郭譯遠(yuǎn) 賢惠敏 Shereen Tan Qiang Fu,4 金鑫 Mark Daniel Greg.G.Qiao 張弘

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科醫(yī)院，哈爾濱 150001；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，哈爾濱 150001；3墨爾本大學(xué)化學(xué)與生物分子工程系，墨爾本 3001；4悉尼理工大學(xué)土木與環(huán)境工程系，悉尼 2000；5澳大利亞眼科研究中心皇家維多利亞眼科耳科醫(yī)院，墨爾本 3002

角膜緣干細(xì)胞移植是治療角膜緣干細(xì)胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency，LSCD)的有效辦法，但是由于自體移植取材受限和異體移植排斥反應(yīng)等問(wèn)題，移植手術(shù)受到較大限制。角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells，LSCs)可分化成角膜上皮細(xì)胞(corneal epithelial cells，CECs)，但手術(shù)、外傷、感染等因素?fù)p傷LSCs后可引起LSCD，導(dǎo)致角膜完整性和透明性的喪失，最終出現(xiàn)角膜結(jié)膜化、血管化等眼表慢性炎癥改變[1-2]。目前，LSCs移植手術(shù)被認(rèn)為是恢復(fù)LSCs儲(chǔ)備、重建眼表結(jié)構(gòu)和治療LSCD的有效辦法。其中，自體角膜緣干細(xì)胞移植不存在免疫排斥，移植成功率高，但是僅適合單眼小范圍損傷的患者，而且也有因手術(shù)操作導(dǎo)致健側(cè)眼出現(xiàn)不可逆損害者。異體角膜緣干細(xì)胞移植治療適合雙眼大范圍損傷的患者，但存在供體角膜源不足、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題[3]。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，利用組織工程的方法體外擴(kuò)增CECs、構(gòu)建上皮移植片為治療LSCD提供了新的途徑，可以有效解決自體和異體角膜緣干細(xì)胞移植的相關(guān)問(wèn)題，為治療LSCD提供了新途徑。載體的正確選擇對(duì)組織工程的成功具有決定意義，目前常用的CECs載體包括羊膜、絲素蛋白膜、膠原水凝膠、殼聚糖水凝膠等[4-5]，這些載體均有透光度較差、供體間差異大、不穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度差等缺點(diǎn)[6-7]，因此尋找一種合適的CECs組織工程載體勢(shì)在必行。研究團(tuán)隊(duì)前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，聚乙二醇水凝膠膜(polyethylene glycol hydrogel films,PHFs)作為一種新型擴(kuò)增載體，具有透光度高、韌性強(qiáng)、免疫排斥反應(yīng)小、制作成本低、可批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[8]，推測(cè)其可作為載體實(shí)現(xiàn)CECs的體外擴(kuò)增，進(jìn)而構(gòu)建工程化角膜上皮，但目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬以PHFs為載體在體外構(gòu)建工程化角膜上皮移植片并進(jìn)行LSCD治療的在體研究，評(píng)估該工程化角膜上皮移植片重建眼表結(jié)構(gòu)的可行性，為臨床上治療LSCD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)新西蘭白兔19只，雌雄不限，體質(zhì)量2～3 kg，兔齡5～6個(gè)月，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研和臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)：2021006)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理原則。

1.1.2主要試劑及儀器 癸二酰氯(sebacoyl chloride，SC)、聚氧乙基甘油醚(glycerol ethoxylate，GE)、聚已酸內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)二醇(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國(guó)Sigma-Chemical公司)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司)；熒光素鈉(天津晶明公司)；小鼠抗角蛋白(AE1/AE3)抗體(北京中山金橋公司)；DAPI(美國(guó)Santa Cruz公司)；小鼠抗p63抗體(ab110038，英國(guó)Abcam公司)；山羊抗小鼠IgG抗體(1583138)、猴抗鼠IgG抗體(1608644)(美國(guó)Life Technologies公司)；妥布霉素地塞米松眼膏(瑞士諾華公司)。掃描電子顯微鏡(PharosG1，荷蘭飛納公司)；手術(shù)顯微鏡(XT-X-8A，湖南梅溪湖新城醫(yī)療投資有限公司)；光學(xué)顯微鏡(Leica DM1000，德國(guó)徠卡公司)；裂隙燈顯微鏡(SL-3G，日本拓普康公司)。

