張 明，馬雅楠(綜述)，劉德敏，甄嚴(yán)杰(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)一科，河北 石家莊 050000)

鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(calcific aortic valve disease，CAVD)是繼冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓之后最常見的一種心血管疾病。隨著主動(dòng)脈瓣葉纖維鈣化進(jìn)行性加重，引起瓣葉變形、開閉功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致左心室流出道狹窄和血流動(dòng)力學(xué)紊亂，最終引起暈厥、心肌梗死、心力衰竭等心血管事件的發(fā)生。主動(dòng)脈瓣主要由瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞(valve endothelial cells，VECs)和瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(valve interstitial cells，VICs)組成。近年來(lái)，隨著影像學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，以往關(guān)于認(rèn)為“CAVD是一種鈣鹽沉積的被動(dòng)的退行性改變”的觀點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)化為“CAVD是一種涉及內(nèi)皮損傷、慢性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、細(xì)胞表型分化及細(xì)胞凋亡等復(fù)雜病理變化的主動(dòng)炎癥過(guò)程”[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CAVD的患病率隨年齡的增長(zhǎng)而增加，并且在65歲以上人群中的患病率高達(dá)13%[2]。然而，目前臨床上對(duì)于CAVD的治療僅以手術(shù)治療為主，并且費(fèi)用昂貴。當(dāng)前階段尚無(wú)阻止其進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)鈣化的藥物干預(yù)方法。因此，探究CAVD的發(fā)病機(jī)制、從病因?qū)W上根治CAVD已成為目前學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。非編碼RNA在過(guò)去一直是一個(gè)未被探索的領(lǐng)域，最近已經(jīng)成為一個(gè)新興的治療靶點(diǎn)。隨著深度測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，在過(guò)去的二十年里，出現(xiàn)了幾種新的非編碼RNA分子。具有基因調(diào)控功能的非編碼RNA包括microRNAs(miRNAs)、長(zhǎng)非編碼RNAs(LncRNAs)、環(huán)狀RNAs(CircRNAs)、piRNAs、snoRNAs和snRNAs。miRNAs是目前研究最多的非編碼RNA分子之一，它主要通過(guò)與靶基因的3，端非編碼區(qū)結(jié)合來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。以200多個(gè)核苷酸為特征的lncRNAs通過(guò)miRNAs直接與蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)改變其功能，或作為招募轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子的骨架發(fā)揮其基因調(diào)控功能[3]。近年來(lái)，大量證據(jù)表明，非編碼RNA在主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)生和預(yù)后中起著重要作用。因此，本文總結(jié)了目前對(duì)非編碼RNA在主動(dòng)脈瓣鈣化中作用的認(rèn)識(shí)，希望對(duì)該領(lǐng)域的研究策略起到一定的指導(dǎo)作用，并可能為研究人員和臨床醫(yī)生提供更為廣泛的主動(dòng)脈瓣鈣化相關(guān)的生物標(biāo)記物。

1 參與主動(dòng)脈瓣鈣化的miRNAs

在退化過(guò)程中，主動(dòng)脈瓣葉變厚和鈣化，導(dǎo)致瓣膜僵硬，運(yùn)動(dòng)功能受限。鈣化性主動(dòng)脈瓣病是世界上最常見的心臟瓣膜病(valvular heart disease，VHD)之一，2017年死亡人數(shù)超過(guò)10萬(wàn)人[4]。一些蛋白編碼基因，如Wnt/β-catenin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、轉(zhuǎn)錄因子9(transcription factor 9，SOX9)、Msh同源框2(Msh homeobox 2，MSX2)、磷酸酶、Gla蛋白、蛋白多糖、骨橋蛋白和骨唾液蛋白已被證明在主動(dòng)脈瓣鈣化病中參與鈣化的調(diào)節(jié)[5]。此外，最近正在進(jìn)行中的幾項(xiàng)研究探索了miRNAs和其他非編碼RNA在主動(dòng)脈瓣鈣化中的作用。

