學中的應(yīng)用[5]。

抗生素能夠有效治療細菌感染，然而抗生素的濫用加快了細菌耐藥性的發(fā)展，給人類健康帶來極大威脅[6]。中國每年有7億人次的細菌感染患者，抗生素的濫用比例高達80%。到2050年，全世界因抗生素耐藥性而死亡的人數(shù)預測將會超過癌癥，成為威脅人類生命健康的頭號殺手[7]。β-內(nèi)酰胺類抗生素作為歷史最悠久、使用范圍最廣、臨床最常使用的抗生素之一，其耐藥問題日趨嚴重[8]。β-內(nèi)酰胺酶誘導抗生素水解失活是細菌耐藥性發(fā)生的一種重要機制[9]。因此，開展β-內(nèi)酰胺酶的動力學表征實驗教學，對于學生深入了解β-內(nèi)酰胺酶的作用機理，認識和關(guān)注抗生素耐藥性問題具有重要意義。

L1酶的制備是動力學表征的前提，但是常規(guī)制備實驗包括基因擴增、PCR產(chǎn)物的分析與純化、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選、細菌擴大培養(yǎng)、蛋白質(zhì)的誘導表達、純化與鑒定等10余個環(huán)節(jié)，存在步驟復雜、耗時長(1周)、概念抽象等問題，給實際教學安排和學習帶來挑戰(zhàn)。鑒于此，本項目針對現(xiàn)有綜合性教學實驗“金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的表達和動力學表征”進行改進，通過線上線下混合教學模式開展實驗教學。改進內(nèi)容包括：(1) 課前通過虛擬仿真實驗線上學習L1酶的制備和動力學表征全過程及實驗原理，以打破時空限制，在有限的課時安排下為學生構(gòu)建完整知識體系，提高學習效率。(2) 課中有選擇性地進行重點實驗操作及拓展實驗，提高學生的動手能力和創(chuàng)新思維。重點實驗包括：重組蛋白AKTA純化、目標蛋白的SDS-PAGE分析、和紫外-可見分光光度法表征酶活。此外，本項目將教師的科研成果轉(zhuǎn)化為教學實驗[10,11]，新引入等溫滴定微量熱法(ITC)表征酶活實驗內(nèi)容進行拓展實驗，引導學生通過和紫外-可見分光光度法進行比較，加深對于兩種方法優(yōu)缺點的認識，培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維。線上-線下相結(jié)合、虛擬-實踐相結(jié)合、科研-教學相結(jié)合的實驗教學新模式在該實驗中取得了良好的教學效果。

1 實驗原理與方法

1.1 實驗原理

(1) 線上虛擬仿真實驗。

本實驗以虛擬仿真技術(shù)和微信平臺為依托，構(gòu)建集3D仿真、創(chuàng)新設(shè)計、全過程在線跟蹤記錄、考核評價、教學管理和數(shù)據(jù)分析于一體的移動虛擬實驗教學平臺。通過線上虛擬實驗操作，真實還原重組蛋白質(zhì)的制備過程，包括外源基因擴增、PCR產(chǎn)物的分析與純化鑒定、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞、單克隆菌株的活化、細菌擴大培養(yǎng)、蛋白質(zhì)的誘導表達等實驗。同時采用微信平臺一站式管理學習和考核，實現(xiàn)實驗教學的信息化、網(wǎng)絡(luò)化。

(2) 線下等溫滴定微量熱法表征酶活拓展實驗。

金屬β-內(nèi)酰胺酶L1催化水解青霉素反應(yīng)是一類重要的酶促反應(yīng)。進行金屬β-內(nèi)酰胺酶L1催化底物水解反應(yīng)的動力學常數(shù)KM、kcat的測定，不僅可以了解金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的催化活性，而且為尋找新型抑制劑對抗細菌耐藥性發(fā)展提供了理論和實踐基礎(chǔ)。由于任何酶促化學反應(yīng)都伴有一定的熱量吸收或釋放，并且熱量的變化速率和酶催化速率成正比，因而可以采用等溫滴定微量熱儀(ITC)通過檢測酶催化底物反應(yīng)過程中產(chǎn)生的實時熱量變化來計算酶催化反應(yīng)的速率。

