張海燕，康三江，張霽紅，曾朝珍，袁 晶，宋 娟

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

細菌、真菌等微生物在食品發(fā)酵過程中通過多種代謝途徑賦予發(fā)酵食品特殊的風味和保健功能，尤其與風味的形成密不可分[1]。隨著新一代測序技術和多元統(tǒng)計分析技術的發(fā)展，國內(nèi)外學者在闡明釀造酒[2-5]、釀造醋[6-8]以及發(fā)酵果蔬[9-10]等發(fā)酵食品的微生物多樣性與風味形成相關性方面做了大量的研究，對明確發(fā)酵食品中微生物的風味代謝途徑及其形成機理意義重大。

食用植物酵素作為發(fā)酵食品之一，是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人來食用的酵素產(chǎn)品[11-12]。其不僅含有植物本身的多種維生素、酶和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[13]，還通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生了新的次生代謝物及活性成分，可滿足人們對口感、風味、營養(yǎng)以及健康功能的需求[14-15]。食用酵素中乳酸菌、酵母菌、醋酸菌和霉菌等微生物對產(chǎn)品風味物質(zhì)的形成至關重要，陰芳冉[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓酵素自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物酵母屬（Saccharomyces）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）和漢遜酵母屬（Hanseiaspora）與其部分有機酸、氨基酸和其他活性物質(zhì)有顯著相關性（P＜0.05）；邸鵬月等[17]采用宏基因組分析了桑葚酵素的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)乳桿菌在桑葚酵素風味形成中起重要作用；李希羽等[18]分析了3種水果酵素自然發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群和乳酸、檸檬酸、蘋果酸和草酸等有機酸的變化規(guī)律，結果表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對有機酸的生成貢獻率最大。蘋果經(jīng)微生物發(fā)酵可將大分子活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子營養(yǎng)成分，有利于人體吸收，發(fā)酵后含有豐富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等功效酶及較強的抗氧化能力[19]。目前，對蘋果酵素的研究多集中在工藝優(yōu)化[20-21]、代謝產(chǎn)物[22]及抗氧化性能的變化[23-24]等方面，康曉樂等[25]對蘋果自然發(fā)酵酵素的微生物多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，蘋果酵素中的微生物菌群結構復雜多樣，以乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）、乳酸乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等為主，但對于蘋果酵素微生物群落與風味物質(zhì)相關性的研究報道較少。同時，LIU A P等[26]研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵體系中多種菌群的協(xié)同作用可賦予產(chǎn)品豐富的香味和滋味，有利于天然微生物資源的挖掘、篩選和開發(fā)以及形成特殊的風味物質(zhì)。

因此，本研究通過IlluminaMiSeq高通量測序技術對蘋果酵素自然發(fā)酵過程中微生物多樣性進行分析，同時采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法對其發(fā)酵過程中風味成分的變化進行監(jiān)測分析，并利用雙向正交偏最小二乘法（bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS）擬合模型系統(tǒng)分析微生物菌群與風味物質(zhì)之間的相關性，以期為挖掘相關功能微生物、探究風味形成機理和改進蘋果酵素發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果（長富2號）：采自甘肅省平?jīng)鍪刑O果試驗基地；乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酸、蘋果酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絡氨酸、谷氨酸、組氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、甲醇、3-辛醇、乙酸正戊酯等標準品（均為色譜純）：美國Sigma公司；無水乙醇（色譜純）：上海阿拉丁試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Markers：寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2020 SYSTEM氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；RIGOL L3000高效液相色譜儀：北京普源精電科技有限公司；Amethyst C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國賽分科技有限公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ABI GeneAmp9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYCP-32B瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酵素樣品的制備

新鮮蘋果用純凈水沖洗干凈，瀝干水分后去核并切分成3～5 mm的片，冰糖破碎后用紫外燈輻照處理30 min，將蘋果片與純凈水按料液比200∶1（g∶L）加入無菌酵素發(fā)酵罐中，加入冰糖調(diào)節(jié)糖度至15.0°Bx，置于陰涼干燥的發(fā)酵車間，在常溫（20～26 ℃）條件下自然發(fā)酵30 d后，濾去果肉，繼續(xù)發(fā)酵至90 d，發(fā)酵第一個月隔天攪拌通氣，之后密封發(fā)酵，發(fā)酵過程中每15 d無菌取樣，樣品編號分別為：j0、j15、j30、j45、j60、j75、j90，每個樣品5個重復，-80 ℃保存待檢測。