1.1miR-204與主動(dòng)脈瓣鈣化 VICs向成骨樣細(xì)胞分化是瓣膜鈣化的標(biāo)志。最近的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-204是主動(dòng)脈瓣鈣化的主要調(diào)節(jié)因子[6-8]。鈣化的人主動(dòng)脈瓣組織中miR-204的表達(dá)低于對(duì)照組[6-7,9]。此外，鈣化誘導(dǎo)劑，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(bone morphogenetic protein 1，BMP1)和BMP2，已被證明可以抑制VICs中miR-204的表達(dá)[6,9]。與miR-204相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-BMP1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2處理的鈣化瓣膜和VICs中miR-486表達(dá)上調(diào)[7,9]。抑制miR-204可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-BMP1和BMP2誘導(dǎo)的VICs向成骨細(xì)胞分化，而其過(guò)表達(dá)則相反[6,9]。miR-204阻斷了VICs中堿性磷酸酶的活性和骨鈣素的表達(dá)。在小鼠體內(nèi)miR-204及其同系物miR-211的缺失導(dǎo)致瓣膜心內(nèi)膜病[由于機(jī)械完整性缺陷引起的瓣膜非炎性進(jìn)行性(黏液瘤)變性][10]，揭示了其在維持瓣膜正常功能方面不可或缺的作用。所有這些研究都顯示miR-204在成骨過(guò)程中起關(guān)鍵作用，然而目前仍缺乏主動(dòng)脈瓣鈣化動(dòng)物模型的研究。體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-204能否逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈鈣化，改善瓣膜功能，值得進(jìn)一步研究。除了瓣膜鈣化，miR-204還被發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)血管鈣化，表明它是鈣化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和一個(gè)可能的新治療靶分子。

1.2miR-214與主動(dòng)脈瓣鈣化 瓣膜鈣化是不同細(xì)胞相互作用的結(jié)果，包括炎癥細(xì)胞、瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞和VICs[11]。業(yè)已證實(shí)，miR-214通過(guò)調(diào)節(jié)這些不同的細(xì)胞促進(jìn)瓣膜鈣化[8,12-14]。在瓣膜鈣化開始的階段，剪切-壓力激活內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致黏附分子激活，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在瓣膜中聚集，進(jìn)而激活VICs啟動(dòng)鈣化[11]。在人主動(dòng)脈鈣化瓣膜和暴露于振蕩刺激下的豬瓣膜中均發(fā)現(xiàn)miR-214表達(dá)增高[15-18]。Li等[12]發(fā)現(xiàn)增加的miR-214來(lái)自于病變瓣膜中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞釋放的微泡，這些微泡被VICs攝取。巨噬細(xì)胞釋放的微泡增強(qiáng)了VICs的鈣化過(guò)程，這表明浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞參與了VICs的成骨激活。在VICs中miR-214表達(dá)的增加激活了瓣膜鈣化，增加了炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步證實(shí)了miR-214的促成骨作用。然而，Salim等[15]認(rèn)為miR-214在豬主動(dòng)脈瓣膜中具有抗成骨作用。豬主動(dòng)脈瓣膜在循環(huán)拉伸的條件下1周，miR-214的表達(dá)下調(diào)。此外，在靜態(tài)條件下，miR-214的表達(dá)增加減少了豬主動(dòng)脈瓣膜中的鈣化，而在循環(huán)拉伸條件下沒有觀察到明顯的變化。同樣，在另一項(xiàng)研究中，miR-214的抑制對(duì)振蕩應(yīng)激誘導(dǎo)的豬主動(dòng)脈瓣鈣化沒有影響。在這些不同的研究中，miR-214作用的存在上述差異可能是由于體外和體內(nèi)的模型不同[14]。因此，需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來(lái)闡明miR-214的促/抗成骨作用。

