蘇麗霞，戰(zhàn)景明，古曉娜，薛向明，武寶利

(中國輻射防護研究院，山西 太原，030006)

0 引言

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一種重要形式，在生物學(xué)中起重要作用，表觀遺傳即不改變DNA序列但基因表達水平發(fā)生變化，并且這種變化在發(fā)育和細胞增殖過程中可以穩(wěn)定傳遞[1]。

電離輻射是DNA損傷誘導(dǎo)劑，作用于機體后產(chǎn)生大量電子，這些電子可使分子或原子電離或激發(fā)，破壞其重要的化學(xué)鍵，發(fā)生不可逆變化，最終導(dǎo)致DNA單鏈或雙鏈斷裂及堿基損傷等生物效應(yīng)，使細胞功能受損，影響轉(zhuǎn)錄、翻譯、DNA復(fù)制以及有絲分裂等過程[2]。電離輻射還是表觀遺傳毒性劑，可誘導(dǎo)表觀遺傳及其調(diào)控的改變，尤其是改變DNA甲基化的模式[3]。研究發(fā)現(xiàn)電離輻射可誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化，特定基因啟動子區(qū)DNA高甲基化和重復(fù)序列DNA甲基化水平的改變等。

DNA甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，在許多癌變過程的早期就可以檢測到DNA甲基化的改變。腫瘤細胞中全基因組DNA甲基化水平低于正常細胞，啟動子區(qū)域DNA甲基化水平高于正常細胞，因此腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細胞癌變與DNA異常甲基化密切相關(guān)[4]。隨著核能及放射診療應(yīng)用越來越廣，接觸輻射的人員也隨之增多，對人類的潛在健康危害也在不斷增加，DNA甲基化的作用及影響成為放射生物學(xué)、輻射防護學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。因此研究DNA甲基化模式的改變，將其作為基因組不穩(wěn)定性診斷和細胞早期惡變的生物標志物具有重要意義。

本文介紹了DNA甲基化以及電離輻射誘導(dǎo)全基因組DNA、特定基因啟動子區(qū)DNA甲基化和重復(fù)序列DNA甲基化水平的改變，探討了電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化模式改變的可能機制，介紹了DNA甲基化在輻射防護領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 DNA 甲基化

1.1 DNA甲基化的概念

DNA甲基化通常發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的DNA修飾序列。DNA甲基化主要是由一系列甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)來完成[5]。目前，已經(jīng)鑒定出DNMT家族的5個成員，其中DNMT1(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1)、DNMT3A(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 alpha)和DNMT3B(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 beta)在哺乳動物細胞中具有功能活性[6]。DNMT1的功能主要是DNA復(fù)制過程中甲基化的維持，在模板鏈的指導(dǎo)下，將母鏈DNA甲基化模式傳遞給子鏈；而 DNMT3A 和 DNMT3B 主要負責未甲基化位點的甲基化反應(yīng)發(fā)生，在胚胎發(fā)生和生殖細胞發(fā)育過程中在兩條DNA鏈上產(chǎn)生新的甲基化模式，DNMT3A和DNMT3B 靶向不同的甲基化位點，具體取決于細胞類型和發(fā)育階段[7]。

1.2 DNA甲基化功能

在哺乳動物中，DNA甲基化基本位于胞嘧啶和鳥嘌呤堿基序列(CpG)的胞嘧啶殘基中，CpG位點分布不均勻，且基本集中在富含CpG位點的CpG島上，CpG島主要位于基因的啟動子和外顯子區(qū)域。真核細胞基因組DNA約70%的CpG位點能夠發(fā)生甲基化，位于CpG島的CpG位點在正常的細胞中通常是未甲基化的[8]。但啟動子區(qū)域CpG位點甲基化狀態(tài)改變可引起某些基因異常轉(zhuǎn)錄，使其表達情況發(fā)生變化，進而導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生發(fā)展。

DNA 甲基化與生命活動環(huán)節(jié)密切相關(guān)，DNA甲基化與其他表觀遺傳改變相互作用，在調(diào)控基因表達、發(fā)育分化、X染色體失活、基因組印跡、染色質(zhì)修飾和內(nèi)源基因沉默方面起重要作用[9]。DNA甲基化是調(diào)節(jié)遺傳信息正確表達的關(guān)鍵表觀遺傳機制。

