劉洪斌，段曉亮，李 穎，趙璐瑤?

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100020；2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院 糧食品質(zhì)與營養(yǎng)研究所，北京 100037）

大米作為我國居民的主食之一，其品質(zhì)一直備受消費者和科研人員的關(guān)注。研究結(jié)果表明，大米的香味由多種揮發(fā)物組成，包括烴類、芳烴類、醛類、酮類、酯類、酸類、醇類、烯及烯醇類、雜環(huán)化合物等[1]。在所有揮發(fā)物中，2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）是目前研究最多的大米特征性香氣成分[2]，其含量的高低直接影響大米的品質(zhì)與價格。

2-AP是一種沸點較低的小分子雜環(huán)化合物，其相對分子質(zhì)量為 111.14，具有烤面包味、堅果味及爆米花味[3]，在空氣中的氣味閾值很低（0.02～0.04 ng/L），因此在大米蒸煮過程中很容易被聞到[4]。但是，2-AP在大米中的含量通常低至μg/kg，在用現(xiàn)代分析方法檢測過程中，儀器靈敏度低、基質(zhì)干擾、色譜分離共流出等問題會導(dǎo)致 2-AP檢測不出[5]，或存在檢測結(jié)果不穩(wěn)定、回收率低等問題。因此，如何建立適當(dāng)?shù)臋z測方法，以實現(xiàn)對2-AP的精確測定非常重要。

到目前為止，2-AP的檢測方法主要有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）、氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry，GC-TOF-MS）、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（Two Dimensional Gas Chromatography-Time of Flight-Mass Spectrometry，GC×GC-TOF-MS）、氣相質(zhì)譜-嗅聞-質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Olfactometry-Mass Spectrometry，GC-O-MS）及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等。本文綜述了2-AP各種前處理方法、檢測方法的優(yōu)缺點，以及2-AP形成機制的研究進(jìn)展，并展望了未來的發(fā)展方向。

1 樣品前處理方法

1.1 水蒸餾法

水蒸餾法是提取植物樣品中揮發(fā)成分最常見的方法之一。在蒸餾過程中，可通過減少裝置內(nèi)的壓力而降低沸點，從而在較低的溫度下即可收集到待測組分，避免待測組分的分解。Sugunya等[6]采用水蒸餾法、氮磷檢測器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）和高選擇性的色譜柱CP-Wax 51測定了考道馬里105糙米中包含2-AP在內(nèi)的140種揮發(fā)化合物，樣品用量為0.5 g，內(nèi)標(biāo)為 2,4,6-trimethylpyridine（TMP），并對 2-AP等揮發(fā)物進(jìn)行了相對定量分析，但未對方法的檢測限和定量限等參數(shù)進(jìn)行評估。在蒸餾過程中，隨水蒸氣蒸發(fā)的 2-AP需要經(jīng)過冷凝管冷凝后收集，因此耗時較長。

1.2 同時蒸餾萃取法

同時蒸餾萃取法（simultaneous distillationextraction，SDE）將水蒸氣蒸餾和溶劑萃取的過程合二為一，Buttery等[7]將水和乙醚作為萃取溶劑，在高溫（100 ℃）下進(jìn)行2-AP的萃取，樣品用量為0.5 g，GC-MS結(jié)果顯示10 種香米中2-AP的含量為 0.006～0.09 mg/kg。SDE法提取溫度較高，可能會造成 2-AP的損失。SDE法相比蒸餾法，在減少冷凝時間的同時，也降低了2-AP在轉(zhuǎn)移過程中的損失。

1.3 溶劑萃取法

溶劑萃取法是利用大米樣品中包含 2-AP的各組分在溶劑中的溶解性質(zhì)差異而達(dá)到分離的效果。Hien等[8]直接用400 mL純乙醇為萃取溶劑，將100 mg大米粉末在70 ℃下萃取2 h后高速離心，上清液直接進(jìn)行 GC-MS檢測，結(jié)果不同品種大米中 2-AP的含量為0～430.7 μg/kg。溶劑萃取法操作溫度低，相比蒸餾法和同時蒸餾萃取法，減少了2-AP在萃取過程中的降解，操作方便。但有時受基質(zhì)影響嚴(yán)重，可能造成結(jié)果失真。