1.3miR-195與主動(dòng)脈瓣鈣化 Von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)是一種多聚體血漿蛋白，通常參與血液穩(wěn)態(tài)，由內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞分泌[16]。在主動(dòng)脈狹窄瓣膜中，尤其是鈣化區(qū)域周圍的巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞內(nèi)，vWF的表達(dá)水平顯著升高。vWF基因在止血和血栓形成中激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinasem,p38-MAPK)信號(hào)通路，從而促進(jìn)VICs成骨分化和鈣化的形成。此外，基因芯片分析表明vWF是miR195的潛在靶基因。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，修復(fù)miR-195可能減緩主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)生和發(fā)展。由于上調(diào)miR-195可能通過(guò)抑制vWF和激活p38-MAPK信號(hào)通路，降低ALP活性和鈣化沉積，降低Runx2、OCN和ALP的mRNA和蛋白水平，從而改善體外培養(yǎng)的主動(dòng)脈瓣鈣化。因此，miR-195提供了一種治療CAVD患者主動(dòng)脈瓣鈣化的新方法。

1.4miR-34a與主動(dòng)脈瓣鈣化 Toshima等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-34a在鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄(calcific aortic valve stenosis，CAVS)的人體標(biāo)本中的表達(dá)增加。MIR-34a通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1-Runx2信號(hào)通路，上調(diào)Runx2的表達(dá)促進(jìn)成骨分化，另外作者在體外實(shí)驗(yàn)中，利用豬主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步證明了上述結(jié)論。因此，抑制MIR-34a表達(dá)是CAVS的潛在治療靶點(diǎn)。

1.5miR-30b與主動(dòng)脈瓣鈣化 端粒細(xì)胞(telocytes，TCS)是一種新型的間質(zhì)細(xì)胞，在人類心臟中，TCS廣泛存在于心外膜、心肌間質(zhì)和主動(dòng)脈瓣中，它們有助于調(diào)節(jié)心臟的穩(wěn)態(tài)和再生[19]。TCS通過(guò)釋放細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)或非典型連接形成心臟網(wǎng)絡(luò)，在正?；蚣膊⌒呐K中參與長(zhǎng)距離的細(xì)胞間信號(hào)協(xié)調(diào)。在Yang等[20]的研究中，提取并鑒定了TC-EVS，并建立了CAVD小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠鈣化瓣膜中Runx2、骨鈣素和caspase-3的表達(dá)明顯高于EV治療組小鼠，表明TC-EVS治療可減少主動(dòng)脈瓣鈣化，減輕VICs細(xì)胞凋亡。并且，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，TC-EVS可被VICS吸收，經(jīng)EV處理后，鈣化瓣膜組織中miR-30b的表達(dá)顯著增加。因此表明，在主動(dòng)脈瓣鈣化過(guò)程中，細(xì)胞外小泡是miR-30b的通訊媒介，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TC-EVs通過(guò)miR-30b/Runx2/Wnt/β-catenin軸在主動(dòng)脈瓣鈣化中起保護(hù)作用。

1.6miR-29b與主動(dòng)脈瓣鈣化 miR-29b是人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞鈣化的內(nèi)源性正性調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-29b的表達(dá)顯著增加，進(jìn)而引起TGF-β3的表達(dá)顯著下調(diào)，而Smad3，Runx2，wnt3和β-catenin則顯著上調(diào)。因此，抑制CAVD大鼠中miR-29b的表達(dá)可以達(dá)到防止血管和瓣膜鈣化的作用。由此表明，miR-29b通過(guò)激活wnt3/β-catenin/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)抑制TGF-β3，從而促進(jìn)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)鈣化[21]。

1.7miR-139-5p與主動(dòng)脈瓣鈣化 Zhang等[22]的研究顯示，miR-139-5p的表達(dá)水平與成骨基因RUNX2呈負(fù)相關(guān)，并且miR-139-5p在原代培養(yǎng)的人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞成骨分化過(guò)程中也下調(diào)。隨后的功能研究表明，miR-139-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)負(fù)性調(diào)控促成骨基因FZD4(編碼Frizzled4受體亞型)和CTNNB1(編碼β-catenin基因)的表達(dá)，F(xiàn)ZD4和CTNNB1驅(qū)動(dòng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路表達(dá)[23]，從而抑制VIC的成骨分化。以上結(jié)果提示，miR-139-5p通過(guò)Wnt/β-catenin途徑在血管內(nèi)皮細(xì)胞成骨分化中起重要作用。