1.3.2 DNA提取及PCR擴增[27]

DNA提取方法參照試劑盒說明書，提取完成后用1%瓊脂糖凝膠測定DNA純度。以其為模板，采用帶有條形碼的特異性引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）、ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別擴增細菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)和真菌ITS區(qū)基因序列。PCR擴增體系：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTPs）2 μL，5 μmol/L上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)27次；72 ℃再延伸10 min。

1.3.3 文庫構建和Illumina MiSeq高通量測序

委托南京集思慧遠生物科技有限公司完成，使用試劑盒完成文庫的構建后，利用Qubit進行定量檢測以保證所建文庫的質(zhì)量合格，然后在Illumina MiSeq2500平臺對細菌16S rRNA基因和真菌ITS rRNA基因文庫進行測序，并基于有效數(shù)據(jù)以97%的相似性進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析，同時對OTUs進行Alpha多樣性分析；通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析效應值（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）統(tǒng)計分析方法探究組間群落結構的差異。

1.3.4 風味物質(zhì)分析

有機酸：取2 mL樣品，10 000 r/min離心5 min后取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC法測定有機酸含量[28]。HPLC條件：進樣量為10 μL；Waters Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相0.05 mmol/L H3PO4∶甲醇=95∶5（V/V），流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm。

氨基酸：取1 mL樣品，用100 g/L的三氯乙酸等體積稀釋后靜置1 h，雙層濾紙過濾后10 000 r/min/離心10 min，取上清液采用HPLC法測定氨基酸含量[28]。HPLC條件：流動相A為27.6 mmo/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（500∶0.11∶2.5，V/V）（pH=7.2），流動相B為80.9 mmo/L醋酸鈉-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）（pH=7.2），AgilentHypersilODS（4.0 mm×250mm，5 μm）色譜柱，梯度洗脫程序為0 min，8%B；17 min，50%B；20.1 min，100%B；24.0 min，0%B。流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長338 nm，脯氨酸檢測波長為262 nm。

揮發(fā)性風味成分：取1 mL上清液，加入1 mL甲醇、50 μL 3-辛醇內(nèi)標（630.8mg/L），100μL乙酸正戊酯內(nèi)標（438.7mg/L），漩渦混勻，采用GC-MS檢測揮發(fā)性風味成分[28]。GC條件：TB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱，升溫程序為40 ℃恒溫2 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃，再以15 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。載氣為高純氦氣（He），流速1.2 mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣。MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍33.00～350.00 amu。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析

采用PRINSEQV0.20.4、PandaseqV2.11、VsearchV2.15.0、QIIME、LefSe、Orange軟件進行統(tǒng)計學分析，結果用“平均值±標準差”表示。采用Simca14.1軟件考察微生物群落與風味物質(zhì)的相關性，利用Cytoscape可視化微生物群落群落與風味物質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡。

2 結果與分析

2.1 蘋果酵素發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

2.1.1 IlluminaMiSeq高通量測序結果及微生物α-多樣性分析

采用Illumina Miseq測序分析蘋果酵素發(fā)酵過程中微生物的多樣性，測序結果及α-多樣性指數(shù)見表1。由表1可知，在35個樣品中，質(zhì)控后共獲得1700535條高質(zhì)量的16SrRNA基因序列，平均每個樣本有48 587條，共獲得4 307個OTUs，平均每個樣品得到123個OTUs；共獲得1 348 741條高質(zhì)量的ITS rRNA基因序列，平均每個樣本有38 535條，共得到3 567個OTUs，平均每個樣品得到102個OTUs；每個樣品的覆蓋率均＞99%，說明測序深度覆蓋到樣品中所有的物種，且數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。根據(jù)Chao1和Shannon指數(shù)可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中細菌和真菌菌群的豐度和多樣性均逐漸升高，細菌菌群在發(fā)酵90 d時達到最高，真菌菌群在發(fā)酵75 d時達到最高，說明發(fā)酵有利于提高食用蘋果酵素中菌群的數(shù)量及種類。

表1 Illumina MiSeq高通量測序結果及α-多樣性分析結果Table 1 Results of Illumina MiSeq high-throughput sequencing and Alpha diversity analysis