其中，單位時間的熱量變化定義為熱功率：

Todd和Gomez[12]給出了n摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的熱量計算公式：

這里ΔHapp是反應(yīng)的總表觀摩爾焓變，[P]total是生成的產(chǎn)物濃度，V是ITC滴定池的體積。由酶催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物過程中產(chǎn)生的熱量為：

其中d[P]total/dt等于反應(yīng)速率，改寫方程得到反應(yīng)速率v = d[P]/dt = [1/(V·ΔHapp)]·(dQ/dt)。經(jīng)量熱儀提供的Origin程序?qū)?shù)據(jù)進行處理，對底物濃度和初速率進行米氏方程擬合，求得動力學參數(shù)vmax和KM。

式中，v為初速率，[S]為底物濃度，vmax為最大反應(yīng)速率，KM為米氏常數(shù)。

1.2 試劑或材料

三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，C4H11NO3，M = 121.14 g·mol-1)，頭孢唑啉鈉鹽(C14H13N8NaO4S3，M = 476.48 g·mol-1)，青霉素G鈉鹽(C16H17N2NaO4S，M = 356.37 g·mol-1)，濃鹽酸(HCl)，以上試劑均為分析純。L1型金屬β-內(nèi)酰胺酶溶液(實驗室自制，純度＞ 95%)。

1.3 儀器及設(shè)備

移動設(shè)備(手機或Pad)或計算機，《金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的表達及動力學表征虛擬仿真實驗》軟件(西北大學)，MLabs移動虛擬實驗室APP (慕樂網(wǎng)絡(luò)科技(大連)有限公司)，電子天平，紫外分光光度計，pH計，循環(huán)水式多用真空泵，移液槍，離心機，等溫滴定微量熱儀ITC 200 (美國馬爾文儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 線上虛擬仿真實驗

(1) 用手機微信關(guān)注Moolsnet微信公眾號，進行注冊和身份認證。

(2) 使用手機下載MLab軟件。

(3) 進入APP登錄界面，點擊練習模式圖標，載入“金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的表達虛擬仿真實驗”，按照提示完成實驗操作。

(4) 熟悉實驗流程及操作細節(jié)后，返回頁面主界面，點擊考試模式，對學習情況進行檢驗。

(5) 考試完成后，可在主界面點擊左上角記錄本樣圖標查看成績及歷史記錄。

1.4.2 線下等溫滴定微量熱法表征酶活拓展實驗

(1) 溶液配制。

① 緩沖液配制：稱量Tris堿配制50 mmol·L-1Tris，pH = 7.5的緩沖液，經(jīng)0.22 μm硝化纖維素膜過濾后超聲脫氣。

② 抗生素的準備：用上述緩沖液配制1.5 mmol·L-1青霉素G溶液(稱量1 mg青霉素G溶于1.871 mL緩沖液中)和13 mmol·L-1頭孢唑林溶液(稱量5 mg頭孢唑林溶于0.807 mL緩沖液中)。

③ 蛋白溶液的準備：采用紫外分光光度計，選擇波長280 nm測定L1酶溶液的吸光度AL1，記錄實驗數(shù)據(jù)。根據(jù)朗伯比爾定律計算酶溶液的濃度A = εbc (εL1= 54614 mol-1·L·cm-1；b為測量時的光程，單位為cm)，將L1酶溶液的吸光度AL1代入即可求得L1酶溶液摩爾濃度。隨后用50 mmol·L-1Tris pH 7.0緩沖液對其稀釋至20 nmol·L-1備用。

(2) 等溫滴定微量熱實驗。

將L1型金屬β-內(nèi)酰胺酶溶液加入樣品池(樣品池體積為210 μL)，抗生素溶液(13 mmol·L-1頭孢唑林或者1.5 mmol·L-1青霉素G)加入滴定針中，設(shè)定程序開始滴定實驗(滴定體積30 μL，轉(zhuǎn)速750 r·min-1，25 °C)并通過儀器實時記錄反應(yīng)過程中熱量隨時間的變化曲線，即反應(yīng)的熱譜曲線圖，直至其回到基線時停止實驗。參比池為超純水。數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶Origin軟件進行，通過積分熱譜曲線的峰面積可以獲得反應(yīng)的表觀焓變ΔHapp，并通過軟件中酶催化動力學分析模式獲得酶促反應(yīng)的動力學參數(shù)KM及kcat。