1.4 固相微萃取法

固相微萃取法（Solid Phase Micro Extraction，SPME）是基于涂有固定相的熔融石英纖維來吸附、富集樣品中待測物質(zhì)的一種前處理方法。SPME法集采樣、萃取、濃縮于一體，前處理速度快，是目前食品中揮發(fā)性成分分析主要的前處理方法之一。SPME法的萃取效果除受樣品基質(zhì)影響外，還可能受纖維涂層類型、萃取溫度、萃取時間等多因素的影響。Hopfer等[9]測試了不同SPME纖維從大米中提取和解吸2-AP的能力，結(jié)果顯示兩種混合纖維（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷和二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷對2-AP的提取率最高，GC-MS/MS的檢測限和定量限可達(dá)到pg級，分別為3 pg/g和39 pg/g。因此，將SPME技術(shù)和GC-MS/MS聯(lián)用，可大大提高分析2-AP的靈敏度。目前，傳統(tǒng)水蒸餾法、溶劑萃取法等前處理方法正逐漸被自動化固相微萃取技術(shù)取代，隨著新型性能更加穩(wěn)定的SPME的研制，SPME頂空進(jìn)樣結(jié)合GC-MS/MS技術(shù)將越來越多地應(yīng)用于大米2-AP的分析中。

2 檢測方法

以 GC為基礎(chǔ)的檢測方法常用于分析小分子低沸點的弱極性化合物，因此非常適合分析2-AP，因此2-AP的檢測方法大多以GC為基礎(chǔ)，通過結(jié)合不同的檢測器，來達(dá)到對2-AP的定性和定量分析。

2.1 GC-FID/NPD

在GC分析2-AP的過程中，以2-AP在色譜柱上的保留時間進(jìn)行定性，即通過對比樣品中2-AP的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，來確認(rèn)樣品中是否含有2-AP。常用的檢測器有火焰離子化檢測器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）及氮磷檢測器（Nitrogen Phosphorus Detector，NPD）。有研究結(jié)果表明，在采用大口徑熔融石英毛細(xì)管柱和頂空進(jìn)樣檢測香米中的2-AP時，NPD比FID的靈敏度更高，檢測限分別為5 ng/g和20 ng/g[10]。

GC法本身靈敏度低，且GC分離時，樣品基質(zhì)中與2-AP性質(zhì)相似的物質(zhì)可能會與2-AP共流出，會對測定結(jié)果的準(zhǔn)確性造成很大影響。因此，選擇合適的檢測器及更適合分離2-AP的色譜柱，對于2-AP的定量分析非常關(guān)鍵。

2.2 GC-MS

在檢測2-AP時，相比FID及NPD等檢測器，質(zhì)譜檢測器的靈敏度更高、定性能力更強，因此GC-MS更適于大米中 2-AP的測定。頂空進(jìn)樣-固相微萃取技術(shù)（Headspace-Solid Phase Micro Extraction，HS-SPME）集采集、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體，是目前國際上比較流行的檢測微量揮發(fā)性有機物的方法[11]。在GC-MS對2-AP進(jìn)行測定時，常采用選擇性離子檢測（Selected ion Monitor，SIM）法，即采集用于 2-AP定量分析離子（m/z 111、83、68），通過內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

Lee等[12]采用HS-SPME結(jié)合GC-MS法，研究了預(yù)包裝大米飯中 2-AP的檢測方法，結(jié)果顯示，在20 mL頂空瓶中將1 000 ng的2-AP同位素內(nèi)標(biāo)加入4 g預(yù)包裝米飯中，可以獲得較好的回收率（78.25%～99.91%）和線性范圍（9.91～126.67 ng/g，R2=0.999 8），對于定量測定米飯中的2-AP有較好的準(zhǔn)確度（RSD=2.7%）。

GC-MS是目前2-AP檢測領(lǐng)域使用最多、應(yīng)用范圍最廣的技術(shù)，雖然靈敏度比 GC更高，但是由于大米本身基質(zhì)比較復(fù)雜，也會遇到檢測結(jié)果不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差等問題，因此并不適用于2-AP的精確測定。

