劉彬，彭正加，梁分鳳，廖俊

(1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 湘潭 411104；2.湘潭市中心醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，湖南 湘潭 411100)

喉癌是最常見的一種頭頸部腫瘤，約占頭頸部腫瘤總數(shù)的四分之一[1]，其中喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)又占喉部惡性腫瘤的90%，在男性中多見[2-3]。目前臨床主要的治療策略是手術(shù)切除聯(lián)合放/化療，但是大多數(shù)的LSCC患者仍存在再次復發(fā)的風險，5年生存率不超過60%[1，4]，治療效果不及預期，因此迫切需要尋找喉癌中新的分子機制以期為LSCC的治療提供新的見解。ECRG4是一種高度保守的抑癌基因，能夠編碼Gauurin、ECLIN等多種生物肽，參與腫瘤抑制、細胞衰老和免疫反應等許多生理現(xiàn)象[5]。ECRG4被激活后從細胞膜上釋放出來，并能在體液中檢測到，是精準醫(yī)學中一個絕佳的候選基因[6]。研究發(fā)現(xiàn)ECRG4的異常表達常受啟動子區(qū)域的甲基化所抑制，ECRG4甲基化水平可能成為胃癌、腎細胞癌診斷或預后評估中的分子標記物[7-8]。而遺憾的是，ECRG4目前鮮有在LSCC中的報道，本次研究通過分析LSCC中ECRG4 mRNA、蛋白以及啟動子甲基化水平，探討ECRG4在LSCC中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 人類蛋白圖譜(human protein atlas，HPA)數(shù)據(jù)庫分析

HPA是人類組織和細胞蛋白質(zhì)分布的最大最全面的數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)[9]，可以運用于腫瘤組織樣本中的蛋白表達分析，本次研究主要通過HPA數(shù)據(jù)觀察ECRG4在不同頭頸部腫瘤組織中的表達情況。

1.2 基因表達譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫

GEPIA是一個基于基因型組織表達(genotype-tissue expression，GTEx)數(shù)據(jù)進行分析的在線工具(http://gepia.cancer-pku.cn)，可以對提交的基因進行差異表達分析、輪廓圖繪制、相關性分析、患者生存分析，相似基因檢測和降維分析等在內(nèi)的全面表達分析[10]，本次研究中主要通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達情況。

1.3 患者樣本

收集湘潭市中心醫(yī)院2017年12月—2018年12月收治的15例原發(fā)LSCC患者的組織樣本及對應的癌旁正常組織樣本(距離病灶>2 cm)，以上患者均經(jīng)過病理學確診。組織樣本經(jīng)生理鹽水清洗后，立即剪切成2～5 mm薄片放入RNALater(SIGMA，R0901)中，4 ℃過夜后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中凍存；剩余組織進行病理分析。一般臨床資料見表1，所有患者術(shù)前6個月未接觸過放/化療，經(jīng)病理科確診，且簽署了完整的知情同意書。

表1 15例LSCC患者的一般臨床資料 (例，%)

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

使用RT-qPCR檢測腫瘤組織和癌旁正常組織中ECRG4 mRNA的相對表達水平，使用Trizol提取組織和細胞中的總RNA，使用瓊脂凝膠電泳以及NanoDrop(Thermo，One)檢測RNA的完整性、純度以及濃度，使用HiFiScriptgDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康為世紀，CW2582M)合成cDNA文庫，使用TB GreenTMPremix DimerEraserTM(TaKaRa，RR091B)在熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems，QuantStudioDx)上檢測ECRG4 mRNA的相對表達量，98 ℃預變性2 min后，98 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，重復40個循環(huán)。以ACTB為內(nèi)參基因，引物序列見表2，采用2-ΔΔCt進行計算。

