劉儀，牛宏紅，楊賽麗，曹旭東，袁俐

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832000)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)引起的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)的報(bào)告，2020年全球新發(fā)TB患者987萬(wàn)，其中我國(guó)新發(fā)TB病例為84.2萬(wàn)，在30個(gè)TB高負(fù)擔(dān)國(guó)家中排第2位，僅次于印度(259萬(wàn))[1]。而耐藥TB一直是TB臨床診斷和治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。

M.tuberculosis細(xì)胞壁中的脂質(zhì)成分可占細(xì)胞壁干重的60%以上，其中分枝菌酸與M.tuberculosis的存活、致病性、毒力、免疫逃避和生物膜形成密切相關(guān)，在抗TB研究中有著極其重要的地位[3]。M.tuberculosis的脂肪酸合成 (fatty acid synthesis, FAS) 途徑有兩種形式：Ⅰ 型脂肪酸合成 (FAS-Ⅰ)途徑和 Ⅱ 型脂肪酸合成(FAS-Ⅱ)途徑。FAS-Ⅰ是一個(gè)多功能且高效的催化酶，可以完成脂肪酸碳鏈延伸的所有步驟，而FAS-Ⅱ 主要由FabG1 (MabA，Rv1483), HadAB/HadBC (Rv0635-0637)、InhA (Rv1484) 和KasA/KasB (Rv2245/Rv2246)4個(gè)酶組成，他們?cè)谔兼溠由斓倪^(guò)程中發(fā)揮著不同的催化作用，也是抗結(jié)核藥物常見(jiàn)的靶標(biāo)[3]。FabG4(Rv0242c)是FabG1的同源蛋白蛋白之一，在所有分枝桿菌中保守[4]，其功能可能與FabG1相似[4]。FabG4與FabG1的輔酶分別是NADH和NADPH，而NADH相比NADPH是一種低能量分子[4]。FabG4對(duì)在羅辛甘油基本培養(yǎng)基(Roisin’s glycerol minimal media)上的分枝桿菌的存活至關(guān)重要[4]。FabG4在亞抑菌濃度鏈霉素脅迫下表達(dá)增高[4]，也在M.tuberculosis的氣-液界面的生物膜中特異表達(dá)[4]。所以，人們推測(cè)FabG4在營(yíng)養(yǎng)受限或抗生素壓力下會(huì)參與一些與膜代謝相關(guān)的低能耗途徑[4]。同時(shí)，F(xiàn)abG4具有抗原特性[4]，對(duì)MHC-I和MHC-II分子具有高親和力[5]，有望成為分枝桿菌生物膜的特異標(biāo)記物[4]。

生物膜由細(xì)菌及其分泌的細(xì)胞外聚合物組成。生物膜形成可以導(dǎo)致M.tuberculosis表型耐藥[6]，所以深入研究FabG4的作用對(duì)于耐藥TB的診斷和治療具有重要的意義。非致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)是一種常見(jiàn)的能夠替代M.tuberculosis的模式菌[7]。M.tuberculosisRv0242c在M.smegmatis中的直系同源基因是MSMEG_0372，二者具有78.9%的基因同源性。目前尚無(wú)有關(guān)MSMEG_0372基因功能的研究報(bào)道。為了研究該基因的功能，我們構(gòu)建了MSMEG_0372基因敲除、回補(bǔ)及過(guò)表達(dá)M.smegmatis。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

野生型M.smegmatismc2155，大腸桿菌(E.coli) DH5α和HB101，及pMV361，p0004s和phAE159質(zhì)粒均購(gòu)買(mǎi)自上海晶諾生物科技有限公司。引物見(jiàn)表1，表中加粗、斜體并下劃線(xiàn)的序列為限制性?xún)?nèi)切酶Van91I的酶切位點(diǎn)。