2.3 GC-MS/MS

相比 GC-MS，GC-MS/MS的檢測靈敏度更高，更加適合對微量及痕量水平揮發(fā)物的分析。在采用GC-MS/MS分析時，除了標(biāo)準(zhǔn)品和保留時間，基于全掃描條件下2-AP的碎片離子豐度特征以及NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫中2-AP的碎片離子都可以對2-AP進(jìn)行定性[13]。而對于大米中2-AP 的定量，使用最多的還是內(nèi)標(biāo)法，常用的非同位素內(nèi)標(biāo)主要有2,6-二甲基吡啶（2,6-DMP）、2,4,6-三甲基吡啶（TMP）及 2-乙酰基吡咯（2-Pyr）等。TMP具有與2-AP相似的物理化學(xué)性質(zhì)，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保留時間與2-AP也比較接近，因此較其他內(nèi)標(biāo)的使用范圍更廣。但有研究表明，在質(zhì)譜總離子流圖中，TMP峰會和大米中的其他組分發(fā)生重疊。因此，與TMP性質(zhì)類似的2,6-DMP，以及與2-AP性質(zhì)更為接近的2-Pyr也會用作2-AP定量的內(nèi)標(biāo)。

相比非同位素內(nèi)標(biāo)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)在對2-AP進(jìn)行定量分析時優(yōu)勢更加明顯，近年來已經(jīng)取得了廣泛應(yīng)用。目前，2-AP最常用的同位素內(nèi)標(biāo)為氘代 2-AP-（CD3）和13C標(biāo)記的 2-AP-（13CH3）。此外，Maraval等[14]以 2-AP-d2（吡咯環(huán)上的5號位2個H被D取代）為內(nèi)標(biāo)，結(jié)合GC-MS/MS實現(xiàn)了香米中 2-AP的精確定量，線性范圍為 5.9～779 ng/g（R2=0.998 9），檢測限和定量限分別為0.1 ng/g和0.4 ng/g。

當(dāng)前，美國對香米（如巴斯馬蒂）的需求正在增加，通常香米中2-AP的含量較高。在香米育種篩選實驗中，由于樣品比較珍貴，通常需要在單粒大米水平上對 2-AP的含量進(jìn)行精準(zhǔn)檢測。Helene等[9]將HS-SPME結(jié)合GC-MS/MS用于分析單粒大米樣品中的 2-AP，SPME萃取溫度為40 ℃，采用同位素內(nèi)標(biāo)[2H2-6]-2AP進(jìn)行定量，結(jié)果顯示2-AP的線性范圍在53～5 380 pg/g之間，檢測限低于2-AP的閾值（0.02～0.04 ng/L）。

因此，GC-MS/MS的靈敏度和穩(wěn)定性相比GC-MS更高，且能夠在單粒大米水平分析 2-AP的含量，對于樣品珍貴的育種試驗意義顯著，對于促進(jìn)香米育種、建立痕量檢測2-AP的標(biāo)準(zhǔn)也都有重要意義。但是，GC-MS/MS需要溫度較高的前處理過程，如能優(yōu)化前處理方法，避免高溫導(dǎo)致的2-AP降解，GC-MS/MS將是目前GC相關(guān)方法中最有前景建立2-AP準(zhǔn)確定量的技術(shù)。

2.4 GC-TOF-MS

研究人員除采用常規(guī)的 GC-FID/NPD或GC-MS方法外，還采用GC-TOF-MS對大米樣品中的2-AP進(jìn)行測定。Ali等[15]采用冷纖維SPME結(jié)合GC-TOF-MS測定了9個伊朗香米和2個印度香米中2-AP的含量，結(jié)果顯示，與商用SPME相比，實驗室改性的冷纖維SPME也能夠準(zhǔn)確地識別出樣品中的2-AP并進(jìn)行富集檢測。

GC-TOF-MS是傳統(tǒng)GC-MS的替代升級，適合于復(fù)雜基質(zhì)的全組分分析。通過配備代謝組學(xué)產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫、SIMICA數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)軟件等，可開展揮發(fā)物組學(xué)研究，因此更適于2-AP的相關(guān)機制分析，如2-AP生成前體及產(chǎn)物的分析和鑒定等，不適合單純建立2-AP的定量方法。

2.5 GC×GC-TOF-MS

GC×GC-TOF-MS在GC-TOF-MS的基礎(chǔ)上，利用強極性與非極性正交組合的二維色譜柱[16]，采用程序升溫對揮發(fā)物進(jìn)行分離，可以提高儀器分辨率與峰容量，同時掃描全譜范圍離子，提高儀器的檢測通量，特別適合于進(jìn)行植物相關(guān)調(diào)控機制分析。