此外甲基化水平的變化是引起腫瘤的一個重要因素，甲基化的胞嘧啶位點是基因突變的熱點[10]。在腫瘤細胞中，(1)全基因組DNA甲基化水平降低，癌基因處于低甲基化狀態(tài)，通常會導(dǎo)致癌基因活化、轉(zhuǎn)錄表達，形成突變熱點從而導(dǎo)致整個基因組不穩(wěn)定性增加；(2)啟動子區(qū)域DNA甲基化水平升高，機體重要基因如細胞周期調(diào)節(jié)基因、抑癌基因、凋亡基因等處于高甲基化狀態(tài)，使其轉(zhuǎn)錄抑制、失活或沉默，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]；(3)DNA甲基化發(fā)生在(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上，而5-mC可通過自發(fā)或酶促脫氨轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，使甲基化的CpG突變?yōu)門pG，引起基因突變，這也是DNA甲基化促進細胞惡變發(fā)生腫瘤的一種機制[12]；(4)總體甲基化水平低可促進雜合性丟失或高頻率的染色體重組改變原有構(gòu)象，增加基因的不穩(wěn)定系，同樣導(dǎo)致有害基因轉(zhuǎn)錄表達[13]。

2 電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化

2.1 電離輻射誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化

Kalinich等[14]通過對4種體外培養(yǎng)的細胞系進行不同劑量的γ射線急性照射，觀察在照后24、48和72 h三個時間點的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)10 Gy照射后，所有細胞基因組DNA甲基化水平都表現(xiàn)為劑量依賴性降低，且在48 h的時間點下降最為明顯，表明了全基因組DNA甲基化的缺失。Tawa等[15]用高效液相色譜法檢測5-甲基胞嘧啶含量，研究了小鼠在4、7和10 Gy急性X射線照射后的甲基化水平變化，發(fā)現(xiàn)照射后8、24、48、72 h后小鼠干細胞出現(xiàn)全基因組DNA低甲基化。這兩項研究均使用高劑量輻射作為單一急性劑量。

Koturbash等[16]首次研究了淋巴瘤前期輻射目標鼠胸腺受輻射誘導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)變化，對C57/B1小鼠進行一次5 Gy X射線的急性照射和10天分段的慢性照射，發(fā)現(xiàn)急性和分次全身照射顯著改變了鼠胸腺中的DNA甲基化模式，導(dǎo)致全基因組DNA低甲基化。

Pogribny等[17]用0.5、l和2.5 Gy X射線急性全身照射C57/B1雄性、雌性小鼠6 h后，肝及脾組織中觀察到輻射誘導(dǎo)的全基因組DNA低甲基化，同時用5 Gy急性照射小鼠也發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果，但是慢性照射未有顯著變化。Wang等[18]研究也證實了雄性BALB/c小鼠急性暴露于0.5 Gy X射線或長期暴露于分級劑量10天后，血液基因組表現(xiàn)出低甲基化。

梁建慶等[19]用12C6+束對大鼠右側(cè)肺部結(jié)構(gòu)進行照射，通過MethylRAD技術(shù)對大鼠心、肝、脾、左肺、左腎組織進行全基因組DNA甲基化檢測。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠相應(yīng)組織的全基因組DNA出現(xiàn)低甲基化表達。

目前發(fā)現(xiàn)高劑量和低劑量電離輻射均可誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化，且其程度因照射劑量、照射方式、照射組織等不同而異。全基因組DNA低甲基化通常被認為是基因組不穩(wěn)定的標志，會導(dǎo)致一些正常沉默的基因激活，與染色體和基因組不穩(wěn)定以及突變率增加有關(guān)[16]。通常在各種癌癥和癌前期都觀察到這種現(xiàn)象。

2.2 電離輻射誘導(dǎo)特定基因啟動子區(qū)DNA高甲基化

特定的基因組位點比其他基因位點對DNA甲基化的變化更敏感。特定基因內(nèi)的DNA甲基化譜可影響其轉(zhuǎn)錄模式，并可被外源應(yīng)激改變。電離輻射誘導(dǎo)的基因特異性DNA甲基化改變會影響相應(yīng)表達變化。