表1 引物

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，氯化鈉和甘油購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10和ADC購(gòu)自美國(guó)BD公司，潮霉素B和吐溫80購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，高純度低電滲瓊脂糖購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司，Trans2K Plus II DNA Marker和Trans15K DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ast Digest Van91I、限制性?xún)?nèi)切酶PacI、Fast DigestHind III、Fast DigestEcoRI、T4 DNA連接酶和Phusion High Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，氨芐青霉素鈉和氯霉素購(gòu)自美國(guó)Amresco，硫酸卡那霉素購(gòu)自青島MDBIO，包裝試劑盒購(gòu)自美國(guó)EPICENTRE Biotechnologies，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

按說(shuō)明書(shū)配置7H9液體培養(yǎng)基、7H10平板、LB液體和固體培養(yǎng)基。其中，7H9液體培養(yǎng)基、7H10平板用于M.smegmatis的培養(yǎng)，LB液體和固體培養(yǎng)基用于E.coli的培養(yǎng)。頂層瓊脂(Top Agar)：Middlebrook 7H9 粉末0.47 g、瓊脂粉0.75 g，加雙蒸水補(bǔ)充至100 mL，121 ℃高溫滅菌15 min。MP緩沖液：50 mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1MgSO4、2 mmol·L-1CaCl2，用稀HCl調(diào)至pH 7.5或7.8，用0.22 μm濾菌器除菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器

生物安全柜(BSC-1304ⅡA2)購(gòu)于蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，恒溫培養(yǎng)箱(GSP-70)購(gòu)于天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司，凝膠成像儀(WD-9413B)和電泳儀(DYY-6C)購(gòu)于北京六一生物科技有限公司，電子天平(PL1502E)和酸度計(jì)(FE28)購(gòu)于瑞士梅特勒-托利多公司，PCR 儀(S1000)和電穿孔儀(Gene Pulser MXcell)購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建p0004s-AES質(zhì)粒及鑒定

根據(jù)MSMEG_0372基因及其上下游的DNA序列，設(shè)計(jì)該基因的左臂引物(LFP/LRP)和右臂引物(RFP/RRP)，左、右臂是等位基因同源重組的底物(allele exchange substrates，AES)(圖1)。以M.smegmatis的基因組DNA為模板(2 μL)，分別以L(fǎng)FP/LRP引物對(duì)和RFP/RRP引物對(duì)為引物(F和R各2.5 μL)，加入高保真聚合酶Phusion High Fidelity DNA Polymerase(0.5 μL)，5×Phusion HF Buffer(10 μL)，DMSO(1.5 μL)，10 mmol·L-1dNTP(1 μL)，補(bǔ)充無(wú)核酸酶水制備50 μL反應(yīng)體系。PCR條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。用限制性?xún)?nèi)切酶 Van91I酶切MSMEG_0372基因的左、右臂(AES)并用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。用天根質(zhì)粒提取試劑盒提取p0004s質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶 Van91I對(duì)其酶切并回收其中的兩個(gè)大片段(約3.6k bp和1.6k bp)產(chǎn)物。將左、右臂(AES)及p0004s質(zhì)粒的兩個(gè)大片段用T4 DNA 連接酶連接起來(lái)，構(gòu)建p0004s-AES質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化其到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含75 μg·mL-1潮霉素B的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌，收集菌體，提取p0004s-AES質(zhì)粒并通過(guò)DNA測(cè)序鑒定。

圖1 MSMEG_0372基因敲除菌株引物示意圖

1.2.2 構(gòu)建phAE159-AES噬菌粒

用Omega 質(zhì)粒提取試劑盒提取phAE159質(zhì)粒以及p0004s-AES質(zhì)粒，分別用PacI酶切并回收產(chǎn)物。將回收片段用T4 DNA 連接酶連接起來(lái)，用包裝試劑盒輔助轉(zhuǎn)化到E.coliHB101感受態(tài)細(xì)胞中，并在含75 μg·mL-1潮霉素B的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌，收集菌體，提取phAE159-AES噬菌粒。