近年來，隨著2-AP研究的不斷深入，研究人員也逐漸轉(zhuǎn)向2-AP的形成機制研究，從機理層面為香米的呈香機制提供支撐。6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四氫吡啶（6M5OTP），2-乙酰吡咯，吡咯和 1-吡咯啉等化合物與 2-AP的產(chǎn)生密切相關(guān)。Daygon等[17]采用GC×GC-TOF-MS從代謝組學(xué)角度進(jìn)行香米的呈香機理研究，結(jié)果顯示6-甲基-5-氧代-2,3,4,5-四羥基吡啶（6M5OTP）是和 2-AP具有相似香味的同分異構(gòu)體，該結(jié)果也通過GC-TOF-MS檢測6M5OTP的標(biāo)準(zhǔn)品得到了驗證。全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，所有化合物的產(chǎn)生與FGR基因存在關(guān)聯(lián)性，為2-AP的產(chǎn)生及香氣累積途徑提供了新的見解。

因此，隨著GC-TOF-MS和GC×GC-TOF-MS應(yīng)用于2-AP機制研究的不斷深入，2-AP的形成及反應(yīng)過程將逐步明確，對于提升大米品質(zhì)具有重要意義。

2.6 GC-O-MS

GC-O-MS是將儀器檢測和嗅覺分析相結(jié)合進(jìn)行揮發(fā)物分析的技術(shù)。在實驗過程中，GC將試樣組分分離，研究人員通過嗅探口對聞到的氣味進(jìn)行描述并記錄，進(jìn)而獲得被測化合物的氣味特征。

大米品種及生長區(qū)域的不同導(dǎo)致不同的大米具有不同的香氣類型。Yang等[18]采用 GC-O-MS分析了六種風(fēng)味明顯不同的大米樣品（巴斯馬蒂、茉莉、兩個韓國粳稻品種、黑米和一種非香米）的香氣組成。經(jīng)過培訓(xùn)的評估人員對米飯樣品中36種揮發(fā)物進(jìn)行了描述，結(jié)果顯示 25種揮發(fā)物具有中等或更高的強度（氣味強度≥3），被認(rèn)為是主要的氣味活性化合物。隨后通過GC-O測定了25種揮發(fā)物的氣味閾值，結(jié)果顯示，2-AP的氣味閾值最低（0.02 ng/L），其次是 11種醛類（0.09～3.1 ng/L）、愈創(chuàng)木酚（1.5 ng/L）和 1-辛烯-3-醇（2.7 ng/L）。根據(jù)氣味閾值和氣味活性值（Odor Activity Value，OAV），評估了每種主要氣味活性化合物的重要性，顯示2-AP、己醛、（E）-2-壬醛、辛醛、庚醛和壬醛的OAV占每種大米香氣OAV的相對比例在97%以上，并且可以作為區(qū)分六種風(fēng)味大米的標(biāo)志物。相比 GC-MS等分析儀器，GC-O能夠識別出和基質(zhì)組分共流出的氣味組分，可以更加直觀地描述氣味特征，對于鑒別特殊大米中未知的香氣活性成分具有重要意義。

基于GC的儀器方法對小分子低沸點的2-AP有較大的優(yōu)勢，但需要與高溫蒸餾或高溫萃取等樣品前處理方法相結(jié)合。2-AP本身具有熱不穩(wěn)定性，在高溫條件下可由糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)而生成。因此，采用 GC相關(guān)的分析方法可能會因前處理過程中 2-AP的損失或繼續(xù)生成而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.7 HPLC-MS/MS

與 GC分離分析相比，高效液相色譜不需要溫度較高的前處理過程，因此對待測物的沸點、熱穩(wěn)定性等要求較低，對 2-AP的檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。Jost等[19]采用HPLC-MS/MS建立了大米和小麥面包中2-AP的分析方法。以pH 7.4的磷酸緩沖液為提取劑進(jìn)行超聲提取，以鄰苯二胺為衍生試劑進(jìn)行衍生，生成穩(wěn)定性較好的2-乙?；?1-吡咯啉喹喔啉（2-APQ）衍生物，通過加入2-APQ-d4同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行2-AP的定量。方法的檢測限和定量限分別為0.26 μg/kg和0.79 μg/kg，檢測的11個巴斯馬蒂米樣品中2-AP含量為41～356 μg/kg。該方法唯一的不足是衍生化反應(yīng)需要在避光條件下反應(yīng)24 h。有研究表明，2-AP在面包烘烤過程中可由鳥氨酸和磷酸三糖磷酸形成[20]，目前未見大米加工過程中形成 2-AP的報導(dǎo)，而以上HPLC-MS/MS法中的樣品提取只需要在室溫條件下進(jìn)行，2-AP不會因發(fā)生降解而損失，避免了由此引起的測定結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，因此非常適合對面包中2-AP的精確定量。