1.2 方法

1.2.1PHFs的合成 將PCL二醇(0.104 g，10 wt% PCL)溶解在二氯甲烷(15 ml)中合成二羥基聚己內(nèi)酯(dihydroxy polycaprolactone，DPCL)溶液，將GE(0.62 ml，0.70 mmol/L)、SC(0.30 ml，1.42 mmol/L)添加到DPCL溶液中，充分混合，室溫靜置1 h。取7.5 ml溶液加入直徑10 cm玻璃培養(yǎng)皿中，置于真空烤箱中60 ℃加熱30 min，取出冷卻1 h至室溫。用無(wú)菌手術(shù)刀將膜的周邊切除，并在培養(yǎng)皿中加入去離子水20 ml，浸泡15 min，用四氫呋喃水代替去離子水(1∶ 1，40 ml)繼續(xù)浸泡。將薄膜取出置于250 ml蒸餾水中，每15 min更換1次洗液，重復(fù)3次，將PHFs在25 kGy的γ輻照下滅菌。

1.2.2PHFs理化性質(zhì)檢測(cè) (1)PHFs厚度 在低真空條件下，將PHFs安裝在碳片上，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察薄膜的水化厚度。使用樣品架調(diào)整傾斜度，觀察PHFs的橫截面。(2)PHFs透光度 將PHFs在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡1 h后置于紫外下照射，記錄在25 ℃條件下290～750 nm的透光度。(3)PHFs機(jī)械拉伸性能 將PHFs置于PBS溶液中膨脹至平衡，切成2 cm×2 cm大小、骨頭形狀的薄膜以評(píng)價(jià)其拉伸性能。在35 ℃水浴溫度下，用50-N測(cè)壓元件以0.1 mm/s速率拉伸被夾住的樣品，直至在測(cè)量區(qū)域發(fā)生斷裂。所有計(jì)算均假設(shè)泊松比為0.5。

1.2.3角膜緣上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取清潔級(jí)新西蘭大白兔4只，以過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死實(shí)驗(yàn)兔，無(wú)菌條件下迅速摘取8只眼球，用PBS反復(fù)沖洗后浸泡于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%青鏈霉素雙抗的PBS中。手術(shù)顯微鏡下，按照無(wú)菌操作原則，再次將角膜組織用含3%青鏈霉素雙抗的PBS沖洗數(shù)次，去除殘留結(jié)膜組織，切取包括Vogt柵欄區(qū)大小約1 mm寬的角膜緣組織，移入超凈臺(tái)內(nèi)，再次用含雙抗的PBS沖洗數(shù)次，用眼科顯微剪切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，正面朝下貼在24孔板內(nèi)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)原代培養(yǎng)，隔日換液。待細(xì)胞爬滿孔底，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞每日生長(zhǎng)情況。