1.2.3 制備M.smegmatis感受態(tài)細(xì)胞

挑取新鮮的M.smegmatis單克隆菌落接種于5 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約0.6)。以1∶100的比例將該菌液接種于100 mL 7H9培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6。將菌液冰浴1 h，然后于4 ℃，5 000 r·min-1離心10 min。收集菌體，用預(yù)先冰浴的10%無(wú)菌甘油將菌體洗滌2次，最后用10 mL預(yù)冷的10%的甘油重懸，每管200 μL分裝并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 制備高滴度重組噬菌體

將phAE159-AES噬菌粒與M.smegmatis感受態(tài)細(xì)胞混勻，在BIO-RAD電轉(zhuǎn)儀上用2 mm電轉(zhuǎn)杯電擊轉(zhuǎn)化(電擊參數(shù)：電壓2.5 kV，電阻1 000 Ω，電容25 μF)。加入7H9培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將此液體與頂層瓊脂混勻并在7H10平板上鋪板，30 ℃培養(yǎng)3 d，篩選噬菌體空斑。挑取平板上含有噬菌體的空斑到MP buffer中，4 ℃孵育過(guò)夜。將此含有噬菌體的液體與適量新鮮培養(yǎng)的M.smegmatismc2155混合，然后與適量頂層瓊脂混勻，鋪板，30 ℃培養(yǎng)3 d。將MP buffer加到含有噬菌體空斑的平板上，置于4 ℃過(guò)夜。用注射器收集平板上的液體，并用0.22 μm無(wú)菌濾菌器過(guò)濾除菌，獲取高滴度的噬菌體，放4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5MSMEG_0372基因敲除菌株的構(gòu)建及鑒定

將高滴度的噬菌體與預(yù)先用MP buffer洗滌的對(duì)數(shù)期野生型M.smegmatis混勻，37 ℃孵育過(guò)夜。離心棄上清，補(bǔ)加適量7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃孵育過(guò)夜。離心后收集細(xì)菌，并在含75 μg·mL-1潮霉素B的7H10平板上37 ℃培養(yǎng)3 d，篩選陽(yáng)性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體，提取細(xì)菌基因組DNA并用PCR鑒定。MSMEG_0372基因敲除菌株的驗(yàn)證引物見(jiàn)圖1，左臂驗(yàn)證引物對(duì)的正向引物(LYZFP)位于在LFP引物匹配序列的上游，反向引物(LYZRP)位于sacB基因上；右臂驗(yàn)證引物對(duì)的正向引物(RYZFP)位于hyg基因上，反向引物(RYZRP)位于RRP引物匹配序列的下游。

1.2.6 構(gòu)建pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒及鑒定

以M.smegmatis的基因組DNA為模板(2 μL)，以MSMEG_0372FP/MSMEG_0372RP為引物(F和R各0.5 μL)，加入2×Taq Master mix(10 μL)，補(bǔ)充無(wú)核酸酶水制備20 μL反應(yīng)體系。PCR條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 105 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，回收MSMEG_0372基因片段。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和Hind III酶切MSMEG_0372基因片段和pMV361質(zhì)粒，再用T4 DNA 連接酶連接起來(lái)，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體，提取質(zhì)粒并通過(guò)DNA測(cè)序鑒定。MSMEG_0372基因片段被插入到pMV361 載體的多克隆位點(diǎn)上，pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒的驗(yàn)證引物(JDFP/JDRP)位于該位點(diǎn)的上下游 100～200 bp處。

1.2.7MSMEG_0372基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定

制備MSMEG_0372基因敲除菌株感受態(tài)細(xì)胞(同野生型M.smegmatis感受態(tài)細(xì)胞的制備)。取適量pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到MSMEG_0372基因敲除菌株感受態(tài)細(xì)胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素和75 μg·mL-1潮霉素B的7H10平板篩選陽(yáng)性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體并煮沸裂解。以裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.8MSMEG_0372基因過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建與鑒定