表2 引物序列

1.5 甲基化特異性PCR(MSP)及ECRG4啟動子甲基化核心區(qū)域測序

首先使用QIAamp DNA 試劑盒(qiagen，51304)提取樣本中的DNA，使用熒光定量儀(Thermo Fisher Scientific，Qubit 3.0)和Nanodrop(進行定量和純度檢驗。使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(Qiagen，59824)對兩組樣品分別進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，60 ℃ 15 min。使用TaKaRaEpiTaqTMHS(TaKara，R110A)對ECRG4啟動子核心區(qū)域(Chr2:106065304-106065523)進行擴增,擴增引物序列如表2所示,98 ℃預變性2 min后，98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重復30 cycles)，72 ℃ 5 min。使用AMPure XP Beads(Beckman，A63881)回收PCR產(chǎn)物。使用Ion Plus Fragment Library Kit(Thermo Fisher Scientific，4471252)對擴增產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建。經(jīng)Agilent2100 和KAPA Library Quantification Kit(KAPABiosystems，KK4827)進行文庫質(zhì)檢和精確定量后，使用Ion PI Hi-Q OT2 Kit(Thermo Fisher Scientific，A26434)制備模板。使用Ion PI Hi-Q Sequencing200 Kit(Thermo Fisher Scientific，A26433)和Ion PI V3芯片在Ion Torrent Proton平臺進行測序并讀取ECRG4啟動子甲基化水平。

1.6 Western blot

使用蛋白提取試劑盒(Solarbio，BC3790)抽提組織中的總蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒(Gbcbio，G3522)對蛋白進行定量，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下使用5% BSA(Solarbio，A8010)進行封閉2 h，TBST(Solarbio，T1081)洗滌，加入稀釋好的一抗(abcam，ab224077)，4 ℃孵育過夜，TBST再次洗滌，加入相應二抗(ab205719)進行孵育，沖洗3次，每次10 min，最后使用ECL化學發(fā)光試劑盒(Solarbio，SW2010)進行檢測。使用GAPDH(ab8245)為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌中低表達

通過HPA數(shù)據(jù)庫觀察ECRG4的表達情況，如圖1A所示，在病理模塊中，頭頸部鱗狀細胞癌中幾乎檢測不到ECRG4的表達，而在頭頸部腺癌中，ECRG4表現(xiàn)出中等強度的信號(圖1B)。進一步使用GEPIA在線工具分析ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達(圖1C)，結(jié)果表明，ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤組織中的表達明顯較正常組織中低(P<0.05)。

圖1 ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌中低表達 A：HPA數(shù)據(jù)庫分析ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌中組織的表達； B：HPA數(shù)據(jù)庫分析ECRG4在頭頸部腺癌組織中的表達； C：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析ECRG4在頭頸部鱗狀細胞癌腫瘤組織以及正常組織中的表達 注：HNSC(頭頸部鱗狀細胞癌)。

2.2 ECRG4在LSCC中表達下調(diào)

使用RT-qPCR檢測ECRG4 mRNA在LSCC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達，與癌旁正常組織相比，ECRG4在腫瘤組織中的表達下調(diào)(P<0.05)，進一步使用Western blot檢測組織中的蛋白表達，結(jié)果表明ECRG蛋白在腫瘤組織的表達較癌旁正常組織中低，詳見圖2。

圖2 ECRG4在LSCC中表達下調(diào) 2A:RT-qPCR檢測ECRG4 mRNA在LSCC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達； 2B:Western blot檢測ECRG4蛋白在LSCC患者腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達 圖3 LSCC中ECRG4啟動子甲基化水平升高

2.3 LSCC中ECRG4啟動子甲基化水平升高

使用MSP及核心區(qū)域測序檢測ECRG4啟動子甲基化水平，如圖3中所示，LSCC腫瘤組織中的甲基化水平明顯高于癌旁正常組織中，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 ECRG4的mRNA表達及甲基化水平與患者臨床病理特征之間的關系

綜合15例LSCC患者的一般臨床資料，總結(jié)ECRG4的mRNA表達及甲基化水平與患者臨床病理特征之間的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECRG4 mRNA表達與患者的臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、復發(fā)、病理學之間存在相關性，Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴轉(zhuǎn)移、復發(fā)以及G2、G3期的患者腫瘤組織中ECRG4 mRNA表達更低(P<0.05)。而Ⅲ、Ⅳ期、復發(fā)以及G2、G3期的患者腫瘤組織中的ECRG4啟動子甲基化水平升高更明顯(P<0.05)，詳見表3。