2 結(jié)果與討論

2.1 線上虛擬仿真實驗

本虛擬實驗共設(shè)十個關(guān)卡，包括：外源基因擴增、PCR產(chǎn)物的分析與純化鑒定、重組質(zhì)粒的構(gòu)建(酶切-純化-連接)、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞、單克隆菌株的活化、細菌擴大培養(yǎng)、蛋白質(zhì)的誘導表達、紫外法表征酶催化動力學參數(shù)。每個關(guān)卡可獨立運行，操作界面還提供文字提示、閃爍提示、實驗原理提示、在線提問等輔助功能，保證學生能夠根據(jù)提示獨立完成實驗操作。完成十個關(guān)卡實驗操作大約需要60 min，通關(guān)后成績自動上傳。線上實驗內(nèi)容關(guān)鍵場景及儀器均以實物為原型，仿真設(shè)備包括：PCR擴增儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、凝膠電泳儀、紫外切膠儀、紫外-可見分光光度計、電子天平、恒溫震蕩搖床、集熱式恒溫加熱水浴鍋等(圖1)。實驗參數(shù)及反應(yīng)過程也高度還原真實情況，提供高度沉浸感實驗體驗。

圖1 代表性虛擬仿真實驗場景

在實驗教學中，了解儀器的工作原理是十分重要的內(nèi)容之一。本項目針對實驗中抽象的實驗原理進行虛擬仿真建設(shè)，以豐富的原創(chuàng)性Flash動畫實現(xiàn)對抽象教學內(nèi)容的直觀展示，加深了學生對抽象原理的理解。如圖2所示，“PCR反應(yīng)原理視頻”展示了隨著“變性-退火-延伸”試管中微觀世界所發(fā)生的變化。再如瓊脂糖凝膠電泳環(huán)節(jié)，電泳開始后學生會觀察到不同分子量核酸條帶隨時間在凝膠上發(fā)生的位置變化，短DNA片段遷移較快，長DNA片段遷移較慢。加深了學生對于實驗原理的理解，提高了學習的積極性與學習效果。

圖2 PCR反應(yīng)原理視頻截圖

2.2 線下等溫滴定微量熱法表征酶活拓展實驗

線下實驗內(nèi)容包括：重組蛋白AKTA純化，目標蛋白的SDS-PAGE分析，紫外-可見分光光度法表征酶活，和新增加的ITC法表征酶活。ITC實驗是對原紫外-可見分光光度法的拓展。青霉素G滴定L1酶的ITC熱譜曲線如圖3所示，滴定過程伴隨負熱功率變化(峰型向下)，說明抗生素的酶促水解反應(yīng)是放熱反應(yīng)，隨著底物消耗其濃度降低，水解反應(yīng)所產(chǎn)生的熱量變化也逐步減少，直至反應(yīng)進行到底物水解完全，熱譜曲線回至基線。對熱譜圖峰面積進行積分可得反應(yīng)的表觀焓變(ΔHapp)。在Tris pH = 7.0的緩沖體系中，L1水解青霉素G鈉鹽和頭孢唑林的ΔHapp分別是-26和-25 kcal·mol-1(1 kcal·mol-1= 4.186 kJ·mol-1)，說明兩種抗生素酶促水解過程的焓變相似。采用Origin軟件對ITC熱譜數(shù)據(jù)進行米氏曲線擬合，可得水解青霉素G的動力學參數(shù)kcat= 192 s-1，頭孢唑林kcat= 67 s-1。比較兩種抗生素的動力學數(shù)據(jù)表明L1對青霉素G的催化效率(kcat/KM= 3.5 s-1·μmol-1·L)高于頭孢唑林(kcat/KM=0.3 s-1·μmol-1·L)。該實驗既豐富了原實驗內(nèi)容，加深了學生對于酶促反應(yīng)熱動力學知識的理解，又能引發(fā)學生對量熱法和分光光度法進行比較，提高學生的分析判斷能力和創(chuàng)新思維能力。

圖3 L1酶水解青霉素G反應(yīng)的ITC熱譜曲線(a)及米氏動力學分析(b)；L1酶水解頭孢唑林反應(yīng)的ITC熱譜曲線(c)及米氏動力學分析(d)