1.2.4光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞黏附情況 將細(xì)胞分為對(duì)照組和PHFs+CECs組，分別種植于普通96孔板和帶有PHFs的96孔板中，細(xì)胞密度均為30%，24 h后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取3個(gè)相同面積視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.5熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞中角蛋白標(biāo)志物AE1/AE3和干細(xì)胞標(biāo)志物p63的表達(dá) 為了確定原代細(xì)胞培養(yǎng)純度和角膜上皮干性，選擇AE1/AE3和p63染色進(jìn)行驗(yàn)證。待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定15 min，PBS沖洗；封閉液(PBS+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%BSA+體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100)封閉1 h；加入一抗(AE1/AE3、p63)，4 ℃濕盒過(guò)夜，PBS沖洗；加入熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS沖洗；加入DAPI染核15 min，PBS沖洗；甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。陽(yáng)性率根據(jù)熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用免疫組織化學(xué)HSCORE定量法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6MTT法檢測(cè)角膜上皮在PHFs上的增生情況 將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和PHFs+CECs組，其中陰性對(duì)照組將細(xì)胞直接種植在培養(yǎng)皿底，加入普通細(xì)胞培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組將細(xì)胞種植在培養(yǎng)皿后加入含有100 μmol/L H2O2的普通細(xì)胞培養(yǎng)液，PHF+CECs組將細(xì)胞種植在鋪有PHFs的培養(yǎng)皿中用普通細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，各組培養(yǎng)24 h。將相同密度和體積的角膜上皮細(xì)胞懸液分別接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，96孔板周圍用PBS填充，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液10 μl/孔，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜200 μl/孔，室溫下置于低速搖床10 min，測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A490)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7TUNEL法檢測(cè)角膜上皮在PHFs上的凋亡情況 細(xì)胞分組處理同1.2.6。將細(xì)胞用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2封閉10 min，0.1% Triton在4 ℃穿透3 min，加TUNEL反應(yīng)混合液(A液和B液體積比為1∶ 9)于37 ℃避光孵育1 h，DAPI避光染核15 min，熒光顯微鏡下掃描并拍照，根據(jù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.8構(gòu)建LSCD兔模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 取清潔級(jí)新西蘭大白兔15只，在文獻(xiàn)[9]方法的基礎(chǔ)上加以改良建立LSCD模型。以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)全身麻醉實(shí)驗(yàn)兔，每30 min補(bǔ)充2～4 mg/kg。麻醉后置開瞼器，用顯微剪環(huán)形剪去全周角鞏膜緣組織(內(nèi)2 mm至外2 mm，深度100～150 μm)，并用角膜刮匙刮除直徑6 mm范圍的中央角膜上皮。采用隨機(jī)數(shù)字表法將建模成功的實(shí)驗(yàn)兔分為3個(gè)組，每組5只，均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。對(duì)照組為空白對(duì)照，造模后不給予任何處置；PHFs組為陰性對(duì)照，造模后將直徑為12 mm的空PHFs膜置于LSCD兔模型的角膜表面；PHFs+CECs組將CECs傳代后同時(shí)種植于5個(gè)直徑為12 mm的PHFs上構(gòu)建組織工程移植片，細(xì)胞密度為(2 118±32)個(gè)/cm2，隨后將移植片置于LSCD兔模型的角膜表面。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完成處置后在上下眼瞼正中置褥式牽引縫線，并用活結(jié)結(jié)扎行暫時(shí)性眼瞼縫合。各組術(shù)后給予左氧氟沙星滴眼液和地塞米松磷酸鈉滴眼液點(diǎn)眼，每天3次，連續(xù)14 d。

1.2.9熒光素鈉染色法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔角膜缺損面積大小 于手術(shù)當(dāng)日(0 d)及術(shù)后3、5、7、14 d行角膜熒光素鈉染色。實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，松開褥式縫線的線結(jié)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%熒光素鈉溶液10 μl滴加到實(shí)驗(yàn)兔角膜表面，30 s后使用裂隙燈顯微鏡的鈷藍(lán)光觀察染色面積，并行眼前節(jié)照相。熒光素鈉染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)損傷為0分，<1/8損傷面積為1分，≥1/8～<1/4損傷面積為2分，≥1/4～<1/2損傷面積為3分，≥1/2損傷面積為4分[10]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。完成操作后拉攏褥式縫線繼續(xù)閉合眼瞼。

1.2.10蘇木精-伊紅染色檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔角膜上皮組織學(xué)特點(diǎn) 14 d后取下實(shí)驗(yàn)兔角膜行蘇木精-伊紅染色，將組織塊用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定后，依次在100%、100%、95%、80%乙醇，以及二甲苯中脫水、透明。石蠟包埋，切片，然后依次在二甲苯、乙醇中脫蠟、水化，用蘇木素和伊紅染色。接著在不同濃度梯度(100%、100%、95%、80%)的乙醇、二甲苯中脫水透明，甘油封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PHFs的理化特性