Kovalchuk等[20]報道了雄性和雌性C57/B1小鼠在分別接受單次5 Gy和分次劑量共5 Gy X射線照射后，肝臟中啟動子p16 INK4的高甲基化，且單次暴露組比分次暴露組更明顯，雄性組比雌性組更明顯，但在肌肉組織和MGMT啟動子區(qū)域無明顯變化。Romanenko等[21]同樣也發(fā)現(xiàn)慢性照射腫瘤組織后p16 INK4基因啟動子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)。

Wang等[18]將30只雄性BALB/c小鼠分為對照組、急性暴露(0.5 Gy X射線)和慢性暴露10天(0.05 Gy/d，10 d)，采用高效液相色譜(HPLC)和MeDIP定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)研究其甲基化譜，驗證了8個基因啟動子區(qū)高甲基化(Rad23b，Tdg，Ccnd1，Ddit3，Llgl1，Rasl11a，Tbx2，Scl6a15)是相對穩(wěn)定的，并表示這些基因在放射生物學(xué)中可能發(fā)揮重要作用。

Song等[22]將暴露在全身輻射下的雄性BALB/c小鼠分成4周1.75 Gy劑量，p16基因啟動子區(qū)在暴露6個月后胸腺組織有部分位點甲基化水平增高。

2.3 電離輻射誘導(dǎo)重復(fù)序列DNA甲基化改變

DNA甲基化的改變不僅限于特定的基因，還可以在重復(fù)序列中檢測到。重復(fù)序列是具有高拷貝的相同或互補的 DNA 片段，構(gòu)成三分之二的哺乳動物基因組，對調(diào)節(jié)基因組穩(wěn)定性與正常功能具有重要作用，其中包括長散布序列1(LINE-1)和短散布序列Alu等。LINE-1和Alu重復(fù)序列約占人類基因組的30%，通常被高度甲基化[23-24]。而島外CpG位點的某些重復(fù)序列的DNA低甲基化，致使基因組和染色體不穩(wěn)定性增加，基因表達受抑制[25-27]。

Aypar等[28]將人類倉鼠雜交細胞系(GM10115)暴露于2 Gy的X射線后，發(fā)生了LINE-1的 DNA低甲基化。Koturbash等[29]將C57BL/6J雄性小鼠暴露于兩種類型的空間輻射質(zhì)子和56Fe，在照射后第7天觀察到LINE-1的低甲基化，在照射90天后發(fā)現(xiàn)LINE-1和其他逆轉(zhuǎn)座子ERV2和SINE B1，以及主要衛(wèi)星DNA高甲基化。Baulch實驗室顯示，在暴露于1 Gy的X射線后，RKO癌細胞系中LINE-1元素發(fā)生了明顯低甲基化；在同一研究中，在RKO和RKO中均觀察到LINE-1和Alu元素的低甲基化[24]。

Rashmi等[30]對人外周血進行照射，分析了LINE-1重復(fù)序列的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)0.1 Gy照射條件下，MRE11A和TNFAα在照射后72 h甲基化水平顯著升高；2.0 Gy照射條件下，LINE1、MRE11A、PARP1、BRCA1、DNMT3A 和 RAD23B在照射后48 h和72 h的甲基化水平顯著升高。

綜上表明，重復(fù)序列的DNA甲基化狀態(tài)變化受電離輻射的影響，并且這些變化與劑量、細胞、組織、時間和輻射類型有關(guān)。

2.4 電離輻射誘導(dǎo)DNA甲基化模式改變的機制

電離輻射導(dǎo)致基因組DNA甲基化模式改變的可能機制有：電離輻射對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響、電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)和生物體-碳代謝途徑的改變。

(1)電離輻射對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響

電離輻射會引起各種DNA損傷如雙鏈斷裂等，損傷產(chǎn)物會降低DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性以及mRNA和蛋白表達水平，從而導(dǎo)致DNA低甲基化；電離輻射對機體水分子的電離和激發(fā)作用會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，ROS可作為DNA甲基化的催化劑，可以通過增加DNMTs的表達使啟動子區(qū)域DNA高甲基化[31]。此外，電離輻射還會影響幾種特異性靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的micro-RNA，如miR-29家族，miR-141和miR-152，可能導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA降解以及隨后的DNA甲基化改變[32-33]。