2 鈣化性主動(dòng)脈瓣病患者循環(huán)中的miRNAs

細(xì)胞外間隙中miRNAs的存在表明它可能是一種用于診斷和預(yù)后的非侵入性生物標(biāo)志物。R?sj?等[24]測(cè)量了57例主動(dòng)脈狹窄患者和10名對(duì)照組受試者的循環(huán)血清miR-210水平。結(jié)果顯示主動(dòng)脈狹窄組的miR-210水平顯著高于對(duì)照組；然而，在區(qū)分主動(dòng)脈狹窄與健康受試者方面，miR-210水平顯示出了與NT-proBNP相似的診斷能力。miR-210預(yù)測(cè)全因病死率的準(zhǔn)確性與NT-proBNP相似[24]。因此，循環(huán)miR-210在主動(dòng)脈狹窄患者中水平升高沒有太大的診斷價(jià)值，因?yàn)樗鼪]有表現(xiàn)出比現(xiàn)有的生物標(biāo)志物如NT-proBNP的優(yōu)勢(shì)。然而，NT-proBNP和miR-210聯(lián)合診斷和判斷預(yù)后的價(jià)值如何，需要未來(lái)的研究去探索。經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)是行外科手術(shù)高?；颊哌M(jìn)行瓣膜置換的良好選擇，但目前尚無(wú)生物標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)它的長(zhǎng)期臨床療效。Kleeberger等[25]報(bào)道術(shù)前miR-206水平與經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)后3個(gè)月隨訪的射血分?jǐn)?shù)直接相關(guān)。此外，在術(shù)后1 d的miR-206水平與左心室射血分?jǐn)?shù)呈顯著的負(fù)相關(guān)。因此，循環(huán)中的miR-206水平可能可以預(yù)測(cè)經(jīng)導(dǎo)管主動(dòng)脈瓣膜置換術(shù)的預(yù)后，但這需要后續(xù)更進(jìn)一步的隊(duì)列研究來(lái)證實(shí)。

3 LncRNAs在主動(dòng)脈瓣鈣化中的作用

LncRNAs是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。越來(lái)越多的證據(jù)表明，LncRNAs在各種病理和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Hadji等[9]對(duì)鈣化的和健康的主動(dòng)脈瓣進(jìn)行RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在鈣化的主動(dòng)脈瓣中LncRNAs H19的表達(dá)上調(diào)。在更大的臨床隊(duì)列研究中證實(shí)，H19在鈣化的主動(dòng)脈瓣中增加了7.5倍。值得注意的是，H19在硬化和增厚的瓣膜中也被發(fā)現(xiàn)增加了3.3倍，這些瓣膜處于疾病的早期[9]。此外，在主動(dòng)脈狹窄進(jìn)展較快的患者中發(fā)現(xiàn)有較高的H19表達(dá)[9]。H19的這種增加是由于其啟動(dòng)子的CpG甲基化減少。從功能上講，人VICs中H19的沉默抑制了成骨基因骨鈣素、BMP2和RUNX2的表達(dá)，并減少了鈣沉積，表明H19是一種促成骨因子。因此，H19在瓣膜鈣化過(guò)程中是漸進(jìn)性增加的，它在人主動(dòng)脈瓣鈣化過(guò)程中起著一定的作用。最近Vander Roest等[26]報(bào)道，在衰老過(guò)程中，小鼠主動(dòng)脈瓣的H19水平?jīng)]有增加。在退行性主動(dòng)脈瓣鈣化患者和VICs成骨誘導(dǎo)后，LncRNAs AFAP1-AS1的表達(dá)均增加。此外，AFAP1-AS1不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155/Smad5軸促進(jìn)人主動(dòng)脈瓣間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[27]，還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，并通過(guò)巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子(如腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6)促進(jìn)VIC成骨分化和瓣膜鈣化[28]。另外有研究表明，成骨誘導(dǎo)后在人主動(dòng)脈VICs中觀察到LncRNAs OIP5-AS1表達(dá)下調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)則證實(shí)OIP5-AS1同樣能抑制成骨分化[29]。