PHFs是一種人工合成的透明水凝膠薄膜，由DPCL、GE和SC 3種物質(zhì)在60 ℃下交聯(lián)而成(圖1A)。掃描電子顯微鏡下可見，PHFs表面光滑、截面均一，厚度不超過(guò)150 μm(圖1B)。紫外可見光透過(guò)率觀察進(jìn)一步顯示，當(dāng)光線從紫外光譜移動(dòng)到可見光光譜時(shí)，PHFs在增加透光率方面與人眼角膜相似，在400～700 nm具有>99%的透過(guò)度(圖1C)。此外，拉伸測(cè)試表明，PHFs拉伸度好，能承受約6 MPa的拉力(圖1D)，可滿足手術(shù)操作要求。

圖1 PHFs的合成過(guò)程及理化特性 A：PHFs合成過(guò)程 B：PHFs厚度(標(biāo)尺=200 μm) C：PHFs透光度 D：PHFs的拉伸能力 PCL：聚已酸內(nèi)酯；DCL：二氯甲烷；PHFs：聚乙二醇水凝膠膜Figure 1 Synthesis and physicochemical properties of PHFs A：Synthesis of PHFs B：Thickness of PHFs (bar=200 μm) C：Transmittance of PHFs D：Tensile strength of PHFs PCL:polycaprolactone;DCM:dichloromethane;PHFs：polyethylene glycol hydrogel films

2.2 角膜上皮中角蛋白和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

原代細(xì)胞培養(yǎng)純度和角膜上皮干性檢測(cè)結(jié)果顯示，AE1/AE3染色后，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅色，陽(yáng)性率為(98.60±2.40)%(圖2)；p63染色后，多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色，陽(yáng)性率為(61.20±3.60)%(圖3)。

圖2 原代培養(yǎng)角膜上皮中角蛋白AE1/AE3的表達(dá)(×400，標(biāo)尺=12.5 μm) AE1/AE3染色后，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅色 A：AE1/AE3染色 B：DAPI染色 C：融合圖Figure 2 Expression of keratin AE1/AE3 in primary cultured corneal epithelium (×400，bar=12.5 μm) Red AE1/AE3 staining was seen in cytoplasm of most cells A:AE1/AE3 staining B:DAPI staining C:Overlay

圖3 原代培養(yǎng)角膜上皮中角蛋白p63的表達(dá)(×400，標(biāo)尺=12.5 μm) AE1/AE3染色后，大部分細(xì)胞的細(xì)胞核呈綠色 A：p63染色 B：DAPI染色 C：融合圖Figure 3 Expression of keratin p63 in primary cultured corneal epithelium (×400，bar=12.5 μm)Green p63 staining was seen in nuclei of most cells A:p63 staining B:DAPI staining C:Overlay

2.3 各組PHFs上的細(xì)胞黏附情況比較

細(xì)胞貼壁結(jié)果顯示，PHFs+CECs組和對(duì)照組貼壁細(xì)胞數(shù)分別為(2 282.33±144.00)個(gè)/cm2和(2 148.00±77.60)個(gè)/cm2，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.70，P>0.05)。繼續(xù)培養(yǎng)3 d，可見2個(gè)組細(xì)胞均呈圓形或橢圓形，排列緊密，細(xì)胞形態(tài)及大體數(shù)目均無(wú)明顯差異(圖4)。

圖4 PHFs+CECs組與對(duì)照組細(xì)胞黏附情況比較(×100，標(biāo)尺=200 μm) PHFs+CECs組細(xì)胞貼壁數(shù)目與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異A：對(duì)照組 B：PHFs+CSCs組Figure 4 Cell adhesion in two groups (×100，bar=200 μm) There was no significant difference in the number of adherent cells between control group and PHFs+CECs group A：control group B：PHFs+CSCs group