但是，從目前來看，GC相關(guān)技術(shù)由于前處理簡單，且可同時分析大米中其他化合物包括2-AP等，仍然是分析 2-AP的主流技術(shù)。而 HPLCMS/MS由于檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，對于食品加工過程中產(chǎn)生的2-AP的定量分析有重要意義。

3 2-AP形成機制

近年來，關(guān)于大米中2-AP的形成機制研究一直在進(jìn)行中。然而，對于2-AP的形成時期問題，即2-AP是在高溫蒸煮過程中，通過氨基酸和碳水化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)形成，還是在大米原料即水稻生長過程中形成，一直存在爭議。另外，關(guān)于 2-AP形成的控制基因和生成前體研究也取得了一些進(jìn)展。

3.1 形成時期

有研究表明，日本早抽穗品種“宮古里”在籽粒發(fā)育過程中，2-AP的含量在抽穗后4或5周達(dá)到峰值，然后在7或8周迅速下降至最大值的20%；對于晚抽穗品種“Hieri”中，2-AP濃度在抽穗后4周時達(dá)到峰值，然后在8周時逐漸降低到最大值的 40%[21]。因此，大米中的 2-AP可在水稻生長階段形成。Yoshihashi[22]等研究結(jié)果表明，香米考馬道里105樣品中的2-AP在烹飪中不會形成。此外，2-AP的含量會隨著大米儲存時間的延長而減少，在儲存8個月后，2-AP的含量降至初始含量的7%[23]，該研究表明，2-AP不會在大米儲藏過程中形成。因此，2-AP應(yīng)在水稻生長過程中形成，且在烹飪和儲藏過程中不會形成。

另外，研究表明非香米中也含有2-AP，只是含量較香米低[24]。同時，不同的大米品種具有不同的感官特性，表明除2-AP之外的揮發(fā)物也在貢獻(xiàn)米飯的香味[25]。因此，2-AP不應(yīng)該是區(qū)分香米和非香米的唯一標(biāo)準(zhǔn)。我國水稻品種眾多，研究我國大米樣品中 2-AP的含量和形成規(guī)律對于提升我國大米品質(zhì)具有重要意義。

3.2 控制基因

大米香氣的形成一般由多個基因控制，近年來學(xué)者們一直致力于大米香氣控制基因的挖掘，為高品質(zhì)水稻育種提供依據(jù)。Lorieux等[26]研究了控制大米香氣形成的基因，包括一個主基因和兩個QTL標(biāo)記。結(jié)果顯示，8號染色體上的幾個片段與2-AP形成的主基因即甜菜堿醛脫氫酶（Betaine Aldehyde Dehydrogenase，BADH2）密切相關(guān)。

隨后，各國研究人員就 BADH2基因展開研究，其中，Bradbury等[27]認(rèn)為非芳香水稻品種含有BADH2基因，可產(chǎn)生功能性BADH2酶，而芳香水稻品種含有突變 BADH2基因，因此產(chǎn)生非功能性酶，進(jìn)而產(chǎn)生更多的2-AP。Mathure等[24]研究表明，2-AP的合成與BADH2基因相關(guān)，非巴斯馬蒂香米的2-AP含量要高于巴斯馬蒂香米；在巴斯馬蒂香米中，2-AP的含量與1-十四烯和吲哚呈正相關(guān)。潘陽陽等[28]研究了 2-AP代謝通路在水稻籽粒發(fā)育過程中的變化，以美香占2號香稻和黃華占非香稻為對象，結(jié)果表明，BADH2基因的表達(dá)水平在兩種水稻生長周期內(nèi)發(fā)生了變化，只有美香占 2號水稻具有合成2-AP 的物質(zhì)基礎(chǔ)，多胺降解途徑和谷氨酸-脯氨酸轉(zhuǎn)化通路同時有助于2-AP的積累。