取適量pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到野生型M.smegmatis感受態(tài)細(xì)胞中，并在含25 μg·mL-1卡那霉素的 7H10平板上篩選陽(yáng)性菌落。挑取單克隆菌落，搖菌，收集菌體并煮沸裂解。以裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建p0004s-AES質(zhì)粒

MSMEG_0372基因左、右臂擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示：左臂約為764 bp和右臂約為709 bp，與預(yù)期DNA片段大小一致(圖2)。因?yàn)閜0004s質(zhì)粒含有4個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶 Van91I酶切位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生了4個(gè)片段，回收其中的3.6 kbp和1.6 kbp片段。連接左、右臂(AES)以及p0004s質(zhì)粒的兩個(gè)大片段，構(gòu)建的p0004s-AES質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序顯示：結(jié)果與預(yù)期一致，無(wú)突變。

Lane 1：左臂; Lane 2：右臂；Lane M：DNA marker。圖2 MSMEG_0372基因的左臂和右臂(AES)

2.2 M. smegmatis MSMEG_0372基因敲除菌株構(gòu)建與鑒定

連接p0004s-AES和phAE159質(zhì)粒酶切產(chǎn)物構(gòu)建了phAE159-AES噬菌粒。將此噬菌粒轉(zhuǎn)化到M.smegmatis感受態(tài)細(xì)胞中，篩選得到噬菌體空斑(含重組噬菌體)。用重組噬菌體侵染野生型M.smegmatis，得到高滴度的重組噬菌體。將高滴度的噬菌體與野生型M.smegmatis混合孵育，在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，其自身DNA(phAE159-AES)與野生型M.smegmatis基因組DNA在AES處發(fā)生等位基因同源重組，完成MSMEG_0372基因的敲除。

2.2.1 “兩片段法”P(pán)CR鑒定MSMEG_0372基因敲除菌株

“兩片段法”P(pán)CR：分別使用左臂驗(yàn)證引物對(duì)(LYZFP/LYZRP)和右臂驗(yàn)證引物對(duì)(RYZFP/RYZRP)進(jìn)行PCR。當(dāng)以MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA為模板時(shí)，能夠擴(kuò)增出約1 187 bp和1 128 bp大小的DNA片段，而當(dāng)以野生型M.smegmatis基因組DNA為模板時(shí)則沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果符合預(yù)期(圖3)。

Lane 1：引物為L(zhǎng)YZFP/LYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane 2：引物為L(zhǎng)YZFP/LYZRP，模板為MSMEG_0372 基因敲除菌株基因組DNA；Lane3: 引物為RYZFP/RYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane 4：引物為RYZFP/RYZRP，模板為MSMEG_0372 基因敲除菌株基因組DNA；Lane M：DNA Marker。圖3 “兩片段法”P(pán)CR 鑒定 MSMEG_0372 基因敲除菌株

2.2.2 “全長(zhǎng)法”P(pán)CR鑒定MSMEG_0372基因敲除菌株

“全長(zhǎng)法”P(pán)CR：組合使用左臂驗(yàn)證正向引物和右臂驗(yàn)證反向引物(LYZFP/RYZRP)進(jìn)行PCR。當(dāng)以MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA為模板時(shí)，能夠擴(kuò)增出約5 616 bp大小的DNA片段，而當(dāng)以野生型M.smegmatis基因組DNA為模板時(shí)，能夠擴(kuò)增得到約2 772 bp大小的DNA片段。結(jié)果符合預(yù)期(圖4)。兩種PCR的鑒定結(jié)果表明：MSMEG_0372基因敲除菌株 (mc2155 ΔMSMEG_0372) 構(gòu)建成功。