2.4 各組PHFs的細(xì)胞毒性比較

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PHFs+CECs組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組A490值分別為0.59±0.01、0.65±0.07和0.06±0.04，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.25，P<0.05)，其中PHFs+CECs組和陰性對(duì)照組A490值明顯大于陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，PHFs+CECs組和陰性對(duì)照組無(wú)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照組可見較多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。PHFs+CECs組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率分別為(1.68±0.25)%、(1.17±0.36)%和(62.35±3.68)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.45，P<0.05)，其中PHFs+CECs組和陰性對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組PHFs的細(xì)胞毒性情況比較 A：3個(gè)組A490值比較 F=12.25，P<0.05.與陽(yáng)性對(duì)照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) B：3個(gè)組細(xì)胞凋亡率比較 F=13.45，P<0.05.與陽(yáng)性對(duì)照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=3) C：各組TUNEL染色情況(×400，標(biāo)尺=50 μm) PHFs+CECs組和陰性對(duì)照組均未見細(xì)胞核著染為綠色(TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞)，陽(yáng)性對(duì)照組可見較多細(xì)胞核著染為綠色；所有細(xì)胞核著染為藍(lán)色，3個(gè)組藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)量接近 PHFs：聚乙二醇水凝膠膜；CECs：角膜上皮細(xì)胞Figure 5 Comparison of cytotoxicity of PHFs among three groups A：Comparison of A490 values F=12.25，P<0.05.Compared with positive control group，aP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) B：Comparison of apoptosis rates F=13.45，P<0.05.Compared with positive control group，aP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) C：TUNEL staining (×400，bar=50 μm) Green nuclear staining of TUNEL-positive cells was not seen in PHFs+CECs group and negative control group，and was observed in positive control group.The nuclei of all cells were stained blue，and the number of blue nuclei in the three groups was similar PHFs：polyethylene glycol hydrogel films；CECs：corneal epithelial cells

2.5 各組LSCD實(shí)驗(yàn)兔角膜缺損面積和角膜上皮組織學(xué)特點(diǎn)比較

熒光素染色結(jié)果顯示，造模前，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)兔眼表均未見熒光染色；手術(shù)當(dāng)日(0 d)，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)兔眼表滿布綠色熒光，證明LSCD模型造模成功。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，各組角膜熒光素鈉染色評(píng)分均降低，對(duì)照組、PHFs組和PHFs+CECs組角膜熒光素鈉染色評(píng)分依次降低，3個(gè)組不同時(shí)間點(diǎn)熒光素鈉染色評(píng)分總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分組=41.81，P<0.01；F時(shí)間=42.52，P<0.01)，其中對(duì)照組術(shù)后7 d角膜熒光素鈉染色評(píng)分明顯低于術(shù)后3 d，PHFs組術(shù)后0、3、7、14 d角膜熒光素鈉染色評(píng)分均較前一時(shí)間點(diǎn)明顯降低，PHFs+CECs組熒光素鈉染色評(píng)分術(shù)后3 d較術(shù)后0 d、術(shù)后7 d較術(shù)后3 d均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；術(shù)后3、7、14 d，PHFs+CECs組熒光素鈉染色評(píng)分均明顯低于對(duì)照組和PHFs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖6A，表1)。

圖6 各組LSCD兔角膜缺損面積和角膜上皮組織學(xué)特點(diǎn)比較 A：造模前，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)兔眼表均未見熒光染色；手術(shù)當(dāng)日(0 d)，3個(gè)組實(shí)驗(yàn)兔眼表布滿綠色熒光，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，各組角膜熒光染色逐漸減少 B：對(duì)照組結(jié)膜重度水腫，出現(xiàn)大量分泌物，角膜混濁呈白色，虹膜窺不清；PHFs組結(jié)膜輕度水腫，角膜彌漫水腫，虹膜輕度充血；PHFs+CECs組結(jié)膜無(wú)水腫，角膜局部水腫，虹膜正常 C：蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，對(duì)照組存在較少形狀不規(guī)則的角膜上皮細(xì)胞，PHFs組一些區(qū)域出現(xiàn)單層稀疏的角膜上皮細(xì)胞；PHFs+CECs組角膜上皮覆蓋范圍最大，細(xì)胞層數(shù)增加到3～5層，形態(tài)較規(guī)則，排列較緊密(×100，標(biāo)尺=150 μm) PHFs：聚乙二醇水凝膠膜；CECs：角膜上皮細(xì)胞Figure 6 Comparison of corneal defect area and histological characteristics of corneal epithelium in LSCD rabbits A：Before modeling，no luciferin sodium staining was observed on the ocular surface of rabbits in the three groups.On the day of operation (0 d)，the ocular surface of rabbits in the three groups was full of luciferin sodium staining，and the staining decreased gradually with the extension of postoperative time B：In control group，severe conjunctival edema，a large amount of secretions，turbid and white cornea as well as unclear iris were observed.In PHFs group，mild conjunctival edema，diffuse corneal edema and mild iris congestion were seen.In PHFs+CECs group，conjunctival edema was not found,and local corneal edema were seen and iris was normal C：Hematoxylin-eosin staining results showed that there were fewer irregularly shaped corneal epithelial cells in the control group，while a single layer of sparse corneal epithelial cells appeared in some areas of the PHFs group.In the PHFs+CECs group，the corneal epithelium coverage was the largest，and the cell layers increased to 3-5.The morphology was regular and the arrangement was close (×100，bar=150 μm) PHFs：polyethylene glycol hydrogel films；CECs：corneal epithelial cells