2.1.2 微生物群落組成及動態(tài)變化

在門和屬水平上對蘋果酵素中的微生物群落進行分類以考察其發(fā)酵過程中的演替規(guī)律，結果見圖1。蘋果酵素發(fā)酵過程中共鑒定出366個細菌門和489個真菌門，由圖1A可知，細菌群落中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）占絕對優(yōu)勢地位，二者的相對豐度＞96%，其中，變形菌門在發(fā)酵0～15 d和75～90 d處于主導地位，隨著發(fā)酵時間的延長，其相對豐度從發(fā)酵0 d的99.58%逐漸降低至45 d時的41.38%，隨后逐漸升高，發(fā)酵90 d時上升至75.40%；厚壁菌門的相對豐度先升高后降低，發(fā)酵60 d時最高為57.34%，隨后逐漸降低至90 d時的21.55%。真菌群落中子囊菌門（Ascomycota）在整個發(fā)酵過程中占絕對優(yōu)勢地位，相對豐度達87.93%～99.74%，其相對豐度先降低后升高，發(fā)酵75 d時降至最低為87.93%，發(fā)酵90 d時又上升至93.18%；其次為擔子菌門（Basidiomycota），相對豐度為0.07%～4.11%，其相對豐度隨著發(fā)酵時間的延長先升高后降低，發(fā)酵75 d時最高為4.11%，隨后逐漸降低至90 d時的1.75%。

圖1 基于門（A）和屬（B）水平蘋果酵素發(fā)酵過程中微生物的群落結構Fig.1 Microbial community structure of apple Jiaosu during fermentation process based on phylum (A) and genus (B) levels

蘋果酵素發(fā)酵過程中共鑒定出218個細菌屬和114個真菌屬，由圖1B可知，在發(fā)酵0～15 d，泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）和葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobac ter）占優(yōu)勢地位，其相對豐度之和為60.83%～97.86%，它們可能來源于原料和環(huán)境，并于發(fā)酵15 d后迅速減少。同時，酒球菌屬（Oenococcus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）的相對豐度從發(fā)酵15 d后逐漸升高，成為優(yōu)勢細菌群，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵75～90 d的優(yōu)勢細菌群以假單胞菌屬（Pseudomonas）為主，發(fā)酵90 d時達到最高，相對豐度為51.23%，同時，束毛球菌屬（Trichococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）等的相對豐度從發(fā)酵15 d后逐漸升高。真菌菌群在發(fā)酵45 d前主要以梨孢菌屬（Magnaporthe）為主，其相對豐度為87.80%～97.87%，發(fā)酵45 d后的優(yōu)勢真菌菌群有梨孢菌屬（Magnaporthe）和柱隔孢屬（Ramularia），二者相對豐度之和為76.77%～97.79%，曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、青霉屬（Penicillium）、枝孢霉屬（Cladospo rium）、酵母屬（Saccharomyces）以及威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）等的相對豐度隨著發(fā)酵的進行逐漸升高，它們雖然占比較小，但可能為蘋果酵素風味的形成做出了重要的貢獻[29]，威克漢姆酵母菌作為非釀酒酵母，在高酸度條件下生長良好，生成大量酯類，并且保證生成的酯類不被降解[30]。

2.2 蘋果酵素發(fā)酵過程中微生物菌群組成的比較

為了進一步了解蘋果酵素發(fā)酵過程中的微生物菌群結構，采用PCA和LEfSe對其發(fā)酵過程中的微生物菌群在屬水平的組成進行比較，結果分別見圖2和圖3。

由圖2可知，根據(jù)細菌群落結構蘋果酵素發(fā)酵過程分為3個階段：0～15 d為發(fā)酵前期，30～60 d為發(fā)酵中期，75～90 d為發(fā)酵后期；根據(jù)真菌群落結構蘋果酵素發(fā)酵過程分為可分為2個階段：0～45 d為發(fā)酵前期，60～90 d為發(fā)酵后期。

圖2 基于屬水平蘋果酵素發(fā)酵過程中細菌（A）和真菌（B）群落的主成分分析結果Fig.2 Principal component analysis results of bacterial (A) and fungal (B) communities of apple Jiaosu during fermentation process based on genus level

