王鈺琪，任靖宜，康小文

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，哈爾濱150081

結(jié)核病是一種歷史悠久的慢性傳染病，可分為肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病，其致病菌為結(jié)核分枝桿菌(MTB)。由于肺結(jié)核的非特異性癥狀和體征通常與常見的肺部感染重疊，因此診斷相對困難，迫切需要快速且無假陽性的診斷方法以準確地區(qū)分肺結(jié)核與其他常見的肺部感染，減少與結(jié)核相關的死亡[1-2]。傳統(tǒng)的結(jié)核病病因?qū)W診斷有痰涂片及MTB培養(yǎng)檢測法。痰涂片是一種廣泛用于檢測抗酸分枝桿菌以診斷結(jié)核病的方法，然而這種方法靈敏度低,不能將MTB與其他抗酸桿菌區(qū)分開來；MTB培養(yǎng)檢測法是傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷金標準，其敏感度較高，但周轉(zhuǎn)時間長、通量低、實驗室生物安全要求苛刻，不能快速診斷結(jié)核病。這些傳統(tǒng)方法雖然可以識別活動性結(jié)核病，但對潛伏性結(jié)核病的檢測并不令人滿意。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，分子生物學技術(shù)可以促進結(jié)核病的診斷。分子檢測方法通常被稱為核酸擴增實驗，依賴于MTB復合體的靶向遺傳區(qū)域的擴增，通常通過PCR技術(shù)實現(xiàn)。Xpert是一種快速分子檢測手段，用于檢測MTB復合體的DNA及與耐藥性相關的基因突變，于2010年被世界衛(wèi)生組織推薦對有結(jié)核病癥狀和體征的患者做初步診斷并被用于耐藥性監(jiān)測。相比于傳統(tǒng)的涂片及培養(yǎng)檢查，Xpert敏感度更高、檢測時間更短、用于檢測的標本更多樣，并可以檢測是否為耐藥結(jié)核病[3]。但Xpert對肺外標本的MTB檢測靈敏度有限，并且在不同類型的標本中存在很大差異[4]。近年來二代測序技術(shù)(NGS)的快速發(fā)展使其在多種傳染病中被用于疾病診斷、病原體鑒定、耐藥性測定和疫情調(diào)查，綜合數(shù)據(jù)來看其精確度較高[5]?；贜GS發(fā)展的感染性疾病病原體檢測技術(shù)主要包括宏基因組測序(mNGS)、全基因組測序(WGS)以及擴增子測序(以16 S rRNA和ITS測序為代表)等。本文就NGS在結(jié)核病病原學診斷、耐藥性檢測及流行病學監(jiān)測中的應用研究進展做一綜述。

1 NGS在結(jié)核病病原學診斷中的應用

2017年，英格蘭率先將NGS用于結(jié)核病診斷、耐藥性檢測和MTB分型。相較于傳統(tǒng)檢測方法，NGS具有周期短、無偏倚、靈敏度高、覆蓋率高的特點，因而對病原體，尤其是少見病原體的診斷有重要意義。其可避免傳統(tǒng)診斷時各種病原體之間互相影響從而影響診斷結(jié)果的準確性，并且可以將標本中存在的核酸全部檢測出來，提高了檢測效率。在混合感染中，NGS可以快速準確地識別標本中的所有病原體，指導臨床診斷治療。

mNGS是一種無偏性測序方法，理論上可以檢測出臨床樣本中的所有病原體，尤其適用于復雜感染性疾病的罕見和非典型病因[6]。mNGS作為一種檢測感染性疾病病原體的新方法已被廣泛應用，但其在結(jié)核快速診斷中的價值尚未得到大樣本驗證。ZHOU等[7]對105例疑似活動性結(jié)核病感染患者的痰液、腦脊液、膿液等樣本進行了同步結(jié)核培養(yǎng)、Xpert和mNGS檢測，根據(jù)臨床最終診斷結(jié)果得出結(jié)論，mNGS敏感度為44%，略高于Xpert的42%，但遠高于傳統(tǒng)方法(29%)。該研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)合Xpert和mNGS兩種診斷方法，預測活動性結(jié)核病的敏感度可上升至60%。CHEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，mNGS在臨床疑為結(jié)核感染的患者中顯示出比傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert檢測更好的診斷性能,尤其是在肺標本中，其預測結(jié)核感染的敏感度優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)和Xpert。在肺外結(jié)核的診斷方面，mNGS也體現(xiàn)出了其特有的優(yōu)勢。結(jié)核性腦膜炎(TBM)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病，也是最致命的結(jié)核病感染形式，及時診斷及治療可顯著降低其病死率。YAN等[9]對腦脊液標本進行了mNGS和傳統(tǒng)檢測方法的TBM檢測，發(fā)現(xiàn)mNGS敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為84.44%、100%、100%、46.15%，mNGS診斷TBM的敏感度高于AFB(抗酸桿菌)涂片、培養(yǎng)法、MTB PCR法及Xpert。