Lane 1：引物為L(zhǎng)YZFP/RYZRP，模板為野生型M. smegmatis基因組DNA；Lane2-3：引物為L(zhǎng)YZFP/RYZRP，模板為MSMEG_0372基因敲除菌株基因組DNA；Lane M：DNA Marker。圖4 “全長(zhǎng)法”P(pán)CR 鑒定 MSMEG_0372 基因敲除菌株

2.3 MSMEG_0372基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

將pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒導(dǎo)入MSMEG_0372基因敲除菌株，得到MSMEG_0372基因回補(bǔ)菌株的陽(yáng)性菌落。以細(xì)菌裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進(jìn)行PCR，電泳結(jié)果顯示：片段大小約1 651 bp，符合預(yù)期，MSMEG_0372基因回補(bǔ)菌株(mc2155 ΔMSMEG_0372:pMV361-MSMEG_0372)構(gòu)建成功(圖5)。

Lane1：引物為JDFP/JDRP，模板為野生型M. smegmatis裂解液；Lane 2-4：引物為JDFP/JDRP，模板為MSMEG_0372 基因回補(bǔ)菌株裂解液；Lane M：DNA Marker。圖5 PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因回補(bǔ)表達(dá)菌株

2.4 M. smegmatis MSMEG_0372基因過(guò)表達(dá)菌株的鑒定結(jié)果

M.smegmatisMSMEG_0372基因過(guò)表達(dá)菌株的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。

Lane 1：引物為JDFP/JDRP，模板為野生型M. smegmatis裂解液；Lane 2-3：引物為JDFP/JDRP，模板為MSMEG_0372 基因過(guò)表達(dá)菌株裂解液；Lane M：DNA Marker圖6 PCR 鑒定 MSMEG_0372 基因過(guò)表達(dá)菌株

將pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒導(dǎo)入野生型M.smegmatis，得到MSMEG_0372基因過(guò)表達(dá)菌株的陽(yáng)性菌落。以細(xì)菌裂解液為模板，以JDFP/JDRP為引物進(jìn)行PCR，電泳結(jié)果顯示：片段大小約1 651 bp，符合預(yù)期，MSMEG_0372基因過(guò)表達(dá)菌株(mc2155:pMV361-MSMEG_0372)構(gòu)建成功(圖6)。

3 討論

近年來(lái)，耐藥TB已經(jīng)成為T(mén)B防控領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)[8]。隨著M.tuberculosis基因組測(cè)序的完成，人們開(kāi)始更深入地研究基因的功能[9]，從而篩選靶點(diǎn)蛋白并研發(fā)抗結(jié)核新藥[10]。通過(guò)構(gòu)建基因敲除、回補(bǔ)與過(guò)表達(dá)菌株，比較分析菌株間的差異，我們可以精確地研究目的基因的功能。M.smegmatis是一種從梅毒患者的硬下疳中分離得到的腐生菌，生長(zhǎng)迅速且為非致病菌，在生物安全一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(Biosafety Level 1，BSL-1)的實(shí)驗(yàn)室即可操作。同時(shí)，M.smegmatis與M.tuberculosis細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似，同源性高，是一種理想的M.tuberculosis模式菌[11]。