由圖3可知，發(fā)酵前期（0～15 d）與其他兩個階段的差異細菌屬有4個，分別為泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）和Ferruginibacter，其中隨原材料進入的環(huán)境物種Pantoea和Enterobacter為此階段的主要差異細菌屬，Gluconobacter和Ferruginibac ter相對豐度增長，且Gluconobacter貫穿發(fā)酵始終，該菌含有多種酶類，可以產(chǎn)生多種重要化合物，這些化合物不僅在發(fā)酵中起著重要作用，還可能影響發(fā)酵過程中抗氧化性能的變化，酵素中酶活力的強弱可能與葡萄糖酸桿菌中富含酶有關[31]；由酒球菌屬（Oenococcus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和擬桿菌屬（Bacteroides）組成的細菌菌群在發(fā)酵中期（30～60 d）表現(xiàn)出明顯的屬間差異，此時，發(fā)酵體系中的氧氣含量逐漸下降，pH逐漸降低，抗炎因子的產(chǎn)生，使得雜菌及有害菌逐漸死亡，醋酸桿菌屬、酒球菌屬等有益菌的相對豐度增加，逐步占領泛菌屬和腸桿菌屬的空間與資源，這些益生菌及整個發(fā)酵環(huán)境的改變使得雜菌相對豐度逐步下降[32]，酒球菌屬是完成蘋果酸乳酸發(fā)酵的重要微生物[33]，醋酸桿菌屬在發(fā)酵30 d后可能因為進入乳酸發(fā)酵而逐漸降低；發(fā)酵后期（75～90 d）的差異菌種顯著增多，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈球菌屬（Streptococcus）為優(yōu)勢菌細菌屬，微小桿菌屬（Exiguobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）等可能是影響蘋果酵素風味物質(zhì)形成的主要菌群。真菌在發(fā)酵前期（0～45 d）的主要差異真菌屬為酵母菌屬（Saccharomyces）；畢赤酵母屬（Pichia）、曲霉屬（Aspergillus）、籃狀菌屬（Talaromyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、假絲酵母屬（Candida）等是發(fā)酵后期（60～90 d）的差異真菌屬?？傮w而言，每個發(fā)酵階段都有標志性的差異物種，在不同的發(fā)酵階段起著重要作用，對于不同發(fā)酵階段微生物在發(fā)酵過程中的作用及機制需要進一步的研究。

圖3 基于屬水平蘋果酵素發(fā)酵過程中細菌（A）和真菌（B）群落的LEfSe結果Fig.3 LEfSe results of bacterial (A) and fungal (B) communities of apple Jiaosu during fermentation process based on genus level

2.3 蘋果酵素發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的變化

2.3.1 有機酸和氨基酸的變化

有機酸和氨基酸是發(fā)酵產(chǎn)品中主要的滋味物質(zhì)[33]。蘋果酵素發(fā)酵過程中有機酸和氨基酸的變化見圖4。

由圖4A可知，從蘋果酵素發(fā)酵過程中共檢測出7種有機酸，分別為蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和丙酸。發(fā)酵初期（0～15 d）檢測到的主要有機酸為蘋果酸，其含量＞20 mg/100 mL，分析原因可能是由于蘋果酸是蘋果原料中的主要有機酸[34]；發(fā)酵中期（30～60 d），乙酸和乳酸的含量迅速升高，分析原因可能是在乳酸菌的作用下，蘋果酸被分解成乳酸及二氧化碳，與此同時產(chǎn)生帶有黃油風味的丁二酮等風味物質(zhì)[34]，在糖源充足的情況下，醋酸菌可直接利用葡萄糖生成乙酸[35]，或?qū)⒔湍妇x產(chǎn)生的乙醇在醋酸菌的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸[36]；發(fā)酵后期（75～90 d）的有機酸主要為乙酸和乳酸，占7種有機酸總量的90.25%，乙酸含量高于乳酸，這可能是因為厭氧條件下部分乳酸氧化轉(zhuǎn)化為乙酸，檸檬酸參與三羧酸代謝循環(huán)，在發(fā)酵過程中不易累積[37]，發(fā)酵結束時含量僅為9.12 mg/100 mL；琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，同時也是厭氧代謝的發(fā)酵產(chǎn)物之一[38]，發(fā)酵90 d時達到127.4 mg/100 mL；富馬酸和丙酸隨著發(fā)酵進程逐漸升高，但含量較低。