表3 ECRG4的mRNA表達及甲基化水平與患者臨床因素之間的關系

3 討論

我們本次研究首先通過HPA和GEPIA數(shù)據(jù)庫確定了ECRG4在頭頸部腫瘤中的表達，發(fā)現(xiàn)其在頭頸部鱗狀細胞癌中表達較其他組織類型和正常組織中下降明顯。然后對收集來的LSCC患者的腫瘤組織和正常組織進行RT-qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)ECRG4 mRNA在腫瘤組織中低表達，Western blot實驗結(jié)果進一步在蛋白水平上證明了這一點。

ECRG4，又稱C2orf40，其長度為12.5kb，位于染色體2q12.2上，由4個外顯子組成，編碼148個氨基酸殘基的多肽，大量研究報道，ECRG4在食管鱗癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中表達下調(diào)[11]。而ECRG4編碼的蛋白前體也在各種上皮惡性腫瘤中表觀遺傳沉默，其組成性分泌并束縛在上皮細胞或循環(huán)白細胞的細胞表面[12]。Cai等[13]將ECRG4轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細胞中后，使用MTT、平板克隆和Annexin/PI雙染法觀察細胞的生物學功能變化，并在裸鼠體內(nèi)進行致瘤效應檢測，結(jié)果表明，ECRG4的過表達通過減少腫瘤體積和重量以及誘導腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤的發(fā)生，其可能是結(jié)直腸癌患者治療的潛在靶點。除此之外，另有研究發(fā)現(xiàn)在人LSCC細胞Hep-2中過表達ECRG4后，細胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制，NF-κB p65蛋白表達下調(diào)，ECRG4通過NF-κB信號通路介導Hep-2 EMT進程，抑制LSCC的轉(zhuǎn)移[14]。這也從側(cè)面輔證了我們的研究結(jié)果：ECRG4在LSCC中表達下調(diào)。

DNA甲基化是一個可以通過細胞分裂遺傳的穩(wěn)定表觀遺傳標記，但是在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，由于染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子突變或解除管制，特定DNA會發(fā)生甲基化水平的變化，甲基化水平的差異也可以作為腫瘤診斷和藥物治療的有力分子標記[15]。ECRG4基因表達下調(diào)主要歸因于ECRG4啟動子的的5個非翻譯區(qū)中CpG島的甲基化，其核心啟動子序列包含幾個CpG島、多個重疊的Sp1共有結(jié)合序列和一個假定的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB, NF-κB)激活結(jié)合位點。ECRG4轉(zhuǎn)錄從ECRG4開放閱讀框起始ATG的11位胍基起始。雖然在此翻譯起始位點的5 ’UTR中有一個遠端TATA序列，這也被確定為超甲基化的目標序列，因為編碼ECRG4啟動子的質(zhì)粒的體外甲基化消除了啟動子的活性，用甲基化抑制劑5-AzaC處理后會增加內(nèi)源性ECRG4的表達[16]。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)LSCC腫瘤組織中啟動子甲基化水平較正常組織中升高，這也說明可能正是由于ECRG4啟動子導致ECRG4表達下降。

另外通過比較不同臨床病理特征的患者中的ECRG4 mRNA表達及甲基化水平，ECRG4 mRNA低表達與患者的臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移、復發(fā)、病理學之間存在相關性，而Ⅲ、Ⅳ期、復發(fā)以及G2、G3期的患者腫瘤組織中的ECRG4啟動子甲基化水平升高更明顯。研究發(fā)現(xiàn)ECRG4也是鼻咽癌患者的獨立預后因素，ECRG4在鼻咽癌患者血清中的低表達與TNM高分期、轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床特征之間具有顯著的相關性[17]。另外在卵巢癌、食管癌、胃癌等相關ECRG4基因啟動子甲基化的研究中發(fā)現(xiàn)，正常組織中ECRG4甲基化水平往往較低[18-20]，并且ECRG4基因甲基化檢出率與胃癌患者的病理分期相關，與患者的年齡、性別及淋巴轉(zhuǎn)移無關[20]，暗示ECRG4表達及甲基化水平能夠反映一定的疾病進展。

綜上所述，ECRG4在LSCC腫瘤組織中mRNA和蛋白表達水平下降，而甲基化水平升高，其表達及甲基化水平與患者的Ⅲ、Ⅳ期、復發(fā)以及G2、G3期的患者相關，有望為LSCC的治療和研究提出新的分子靶點。