與其他細(xì)菌相比，分枝桿菌細(xì)胞壁厚，脂質(zhì)含量高，生長(zhǎng)緩慢，且基因組同源重組率低，這使得分枝桿菌基因敲除菌株的構(gòu)建仍然是細(xì)菌遺傳操作中的一大難點(diǎn)[12]。目前，M.tuberculosis基因敲除的方法主要有：基于噬菌體的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)法、線(xiàn)性DNA片段法、反選擇標(biāo)記法、成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)法以及 Bxb1整合酶靶向寡核苷酸介導(dǎo)的基因重組(oligonucleotide-mediated recombineering followed by Bxb1 integrase targeting, ORBIT)[13]。特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)法轉(zhuǎn)化率和敲除效率都很高。線(xiàn)性DNA片段基因敲除法提高了重組率，但錯(cuò)配率升高[13]。反選擇標(biāo)記基因敲除法依賴(lài)于特定基因，失活率高[13]。CRISPR/Cas是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的重要成分[14]，能夠精確識(shí)別及剪切特異性DNA序列[15]。CRISPR基因敲除法操作簡(jiǎn)單，突變率高，特別適于探索功能未知的基因[13]。ORBIT法則結(jié)合了Che9-RecT和 Bxb1噬菌體整合酶系統(tǒng)，可以同時(shí)創(chuàng)建缺失、插入或融合的文庫(kù)，應(yīng)用前景廣闊[13]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用特異性噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法構(gòu)建了MSMEG_0372基因敲除菌株。我們構(gòu)建了由分枝桿菌噬菌體DNA(phAE159)和MSMEG_0372基因的左右臂(含hyg基因盒)組成的噬菌?！猵hAE159-AES。這種噬菌粒在分枝桿菌中以噬菌體的方式進(jìn)行復(fù)制，而在E.coli中則以質(zhì)粒的方式進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)其在分枝桿菌和E.coli進(jìn)行穿梭時(shí)可以促進(jìn)其攜帶的DNA發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。phAE159是一種溫敏型噬菌體，在30 ℃ 裂解生長(zhǎng)，在37 ℃ 溶原生長(zhǎng)[16]。所以，在30 ℃ 培養(yǎng)phAE159-AES重組噬菌體時(shí)，其可以在M.smegmatis中擴(kuò)增釋放，而在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，其可以將重組噬菌體的DNA(噬菌粒phAE159-AES)整合到M.smegmatis基因組DNA中，噬菌粒的AES (MSMEG_0372基因左、右 臂)與野生型M.smegmatis基因組DNA中的等位基因發(fā)生同源重組，位于AES中間的MSMEG_0372基因也被重組噬菌粒上含hyg基因盒的DNA片段所替換，從而完成基因敲除。經(jīng)過(guò)潮霉素B抗性平板的篩選，得到MSMEG_0372基因敲除菌株的陽(yáng)性菌落。通過(guò)上、下游驗(yàn)證引物對(duì)的不同組合，我們用“兩片段法”和“全長(zhǎng)法”P(pán)CR，更加全面、準(zhǔn)確地鑒定了該菌株。與另一常用噬菌體phAE87相比，phAE159容量更大，克隆能力更強(qiáng)，DNA的傳遞效率也更高[17]。同時(shí)，由于本實(shí)驗(yàn)主要在E.coli和快速生長(zhǎng)分枝桿菌M.smegmatis中進(jìn)行，所以本實(shí)驗(yàn)還具有周期短的特點(diǎn)。特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)法廣泛適用于各種分枝桿菌[13]，其不足之處在于噬菌粒的構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將pMV361-MSMEG_0372質(zhì)粒分別導(dǎo)入MSMEG_0372基因敲除菌株和野生型M.smegmatis，構(gòu)建了MSMEG_0372基因回補(bǔ)和過(guò)表達(dá)菌株。pMV361是一種含有M.tuberculosis熱休克蛋白60(hsp60)基因啟動(dòng)子的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭整合質(zhì)粒，可以促進(jìn)插入基因的表達(dá)。基因敲除可以反向驗(yàn)證MSMEG_0372基因的功能，基因過(guò)表達(dá)可以正向驗(yàn)證該基因功能，而基因回補(bǔ)在理論上可以回復(fù)基因敲除的改變?？傊琈SMEG_0372基因敲除、回補(bǔ)與過(guò)表達(dá)菌株的成功構(gòu)建，為研究該基因在M.smegmatis中的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。未來(lái)可以進(jìn)一步研究FabG4在分枝桿菌 Ⅱ 型脂肪酸合成(FAS-Ⅱ)途徑中的作用、參與生物膜形成的機(jī)制，評(píng)價(jià)其作為分枝桿菌生物膜標(biāo)記物的可行性和抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)的價(jià)值，這對(duì) TB 的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。