圖4 蘋果酵素發(fā)酵過程中有機酸（A）和氨基酸（B）含量的變化Fig.4 Changes of organic acids (A) and amino acids (B) contents in apple Jiaosu during fermentation process

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有降血壓、改善腦機能和調(diào)節(jié)睡眠等功能，游離氨基酸主要影響食品的酸、甜、苦、鮮等風味，其中谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）呈鮮味，苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、亮氨酸（leucine，Leu）、異亮氨酸（isoleucin，Ile）和纈氨酸（valine，Val）呈苦味，甘氨酸（glycine，Gly）、脯氨酸（proline，Pro）、絲氨酸（serine，Ser）、丙氨酸（alanine，Ala）、蘇氨酸（threonine，Thr）和賴氨酸（lysine，Lys）呈甜味[39]。由圖4B可知，蘋果酵素發(fā)酵過程中均含有17種游離氨基酸和γ-氨基丁酸，其中包括蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸（methionine，Met）、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸等6種必需氨基酸（essential amino acid，EAA），必需氨基酸是評價食品營養(yǎng)的指標之一，發(fā)酵結束時必需氨基酸含量為11.71 mg/100 mL，總氨基酸（total amino acid，TAA）含量為23.84 mg/100 mL，EAA/TAA為49.12%，與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）提出的理想蛋白質(zhì)模式的氨基酸組成EAA/TAA 40%接近[39]，說明蘋果酵素必需氨基酸含量豐富，達到優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的要求。蘋果酵素發(fā)酵過程中氨基酸含量普遍升高，這與金哲寧等[40]在沙棘酵素中的研究結果一致，發(fā)酵后期（75～90 d）氨基酸含量升高較快，這可能與微生物細胞中的氨基酸溶出有關[41]，含量較高的呈味氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸，7種氨基酸總含量占總氨基酸含量的82.05%，共同賦予蘋果酵素產(chǎn)品鮮香、甜美的特征。

2.3.2 揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化

食用酵素不僅含有原料本身的風味物質(zhì)，而且通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生了新的成分，揮發(fā)性風味物質(zhì)的構成與含量客觀地反映了產(chǎn)品風味特點[13]。蘋果酵素發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化見表2。

表2 蘋果酵素發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)GC-MS測定結果Table 2 Determination results of volatile flavor compounds in apple Jiaosu during fermentation process analyzed by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

由表2可知，蘋果酵素發(fā)酵過程中共檢出91種主要揮發(fā)性風味物質(zhì)，包括酯類31種、醇類16種、酸類18種、酮類18種、醛類6種、酚類2種，王印壯等[42]在葡萄酵素中檢測出21種香氣成分，范昊安等[43]在蘋果梨酵素中檢測出40種香氣成分，說明自然發(fā)酵的蘋果酵素的揮發(fā)性風味物質(zhì)較為豐富。發(fā)酵前期有13種酯類，總含量為46.00 mg/L，10種醇類，總含量為57.83 mg/L，9種酸類，總含量為33.05 mg/L，6種酮類，總含量為10.24 mg/L，3種醛類，總含量為7.29 mg/L，1種酚類，含量為6.68 mg/L；發(fā)酵中期有26種酯類，總含量為388.39 mg/L，14種醇類，總含量為281.01 mg/L，14種酸類，總含量為331.88 mg/L，13種酮類，總含量為75.94 mg/L，5種醛類，總含量為52.17 mg/L，2種酚類，總含量為7.11 mg/L；發(fā)酵后期有30種酯類，總含量為933.17 mg/L，11種醇類，總含量為173.81 mg/L，17種酸類，總含量為488.21 mg/L，7種酮類，總含量為19.17 mg/L，2種醛類，總含量為24.28 mg/L，2種酚類，總含量為9.53 mg/L。其中2-羥基-γ-丁內(nèi)酯、對羥基苯乙酸乙酯、異丁酸異戊酯、羥基乙酸乙酯、苯乙醇、異山梨醇、乙酸、乳酸、苯甲酸和兒茶酚等揮發(fā)性風味物質(zhì)在發(fā)酵后期含量較高，這可能與發(fā)酵后期微生物的代謝有關[4]，需要進一步進行相關性分析。