表1 各組LSCD實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)角膜熒光素鈉染色評(píng)分比較(x±s,分)Table 1 Comparison of corneal fluorescein sodium staining scores of LSCDrabbits among different groups at different time points (x±s,score)組別樣本量不同時(shí)間點(diǎn)熒光素鈉染色評(píng)分0 d3 d7 d14 d對(duì)照組54.00±0.003.60±0.552.60±0.55b2.00±0.71PHFs組54.00±0.003.40±0.55a2.20±0.45b1.60±0.55cPHFs+CECs組54.00±0.001.80±0.45ade0.60±0.55bde0.20±0.45de 注:F分組=41.81,P<0.01;F時(shí)間=42.52,P<0.01;F交互作用=0.13,P=0.97.與同組0 d比較,aP<0.05;與同組3 d比較,bP<0.05;與同組7 d比較,cP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,dP<0.05;與同時(shí)間點(diǎn)PHFs組比較,eP<0.05(重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩胤讲罘治?LSD-t檢驗(yàn)) LSCD:角膜緣干細(xì)胞缺乏癥;PHFs:聚乙二醇水凝膠膜;CECs:角膜上皮細(xì)胞 Note:Fgroup=41.81,P<0.01;Ftime=42.52,P<0.01;Finteraction=0.13,P=0.97.Compared with the same group at day 0,aP<0.05;compared with the same group at day 3,bP<0.05;compared with the same group at day 7,cP<0.05;compared with control group at corresponding time points,dP<0.05;compared with PHFs group at corresponding time points,eP<0.05 (Two-way re-peated measures ANOVA,LSD-t test) LSCD:limbal stem cell deficiency;PHFs:polyethylene glycol hydrogel films;;CECs:corneal epithelial cells

裂隙燈顯微鏡普通光照下觀察可見，14 d時(shí)對(duì)照組結(jié)膜重度水腫，出現(xiàn)大量分泌物，角膜混濁呈白色，虹膜窺不清；PHFs組結(jié)膜輕度水腫，角膜彌漫水腫，虹膜輕度充血；PHFs+CECs組結(jié)膜無(wú)水腫，角膜局部水腫，虹膜正常(圖6B)。

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，對(duì)照組存在較少形狀不規(guī)則的角膜上皮細(xì)胞，甚至一些區(qū)域未再上皮化，與上述熒光素結(jié)果一致；PHFs組一些區(qū)域出現(xiàn)單層稀疏的角膜上皮細(xì)胞，再上皮化不明顯；PHFs+CECs組角膜上皮的覆蓋范圍最大，細(xì)胞層數(shù)增加到3～5層，形態(tài)較規(guī)則，排列較緊密(圖6C)。