盡管如此，BADH2基因并不是控制大米中2-AP形成的唯一基因，且不同品種的控制基因可能存在差異，關(guān)于2-AP形成的控制基因研究仍在進(jìn)行中。

3.3 形成前體

在研究2-AP控制基因的基礎(chǔ)上，研究人員繼續(xù)對2-AP形成的前體進(jìn)行了探索，主要基于水稻的愈傷組織和同位素示蹤實驗來進(jìn)行。Yoshihashi等[29]采用同位素示蹤法進(jìn)行 2-AP的前體研究，15N脯氨酸、15N甘氨酸和脯氨酸-1-13C的示蹤實驗結(jié)果表明2-乙酰-1-吡咯啉的氮源是脯氨酸，而2-AP的碳源不是脯氨酸，且2-AP是在水稻生長階段形成。此外，Huang等[30]研究了泰農(nóng)71和泰農(nóng)72兩種香稻中2-AP生物合成的機制，通過愈傷組織研究發(fā)現(xiàn)，這兩個品種中 δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶，包括 δ1-焦-5-羧酸合成酶（P5CS）和鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（OAT）的活性顯著增加，且P5CS1和P5CS2基因的表達(dá)水平顯著高于普通水稻，用15N標(biāo)記的谷氨酸進(jìn)行示蹤實驗的結(jié)果表明，2-乙酰-1-吡咯啉的氮源來自谷氨酸。以上研究就2-乙酰-1-吡咯啉的氮源來源不一致，可能由于僅有有限的同位素標(biāo)記物用于模擬實驗，關(guān)于氮源來源是谷氨酸還是脯氨酸、兩者均有或還有更多其他來源，結(jié)論還需要進(jìn)一步驗證。

此外，Poonlaphdecha等[31]采用水稻愈傷組織對2-AP的合成前體進(jìn)行了研究，通過在愈傷組織中添加[U-13C]葡萄糖、乙酸鈉（1,2-13C2）和辛酸鈉（1,2,3,4-13C4），結(jié)果表明這些化合物可能是2-AP乙?；墓w，且1-吡咯啉是水稻合成2-AP的限制因素。

當(dāng)前，關(guān)于2-AP形成的前體研究主要是以愈傷組織開展模擬實驗，能不能反應(yīng)稻谷生長階段2-AP的實際合成情況還有待進(jìn)一步探討。同時，在模擬實驗中，僅采用幾種同位素標(biāo)記化合物用于前體研究，對于深入明確2-AP的前體具有很大的局限性，未來有必要基于高分辨質(zhì)譜進(jìn)行前體的廣泛篩選和驗證。

4 結(jié)論和展望

開展大米中2-AP精準(zhǔn)檢測方法的研究，對于明確呈香機理、提升大米品質(zhì)、及促進(jìn)進(jìn)出口貿(mào)易都具有重要意義。本文綜述了各種前處理技術(shù)的優(yōu)缺點，SPME技術(shù)正在成為2-AP提取的主流技術(shù)。GC、GC-MS、GC-O-MS等技術(shù)由于配置比較低、受基質(zhì)干擾比較大等問題，在重現(xiàn)性和靈敏度方面還有待進(jìn)一步提高，對于2-AP的精準(zhǔn)定量還有一定的局限性。GC-MS/MS的靈敏度更高，甚至可以實現(xiàn)單粒米水平2-AP的定量分析，可使大米等復(fù)雜基質(zhì)中 2-AP的定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。而新型基于衍生化反應(yīng)的HPLC-MS/MS分析方法的應(yīng)用，可有效解決采用 GC-MS分析檢測時 2-AP在高溫前處理過程中損失或新生成的問題，應(yīng)成為2-AP精準(zhǔn)檢測的首選方法。

由于 HPLC-MS/MS技術(shù)并不是揮發(fā)物研究的主流方法，在推廣和實際應(yīng)用中不如 GC-MS普遍，因此未來的研究方向仍要進(jìn)一步圍繞大米中 2-AP的高效提取方法及精準(zhǔn)定量儀器定量方法展開。2-AP的形成時期和控制基因已明晰，但形成前體和路徑仍需進(jìn)一步研究確定，結(jié)合GC-TOF-MS、GC×GC-TOF-MS等技術(shù)將進(jìn)一步促進(jìn)2-AP的形成機制研究。