由表2亦可知，蘋果酵素發(fā)酵過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類和含量差異較大，酯類物質(zhì)的種類和含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，同時因其閾值低、氣味活度值高，故而在蘋果酵素的風味形成中貢獻較大，乙酸乙酯、甲酸乙酯、戊酸乙酯等長鏈脂肪酸乙酯具有水果香味，增加了產(chǎn)品的醇厚風味[44]。醇類物質(zhì)主要在酵母菌發(fā)酵階段產(chǎn)生，發(fā)酵45 d后含量和種類均逐漸降低，這可能是與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應生成酯類物質(zhì)，使得酯類物質(zhì)在發(fā)酵后期迅速升高。酸類物質(zhì)使蘋果酵素的香氣更為濃郁，酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)的含量呈先升高后降低的趨勢，這可能與其在發(fā)酵過程中易被氧化還原為酸或醇類物質(zhì)有關[42]。綜合來看，蘋果酵素中揮發(fā)性風味物質(zhì)主要以酯類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、醇類物質(zhì)為主，路翔等[45]提出對蘋果芳香起主要作用的物質(zhì)為酯類、醇類、酸類、醛類、酮類等，這與本研究的結果基本一致。

2.4 微生物菌群與風味物質(zhì)的相關性分析

采用微生物菌屬（218個細菌屬、114個真菌屬）與風味物質(zhì)（91種揮發(fā)性物質(zhì)、18種氨基酸、7種有機酸）兩個數(shù)據(jù)集建立O2PLS模型[47]，根據(jù)模型的解釋能力R2（細菌1、真菌1）和預測能力Q2（細菌0.936、真菌0.934）可知，O2PLS模型適合于微生物與風味物質(zhì)相關性的分析和預測，同時基于變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值＞1且P＜0.05篩選出對風味物質(zhì)影響較大的22個細菌屬和14個真菌屬，進行微生物菌群與風味物質(zhì)的Spearman相關性分析[46]，結果見圖5。

圖5 蘋果酵素發(fā)酵過程中細菌菌群（A）和真菌菌群（B）與風味物質(zhì)的相關性網(wǎng)絡圖Fig.5 Correlation network diagram of bacterial flora (A) and fungal flora (B) with flavor substances during fermentation process of apple Jiaosu

由圖5A可知，除腸桿菌屬（Enterobacter）與3種有機酸、3種氨基酸和15種揮發(fā)性風味物質(zhì)呈負相關關系外，其他21個細菌屬均與風味物質(zhì)呈正相關關系，其中與醋桿菌屬（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）呈正相關關系的風味物質(zhì)較多，包括6種有機酸（乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、丙酸）和6種氨基酸（天冬氨酸、蘇氨酸、絡氨酸、谷氨酸、組氨酸、纈氨酸）以及23種揮發(fā)性風味物質(zhì)（2-羥基丙酸乙酯、乙酸甘油酯、乙酸異山梨醇酯、甲酸糠酯、2-羥基丙酸甲酯、DL-甲羥戊酸內(nèi)酯、2-羥基丙酸乙酯、3-乙?；?4-羥基苯乙酸酯、α-乙酰丁內(nèi)酯、異山梨醇、丙二醇、苯乙醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基癸酸、苯甲酸、2（5H）-呋喃酮、2-丁酮、甘油醛、5-羥甲基糠醛、5-乙酰氧基甲基-2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛、兒茶酚）。