3 討論

組織工程為角膜上皮移植片提供了批量生產(chǎn)的途徑，并且克服了自體移植取材受限和異體移植的排斥反應(yīng)問(wèn)題，是目前較優(yōu)越的治療方法。但是不同的載體各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前組織工程學(xué)常用的載體是羊膜，但羊膜作為一種天然生物材料，各批次之間差異大、存在疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)等[11]。合成生物材料領(lǐng)域中研究較熱的載體包括膠原、絲素蛋白、角蛋白、溫敏材料、殼聚糖等，但存在韌性差、降解過(guò)快、透明度差、強(qiáng)度不足等問(wèn)題[12]。所以，尋找并構(gòu)建一種更適合角膜上皮種子細(xì)胞生長(zhǎng)、生物相容性更高、免疫排斥反應(yīng)更小的載體支架勢(shì)在必行。

本實(shí)驗(yàn)制備了一種超薄PEG水凝膠膜PHFs，從體外和體內(nèi)水平研究了其作為角膜上皮細(xì)胞體外擴(kuò)增的載體并移植用于治療兔LSCD的可行性，結(jié)果顯示PHFs較薄、韌性強(qiáng)、透光度高、安全無(wú)毒、生物相容性好，適合用作角膜上皮移植片；PHFs能夠體外擴(kuò)增、移植角膜上皮并促進(jìn)兔LSCD角膜的再上皮化。

水凝膠是一種具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的親水性多聚物，與細(xì)胞外基質(zhì)成分相似，既能保持一定的形狀，又能吸收大量的水分[13-14]。這種結(jié)構(gòu)使其具有良好的生物相容性，并且對(duì)水溶性代謝產(chǎn)物，如葡萄糖、氧氣等有很高的通透性[15]，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程支架、藥物釋放系統(tǒng)、軟組織替代物等生物領(lǐng)域。水凝膠可分為天然水凝膠和合成水凝膠，天然水凝膠主要包括海藻酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖、膠原、纖維素等[16]，合成水凝膠主要包括聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸-2-羥乙酯等[17-20]。PHFs最重要的組成部分PEG水凝膠具有無(wú)毒、透明、穩(wěn)定、生物相容性好、免疫原性低、抑制非特異性蛋白吸收、融合生物物理和生物化學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn)[21-23]。我們前期利用PHFs體外擴(kuò)增了角膜內(nèi)皮[8]，為進(jìn)一步擴(kuò)增角膜上皮提供了充分的研究基礎(chǔ)。本研究中通過(guò)對(duì)PHFs的理化特性分析可知，合成的PHFs厚度較薄、表面光滑、韌性強(qiáng)、透明度高，滿足了成為合格的眼表載體所需要的物理?xiàng)l件。此外，用于合成PHFs的3種化學(xué)成分癸二酰氯、聚氧乙基甘油醚、聚已酸內(nèi)酯二醇均無(wú)化學(xué)毒性。癸二酰氯是一種二酸，來(lái)自于天然的癸二酸[24]。聚氧乙基甘油醚是一種無(wú)毒的親水性支狀聚合物，由3個(gè)聚乙二醇臂組成，廣泛用于紡織工業(yè)、潤(rùn)滑油、金屬清洗、造紙工業(yè)、印染工業(yè)、石油工業(yè)等。聚已酸內(nèi)酯二醇是一種可生物降解的無(wú)毒性脂肪族聚酯，可賦予材料高拉伸伸長(zhǎng)率性能，已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于人體[5]。本研究體外細(xì)胞毒性和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PHFs及其降解產(chǎn)物不會(huì)對(duì)細(xì)胞增生產(chǎn)生影響。

水凝膠能使細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)是其可以用于組織工程材料領(lǐng)域的關(guān)鍵。本研究角膜緣細(xì)胞黏附測(cè)試結(jié)果表明，在PHFs上和普通培養(yǎng)皿上細(xì)胞貼壁能力相似。以往用PEG作為細(xì)胞載體的研究，由于PEG的抗蛋白特性，在使用PEG材料時(shí)必須加入膠原或其他黏著劑以利于細(xì)胞黏附和貼壁[23]。