2.3 實驗安排及教學反饋

與原有實驗對比(表1)，改進后的實驗在內(nèi)容上新增了線上虛擬仿真實驗和線下等溫滴定微量熱法表征酶活實驗。從課時安排上新舊實驗差別不大，但是新實驗在內(nèi)容上更豐富。實驗教學流程如圖4所示。課前，學生在Moolsnet微信公眾號在線預約實驗，自行安排時間在虛擬仿真實驗平臺進行實驗操作。完成線上虛擬實驗后，學生需要進行在線考試，通過后才能進行線下實驗。課中，在實驗室開展線下實驗，重點實驗旨在鍛煉學生的動手操作能力和分析解決問題的能力，拓展實驗旨在培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維。同時在課中，學生就線上實驗中遇到的疑點、難點與教師進行溝通與討論。課后，學生需在微信平臺提交電子實驗報告。課程簽到、預約、提交、成績評定等均在微信平臺進行，一站式管理實驗教學與考核，既提高了學生的學習效率，也提高了教師的工作效率。

表1 新舊實驗內(nèi)容比較

圖4 混合實驗教學流程

目前該線上線下混合實驗已連續(xù)三年在本科實驗教學中順利開展，共服務(wù)200余名學生。為了進一步加強教學研究，我們對該課程開展了連續(xù)的問卷調(diào)查和反饋活動。課程滿意度調(diào)查了2017級72名和2018級79名學生，結(jié)果顯示86%的學生對“線上線下混合實驗”模式表示非常滿意，10%的學生表示比較滿意，3%的學生表示一般，僅1%的學生表示比較不滿意(圖5)?？傮w教學反饋良好。持支持意見的主要原因包括：(1) 教學形式新穎、趣味性強；(2) 虛擬實驗清晰直觀，場景逼真，體驗感好；(3) 節(jié)省了實驗時間和等待時間；(4) 虛擬實驗更好地展示了實驗細節(jié)及抽象原理；(5) 實驗的連貫性和整體性更好；(6) 可以反復操作實驗；(7) 虛擬實驗打破了空間限制。持反對意見的原因包括：(1) 虛擬實驗節(jié)奏較快，大多是機械操作，學生缺少思考；(2) 有些過程過于簡化；(3) 不適應(yīng)；(4) 實驗結(jié)果千篇一律，不能從數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)問題。一部分受訪同學表示虛擬仿真實驗是一種創(chuàng)新的教學方式和新穎的學習體驗，值得肯定和推廣，但它與實際實驗操作仍然存在差距，若能豐富實驗現(xiàn)象的變化，增設(shè)錯誤選項必將會拉近其與真實實驗的距離。因此，未來團隊將進一步落實虛擬實驗平臺的提升，探索最大化發(fā)揮虛擬仿真軟件對線下實驗的輔助作用，提升實驗教學質(zhì)量。

圖5 學生對本實驗滿意度調(diào)查結(jié)果及反饋意見

3 結(jié)語

本實驗在原有化學生物學綜合實驗“金屬β-內(nèi)酰胺酶L1的表達和動力學表征”基礎(chǔ)上進行創(chuàng)新。一方面引入了仿真虛擬實驗環(huán)節(jié)，不僅有效解決了實驗周期過長的問題，還增加了實驗趣味性和可重復性。集中連貫的實驗教學使知識構(gòu)架更清晰、更完整?！皶r時能學，處處可學”的教學模式使學習、互動和考核不受時空限制，提高了教學效率。另一方面，針對重點實驗環(huán)節(jié)和拓展實驗環(huán)節(jié)進行線下實驗。新引入的等溫滴定微量熱法表征酶活線下實驗，既豐富了原實驗內(nèi)容，也加強了對學生創(chuàng)新思維的培養(yǎng)。線上打基礎(chǔ)，線下做延伸的混合教學模式，兼顧了對學生知識與能力的培養(yǎng)，取得了較好的反饋。尤其在常態(tài)化疫情防控背景下，這種混合模式或可成為一種優(yōu)化實驗課程設(shè)計、提高教學效果的有效方式，也可為相關(guān)院校的實驗教學安排提供參考。