由圖5B可知，共有14種真菌屬與6種有機酸、7種氨基酸和29種揮發(fā)性風味物質(zhì)有相關性，除酵母菌屬（Saccha romyces）與2-甲基-丙酸呈負相關關系外，其他13個真菌屬均與風味物質(zhì)呈正相關關系。假絲酵母屬（Candida）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、枝孢屬（Cladosporium）、馬拉色菌屬（Malassezia）和紅酵母屬（Rhodotorula）是影響有機酸合成代謝的主要真菌屬微生物，均與乳酸和檸檬酸呈正相關關系；共有8個真菌屬對氨基酸的合成代謝產(chǎn)生貢獻，假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、枝孢屬、馬拉色菌屬和紅酵母屬5個屬與天冬氨酸、蘇氨酸、絡氨酸呈正相關關系，馬拉色菌屬、彎孢屬（Curvularia）、紅酵母屬3個屬與纈氨酸呈正相關關系，Meyerozyma和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）分別與谷氨酸和異亮氨酸呈正相關關系；假絲酵母屬、有孢圓酵母屬、枝孢屬、馬拉色菌屬、紅酵母屬、耙菌屬（Irpex）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、酵母菌屬（Saccharomyces）、鐮刀菌屬（Fusarium）、畢赤酵母屬（Pichia）11個真菌參與到29種揮發(fā)性風味物質(zhì)的代謝中，假絲酵母屬和有孢圓酵母屬與2-羥基-γ-丁內(nèi)酯、異丁酸異戊酯、3-乙?；?4-羥基苯乙酸酯、異山梨醇、苯乙醇、4-羥基苯乙醇、3-甲基-戊酸、3-甲基癸酸、2-甲基-丙酸、2-丁酮、5-甲基-2-呋喃甲醛、5-羥甲基糠醛和兒茶酚等14種揮發(fā)性風味物質(zhì)呈正相關關系。

綜上所述，醋桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、假絲酵母屬和有孢圓酵母屬是與蘋果酵素中風味物質(zhì)物質(zhì)關聯(lián)最強的微生物菌群。醋桿菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬是重要的產(chǎn)酸菌，均與乙酸和乳酸呈高度相關，它們在提供酸味的同時，還可與醇、醛、酮等物質(zhì)相互作用產(chǎn)生新的風味物質(zhì)[47]，而且一直以來被認為是病原菌的假絲酵母屬，在蘋果酵素風味物質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用[48]，這與XIAO Y S等[29]的研究結果一致，有孢圓酵母屬是常見的非釀酒酵母屬之一[49]，其發(fā)酵能力強，可以增加甘油、萜烯和果味脂肪酸酯類等的含量，同時低產(chǎn)乙醇、揮發(fā)酸和乙醛[50]。因此，微生物和風味物質(zhì)關聯(lián)性研究有利于科學評價微生物群落在蘋果酵素發(fā)酵中的作用，解決蘋果酵素中功能性微生物的篩選以及風味物質(zhì)的調(diào)控難題，并為建立具有科學性的發(fā)酵工藝，為生產(chǎn)風味和營養(yǎng)價值更高的酵素產(chǎn)品提供參考。

3 結論

本研究采用高通量測序技術對蘋果酵素發(fā)酵過程中微生物多樣性進行動態(tài)分析，通過PCA和LEfSe分析了蘋果酵素不同發(fā)酵階段的標志微生物演替圖譜，并結合高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術監(jiān)測風味物質(zhì)的變化。結果顯示，發(fā)酵過程中共鑒定出366個細菌門、218個細菌屬，489個真菌門、114個真菌屬。門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和子囊菌門（Ascomycota）是整個發(fā)酵過程中主要微生物。屬水平上，首先由環(huán)境微生物泛菌屬（Pantoea）、腸桿菌屬（Enterobacter）、梨孢菌屬（Magnaporthe）啟動發(fā)酵，隨后酒球菌屬（Oenococcus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、柱隔孢屬（Ramularia）的相對豐度逐漸升高，發(fā)酵結束時假單胞菌屬（Pseudomonas）和柱隔孢屬（Ramularia）的相對豐度較大。PCA和LEfSe分析結果表明，蘋果酵素不同發(fā)酵階段的微生物群落差異顯著，且隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中的差異菌屬逐漸增加。蘋果酵素發(fā)酵過程中共檢測出7種有機酸（蘋果酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸和丙酸）、18種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸和γ-氨基丁酸）以及91種揮發(fā)性風味物質(zhì)（酯類、醇類、酸類、酮類、醛類、酚類）。采用雙向正交偏最小二乘法（O2PLS）對微生物菌群與風味物質(zhì)進行相關性分析，結果表明，醋桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、假絲酵母屬和有孢圓酵母屬與蘋果酵素中風味物質(zhì)物質(zhì)的風味形成高度相關，研究結果為篩選產(chǎn)生特征風味和功能物質(zhì)的菌株提供了有力的理論指導，但這并不意味著這些微生物一定會產(chǎn)生風味物質(zhì)，具體代謝途徑還需通過宏基因組學或宏轉(zhuǎn)錄組學進一步深入研究。