研究顯示，將mNGS與Xpert或培養(yǎng)法結(jié)合在鑒定MTB感染中顯示出突出的優(yōu)勢。SHI等[10]對116名懷疑有活動性結(jié)核感染的患者進行了支氣管鏡檢查及臨床灌洗液或其他組織標本的Xpert和mNGS檢測，發(fā)現(xiàn)在結(jié)核病診斷性能方面，mNGS對所有活動性結(jié)核病病例的灌洗液樣品顯示出47.92%的敏感度，與Xpert(45.83%)和培養(yǎng)法(46.81%)相似，但遠高于傳統(tǒng)的抗酸染色檢查(29.17%)。而將mNGS和Xpert聯(lián)合應用于對灌洗液樣品的檢測，其診斷MTB的敏感度為56.25%，這表明mNGS和Xpert相結(jié)合有助于提高MTB臨床診斷的準確度。WANG等[11]回顧了23例來對腦脊液樣本進行mNGS和傳統(tǒng)病因?qū)W檢查的TBM病例，試圖說明mNGS在TBM早期診斷中的可行性，并評估所有方法之間的敏感度和特異度。結(jié)果顯示，mNGS在18例病例中鑒定出了映射到MTB復合體的DNA序列，包括MTB、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌和稻曲霉。在所有方法中，mNGS的靈敏度最高，而mNGS和傳統(tǒng)培養(yǎng)法的組合可提高檢測率。

抗生素治療是降低病原體檢測陽性率的常見原因，傳統(tǒng)的培養(yǎng)或涂片檢查方法取決于標本中是否存在活菌，而抗生素對活菌具有一定的殺滅作用，可能導致傳統(tǒng)檢測方法檢出率下降。mNGS是基于病原體DNA檢測的分子方法，因此對病原學的檢測受治療影響較小。研究表明，抗生素治療后的肺外結(jié)核患者和抗生素治療前的肺外結(jié)核患者之間的mNGS檢測率沒有明顯差異，驗證了該觀點[4]。

2 NGS在結(jié)核病耐藥性檢測中的應用

耐藥性的出現(xiàn)對全球結(jié)核病控制工作構(gòu)成了挑戰(zhàn)，嚴重阻礙了疾病的治愈。目前，治療結(jié)核病的一線藥物包括利福平(RIF)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺(PYZ)。耐藥結(jié)核病可分為單耐藥(INH或RIF)、耐多藥(INH和RIF)、廣泛耐藥(INH、RIF、氟喹諾酮類和注射用氨基糖苷類)結(jié)核病。相關數(shù)據(jù)顯示，耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病的治療成功率分別為54%和30%，而耐藥結(jié)核病的治療總成功率為83%。全面、及時的藥敏檢測對于指導耐藥結(jié)核病的治療至關重要，因此，需要改進檢測工具來指導患者的治療選擇。傳統(tǒng)的表型檢測無法區(qū)分MTB和其他分支桿菌，靈敏度為30%～60%，不足以滿足臨床需求。世界衛(wèi)生組織推薦了許多用于診斷耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病的基因型檢測，包括核酸擴增檢測和Xpert等。然而，這些檢測只能針對少數(shù)基因的重點區(qū)域來檢測，可檢測的耐藥藥物數(shù)量也有限，并不能報告耐藥性所依據(jù)的確切核苷酸變化，而NGS的數(shù)據(jù)可以篩選所有的耐藥決定因素，具有更高的敏感度。大量研究表明，NGS在分枝桿菌鑒定和耐藥性測試方面可能比傳統(tǒng)方法更快、更具成本效益[12]。一項前瞻性研究對777個MTB分離株進行了分析并將WGS對4種一線藥物的表型敏感度進行了測試，發(fā)現(xiàn)WGS對INH、RIF、EMB和PYZ耐藥性預測的敏感度分別為93.1%、100%、100%和81.8%[13]。SHEA等[14]研究顯示，WGS對RIF、卡那霉素和氟喹諾酮類藥物的表型耐藥敏感度為100%，對INH、EMB、PYZ、鏈霉素和乙硫酰胺的敏感度分別為87%、79%、86%、73%和62%，并且預測以上藥物耐藥性的特異度超過97%。靶向下一代測序(tNGS)可從患者痰液樣本中對MTB進行藥物敏感度測試，能夠更全面地分析基因組耐藥相關變異，可用于臨床診斷耐藥結(jié)核病。HE等[15]研究表明，tNGS診斷結(jié)核病耐藥性的總體陽性率為83.3%，高于抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)法、TB-DNA擴增檢測、TB-RNA擴增檢測、MGIT 960快速培養(yǎng)藥敏，甚至T細胞斑點檢測。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，使用NGS進行基因型耐藥性預測具有良好的性能，特別是對最重要的一線藥物INH和RIF，INH靈敏度和特異度分別為97.5%和99.6%，RIF為100%和99.2%[16]。PAPAVENTSIS等[17]對NGS檢測MTB耐藥性進行了系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)其靈敏度及特異度均較高，與上述結(jié)論相符。