構(gòu)建角膜移植片的關(guān)鍵，除了制備具有優(yōu)良特性的載體外，提供優(yōu)質(zhì)的供體細(xì)胞也至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)角膜緣組織的原代培養(yǎng)，提供具有更高干性的角膜上皮細(xì)胞。為了驗(yàn)證供體細(xì)胞的種類和計(jì)算干細(xì)胞比例，使用熒光顏料進(jìn)行角蛋白和干細(xì)胞標(biāo)志物的觀察。AE1/AE3能特異性地識(shí)別包括CK3在內(nèi)的一組酸性角蛋白，在角膜緣處的角膜上皮中呈陽(yáng)性反應(yīng)，在角膜中央處的角膜上皮中呈陰性反應(yīng)[24]。p63是一種觸發(fā)角化細(xì)胞分化的核轉(zhuǎn)錄因子，在角膜中主要表達(dá)于角膜緣上皮的基底層，被認(rèn)為是LSCs的特異性標(biāo)志物[25]。本實(shí)驗(yàn)獲得的供體細(xì)胞是純度較高、干性較強(qiáng)的角膜上皮細(xì)胞，為今后實(shí)驗(yàn)兔眼表角膜上皮的再生可以提供充足的來(lái)源。

LSCs是角膜上皮細(xì)胞再生的來(lái)源，若角膜干細(xì)胞保存完好，則角膜上皮在2～3 d內(nèi)可恢復(fù)完全。因此，本研究選擇在刮除角膜上皮的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步剪除部分角膜緣組織，延緩角膜上皮修復(fù)，利于實(shí)驗(yàn)觀察。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，攜載角膜上皮的PHFs移植片對(duì)上皮缺損的恢復(fù)十分有利，14 d后角膜缺損面積大幅度縮小，剩余約5%，證明角膜上皮細(xì)胞再生能力較強(qiáng)，能覆蓋整個(gè)眼表，形態(tài)正常。此外，角膜水腫、角膜透明度、新生血管程度較對(duì)照組均有所改善，由此證明PHFs是攜載及移植角膜上皮細(xì)胞的優(yōu)良載體，并且對(duì)眼部無(wú)毒性。我們前期將PHFs角膜內(nèi)皮移植片移植到LSCD實(shí)驗(yàn)兔角膜內(nèi)表面，經(jīng)過(guò)28 d的裂隙燈顯微鏡下觀察，亦發(fā)現(xiàn)PHFs內(nèi)皮移植組的角膜依然保持透明，無(wú)角膜水腫等毒性表現(xiàn)[8]。由于在合成生物材料領(lǐng)域中，尚無(wú)已上市、公認(rèn)的眼科材料可以作為陽(yáng)性對(duì)照，所以本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)僅選擇空白PHFs作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，無(wú)上皮細(xì)胞攜載的PHFs移植片雖然對(duì)角膜上皮的恢復(fù)影響不大，但是與對(duì)照組相比，仍能起到一定的修復(fù)作用，推測(cè)與該膜減少了眼瞼摩擦對(duì)角膜上皮再生的損害有關(guān)。

本研究PHFs動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果為日后進(jìn)一步開展LSCD患者的臨床試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。PHFs的使用將在一定程度上緩解角膜供體資源緊張的壓力，擴(kuò)寬角膜移植手術(shù)的思路。此外，PHFs載體的合成為角膜組織工程學(xué)提供了新的依據(jù)，PHFs不僅可以作為其他實(shí)驗(yàn)細(xì)胞移植的載體，還可以作為人工合成載體材料的模板。關(guān)于PHFs的研究尚有很多問(wèn)題有待解決，如PHFs的鏡片含水量、透氧率是否能夠滿足要求，PHFs的降解產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)后是否會(huì)影響其他器官的功能、工程化角膜上皮移植片的免疫排斥等相關(guān)問(wèn)題，我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

利益沖突本研究所有作者均聲明與任何組織或?qū)嶓w無(wú)任何相關(guān)的利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明郭譯遠(yuǎn)：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集整理數(shù)據(jù)、分析解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫；賢惠敏、Shereen Tan、Qiang Fu：參與實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫；金鑫：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)整理；Mark Daniel、Greg.G.Qiao：參與分析解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；張弘：參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