4 CircRNAs在主動(dòng)脈瓣鈣化中的作用

環(huán)狀RNA(CircRNAs)是由內(nèi)源RNA拼接的真核生物，由于CircRNAs呈環(huán)狀，在體液中高度穩(wěn)定、保守和豐富，使其成為未來(lái)診斷生物標(biāo)志物的理想候選者[30]。最近的報(bào)道顯示，某些類型的CircRNA參與許多細(xì)胞生理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的成骨分化[30]。作為表觀遺傳學(xué)的重要調(diào)控機(jī)制，大規(guī)模的Cerna串?dāng)_CircRNAs-miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)已被廣泛認(rèn)可。并且，越來(lái)越多的證據(jù)表明一些CircRNA與miRNAs相互作用以發(fā)揮其成骨作用[30-31]。CircRNAs作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNAs(CeRNAs)，在細(xì)胞分化過(guò)程中調(diào)節(jié)miRNAs對(duì)其靶基因的影響[31]。Yin等[32]發(fā)現(xiàn)CircRUNX2可以海綿miR-203并增強(qiáng)RUNX2的表達(dá)，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)，表現(xiàn)為RUNX2、OPN等成骨分化相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。越來(lái)越多證據(jù)表明，circRNA轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(transforming growth factor beta receptors II，TGFBR2)在不同的生理或病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[33-34]。不僅如此，CircRNAs在主動(dòng)脈瓣鈣化的發(fā)展中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。在Yu等[33]的實(shí)驗(yàn)表明，TGFBR2通過(guò)抑制miR-25-3p的表達(dá)，促進(jìn)Twist1的表達(dá)，TWIST1是骨組織形成的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，在心臟和瓣膜心臟的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[34]。Twist1高表達(dá)可以通過(guò)抑制ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)形成以及RUNX2和OPN的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈VIC的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[35]。TGFBR2通過(guò)吸收miRNA-25-3p調(diào)節(jié)Twist1的表達(dá)而抑制人主動(dòng)脈VIC的成骨細(xì)胞分化。以上結(jié)果表明TGFBR2可能成為治療鈣化主動(dòng)脈瓣病的新的理論基礎(chǔ)。另有研究表明，Wang等[36]表明，褪黑激素通過(guò)調(diào)節(jié)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞中的環(huán)狀RNA CircRIC3/miR-204-5p/DPP4信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)改善主動(dòng)脈瓣鈣化。但是，單個(gè)CircRNA可以通過(guò)在細(xì)胞質(zhì)中聚集多個(gè)miRNAs來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，CircRIC3是否會(huì)吞噬其他參與主動(dòng)脈瓣鈣化的miRNAs仍有待研究。

5 小 結(jié)

既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干非編碼RNA分子在主動(dòng)脈瓣鈣化生物學(xué)中均發(fā)揮關(guān)鍵作用；然而，到目前為止大多數(shù)研究都是初步的，因此有必要進(jìn)行深入的研究，以更好地闡明它們的作用，并將其開發(fā)為治療和診斷試劑。例如，miRNAs中的miR-210和miR-206在主動(dòng)脈瓣鈣化中顯示出較高的診斷和預(yù)后價(jià)值，但這些研究是在較少的患者中進(jìn)行的，尚需要進(jìn)一步進(jìn)行較大規(guī)模的多中心試驗(yàn)。其他非編碼RNA，如LncRNAs、CircRNAs，在瓣膜生物學(xué)方面的研究要少得多。因此，目前需要更多的探索來(lái)發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA分子，這些分子可能對(duì)主動(dòng)脈瓣鈣化的治療和診斷有深遠(yuǎn)的意義。