3 NGS在結(jié)核病流行病學監(jiān)測中的應用

WGS的優(yōu)勢在于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的標志物以進行流行病學監(jiān)測或臨床診斷，在結(jié)核病中，其比傳統(tǒng)流行病學監(jiān)測方法具有更高的分辨率。有研究對烏茲別克斯坦的兩種MTB菌株進行流行病學分析發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)流行病學標記法的檢測下，兩種菌株幾乎完全相同；而WGS數(shù)據(jù)顯示，菌株之間具有數(shù)十個單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異，這提示應用WGS可以提供比其他分子標記更高的分辨率[18]。WGS的另一個重要應用是能夠檢測同一患者中由于合并感染或由于同一菌株感染而引起的原發(fā)性結(jié)核復發(fā)的頻率，該作用在公共衛(wèi)生干預以及檢測爆發(fā)和傳播事件中的實用性已得到證實。從全球角度來看，WGS能夠以前所未有的分辨率檢測MTB中的遺傳多樣性。WGS可以識別不同菌株之間的SNP，這在嘗試區(qū)分再感染引起的臨床復發(fā)時起到關鍵作用。WITNEY等[19]使用24位點MIRU-VNTR基因多拷貝數(shù)快速檢測分析法、間隔區(qū)寡核苷酸分型法和WGS對36名治療前后培養(yǎng)陽性的MTB患者的菌株進行了分型，發(fā)現(xiàn)WGS識別出一對具有中等數(shù)量SNP差異(大于5)并將此歸類為復發(fā)，而另外兩種檢測方法無法做到這一點，提示W(wǎng)GS可以更準確地評估初次合并感染、復發(fā)或再感染的病例。WALKER等[20]發(fā)表了基于WGS的大規(guī)模結(jié)核病傳播研究，該研究顯示，WGS相比于以往的菌株分型方法可以更準確地識別屬于暴發(fā)的病例，從而證實了WGS在流行病學監(jiān)測中應用的優(yōu)越性。

綜上所述，NGS作為一種新型檢測方法，在結(jié)核病的病原學診斷、耐藥性檢測及流行病學監(jiān)測中發(fā)揮出較大價值。mNGS可以檢測出臨床樣本中的所有病原體，在對MTB的病原體診斷與鑒別診斷方面具有一定的優(yōu)勢；WGS及tNGS可以篩選更多的耐藥基因，在結(jié)核病的耐藥性檢測方面具有更高的敏感度；且WGS可以提供比以前的分子標記更高的分辨率，正在成為結(jié)核病分子流行病學監(jiān)測的新金標準。臨床上將NGS與培養(yǎng)或Xpert相結(jié)合可提高結(jié)核病的診斷效率，并為耐藥菌株的檢測及藥物的選擇提供依據(jù)。但NGS在結(jié)核病快速診斷中的價值尚未得到大樣本驗證，缺乏統(tǒng)一的指控標準及流程，臨床解讀NGS報告的指南仍需完善。在臨床應用中，NGS仍然需要提高檢測可靠性、解決背景菌干擾問題、降低檢測成本。未來NGS有望成為病原學診斷及治療的關鍵技術(shù),從而幫助臨床醫(yī)生做出更明智的治療相關決策。