(2)受照細胞DNA損傷及其修復(fù)狀態(tài)

電離輻射使全基因組DNA甲基化水平降低，其與DNA鏈斷裂的累積和重組活性的提高有關(guān)。直接照射的組織中細胞甲基化的降低可能與這些細胞的修復(fù)狀態(tài)有關(guān)。實際上，在修復(fù)合成過程中，參與修復(fù)和重組的DNA聚合酶摻入的是胞嘧啶而不是甲基胞嘧啶，因此，DNA損傷的誘導(dǎo)以及隨后DNA修復(fù)和重組機制的激活可能導(dǎo)致DNA低甲基化，即由于暴露于電離輻射引起的DNA甲基化抑制與DNA修復(fù)的激活相關(guān)[34]。

(3)一碳代謝途徑的改變

一碳代謝是一碳單位生成和轉(zhuǎn)移的生物過程，影響生物體中細胞功能和特定生物甲基化反應(yīng),主要是影響S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的合成。正常條件下，甲硫氨酸(MET)在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A(MAT2A)的作用下轉(zhuǎn)化為SAM，SAM為DNMT提供其甲基，用于復(fù)制后的DNA甲基化維持。但是電離輻射可能會影響甲硫氨酸的合成和/或抑制甲硫氨酸向SAM的生物轉(zhuǎn)化，從而消耗了甲基供體SAM中的甲基，導(dǎo)致復(fù)制后的DNA半甲基化[35]。

3 DNA甲基化在輻射損傷防護的應(yīng)用

電離輻射致DNA甲基化可增加基因突變頻率對基因表達調(diào)控產(chǎn)生影響，將特定基因甲基化水平變化作為輻射損傷的生物標志物具有重要意義。然而目前僅是將特定基因甲基化水平作為輻射損傷標志物的可行性及理論基礎(chǔ)進行研究。

Lyon等[36]對MAYAK工人的基因甲基化研究表明，在工人腺癌中，GATA5啟動子甲基化程度高，GATA5是正常發(fā)育和維持細胞分化所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。推測啟動子甲基化使基因失活的頻率增加以及靶向腫瘤抑制基因(如GATA5)的增加可能是導(dǎo)致與放射線暴露相關(guān)的肺癌風險增加的因素。

Lee 等[37]對核電廠工作人員職業(yè)輻射暴露與DNA甲基化的關(guān)系進行多元回歸模型分析，結(jié)果顯示，全基因組甲基化水平與輻射作業(yè)工人近1.5 年輻射劑量呈負相關(guān)，LINE-1甲基化水平與總累積輻射劑量呈正相關(guān)。

Alexer[38]對切爾諾貝利核電廠清理工人外周血白細胞中RASSF1A、p16、p14和GSTP1啟動子的甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)P16和GSTP1基因的甲基化與輻射暴露相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)在切爾諾貝利事故后生活在放射性污染地區(qū)的腎細胞癌患者中，可以觀察到p14ARF和p16INK4A基因異常高甲基化[39]。這些研究提示，將DNA甲基化特異性進一步研究，有可能作為癌癥早期診斷的生物標志物。

4 結(jié)語

目前對輻射誘導(dǎo)DNA甲基化的機制了解不夠充分，需要有效的方法識別與輻射相關(guān)的引發(fā)機體發(fā)生甲基化的熱點基因組[40]。如開發(fā)高通量測序方法和強大分析平臺用于臨床的診斷、治療以及預(yù)后，將會為輻射導(dǎo)致的DNA全基因組和啟動子區(qū)基因組的改變提供技術(shù)支持。開發(fā)實用的模型對受照人群的流行病學(xué)數(shù)據(jù)進行分析，評估輻射風險，確定個體放射敏感性決定因素，對研究表觀遺傳機制以及進一步理解劑量暴露的影響有重要作用。

另外，需要深入了解DNA甲基化誘發(fā)腫瘤的機制及去甲基化藥物的開發(fā)與應(yīng)用，將其用于抗癌治療或用作放射治療敏化劑；選擇適當?shù)呐鋵Ψ绞綄δ[瘤細胞進行特異性甲基化檢測；對早期疾病特別是腫瘤的篩查、評估治療效果和預(yù)后評估中具有重要意義。