張子威，張文濤，毛衛(wèi)浦，姚旭東

1同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院泌尿外科，上海200072；2海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院泌尿外科；3東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科

膀胱癌是全球最普遍的惡性腫瘤之一，我國膀胱癌的患病率和病死率仍居高不下。根據(jù)膀胱癌的臨床TNM分期，可以將膀胱癌分為非肌層侵潤型膀胱癌、肌層侵潤型膀胱癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌。在過去幾十年中，晚期膀胱癌的治療方案都以聯(lián)合化療為主，但是其整體存活率一直不理想[1-2]。近年來，免疫治療在晚期膀胱癌的治療中取得了突破性進(jìn)展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)的出現(xiàn)給晚期膀胱癌患者的治療帶來了希望。但如何精準(zhǔn)識(shí)別對(duì)免疫治療敏感的優(yōu)勢人群仍是目前亟待解決的問題。用于晚期膀胱癌免疫治療反應(yīng)的相關(guān)生物標(biāo)志物大致分為三類：第一類是與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物，如腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤基因突變負(fù)荷、DNA損傷修復(fù)、分子分型等；第二類是與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的標(biāo)志物，如腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)、程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)等；第三類是與液體活檢相關(guān)的標(biāo)志物，如游離DNA(cfDNA)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)等?，F(xiàn)將晚期膀胱癌免疫治療過程中可能存在的生物標(biāo)志物綜述如下。

1 腫瘤細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物

1.1 腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 腫瘤內(nèi)異質(zhì)性是指腫瘤細(xì)胞在其分子特征上不同，表現(xiàn)為同一腫瘤在不同時(shí)空可以存在多種不同基因型或亞型的細(xì)胞，這與癌癥的進(jìn)展、治療抵抗和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3]。由此可以解釋，在臨床中，為何同一腫瘤在不同個(gè)體上甚至在同一個(gè)體不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上的免疫治療效果卻千差萬別。具有高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的患者對(duì)治療反應(yīng)更差，這可能是腫瘤患者臨床預(yù)后不佳的一個(gè)標(biāo)志物[4]。有學(xué)者認(rèn)為，高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性有利于免疫逃避，是因?yàn)樾驴乖瓟?shù)量越多，免疫反應(yīng)就相對(duì)越差[5]。一項(xiàng)對(duì)6種腫瘤的249例患者進(jìn)行全外顯子組測序的研究顯示，在膀胱癌中，具有高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(>50%亞克隆突變)的腫瘤對(duì)ICI無反應(yīng)相關(guān)，并且與腫瘤細(xì)胞突變相關(guān)的特征往往是相互關(guān)聯(lián)的[6]。晚期膀胱癌是一種具有高度異質(zhì)性的腫瘤，通過液體活檢和單細(xì)胞測序等技術(shù)來破譯膀胱腫瘤的異質(zhì)性并揭示其潛在的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。

1.2 腫瘤基因突變負(fù)荷 腫瘤基因突變負(fù)荷是指腫瘤細(xì)胞中每兆基因編碼區(qū)發(fā)生突變的總數(shù)，其在不同腫瘤、不同患者之間有很大的差別[7]。具有高腫瘤基因突變負(fù)荷的腫瘤患者，其同一節(jié)段外顯子編碼區(qū)中的突變堿基更多，可以產(chǎn)生更多的新抗原被抗腫瘤T淋巴細(xì)胞識(shí)別，從而激發(fā)抗腫瘤的免疫效應(yīng)。突變相關(guān)新抗原是由非同義突變產(chǎn)生的突變蛋白，其免疫原性比其非突變的對(duì)應(yīng)物更強(qiáng)。

生物信息學(xué)研究顯示，在膀胱癌中，高腫瘤基因突變負(fù)荷組傾向于促進(jìn)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的滲透，腫瘤基因突變負(fù)荷較高的患者更有利于進(jìn)行免疫治療[8]。由此推測，高腫瘤基因突變負(fù)荷一方面可能與新抗原的存在有關(guān)，另一方面可能與腫瘤基因突變負(fù)荷相關(guān)基因引起腫瘤微環(huán)境的變化相關(guān)。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，高腫瘤基因突變負(fù)荷膀胱癌患者的病理緩解率更高，對(duì)于抗派姆單抗臨床治療的效果更好[9]。然而在有些腫瘤中，一些低腫瘤基因突變負(fù)荷的患者中也觀察到了對(duì)ICI的反應(yīng)，即反應(yīng)者與無反應(yīng)者之間的腫瘤基因突變負(fù)荷范圍存在著顯著重疊[10]。也就是說，客觀的腫瘤反應(yīng)并不是完全由體細(xì)胞突變所驅(qū)動(dòng)，基因組或非基因組的特征改變也參與了抗腫瘤免疫反應(yīng)。

由于目前在臨床中的檢測手段還不夠成熟、臨界值的界定還不夠明確以及腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性等因素的限制，使腫瘤基因突變負(fù)荷在臨床應(yīng)用中作為免疫治療的標(biāo)志物還面臨諸多困難。

1.3 DNA損傷修復(fù) DNA損傷修復(fù)在癌癥進(jìn)展中非常重要，當(dāng)其調(diào)節(jié)失敗時(shí)，會(huì)導(dǎo)致更高的基因組不穩(wěn)定性、突變率增加和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性增強(qiáng)[11]。DNA損傷修復(fù)機(jī)制中的缺陷，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)/錯(cuò)配修復(fù)缺陷(dMMR)、DNA聚合體突變等。WANG等[12]通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析DNA聚合酶ε/DNA聚合酶δ1(POLE/POLD1)在不同類型癌癥患者中的突變水平，結(jié)果顯示，非黑色素瘤皮膚癌患者的突變水平最高，膀胱癌患者的突變水平排在第5位，并且這些突變患者的腫瘤基因突變負(fù)荷明顯高于沒有突變的患者。

已有研究表明，在晚期膀胱癌患者中，DNA損傷修復(fù)基因突變可提高對(duì)順鉑化療的敏感性[13]。一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)納入60例晚期膀胱癌患者，給予PD-1/PD-L1抑制劑后，在已知的或未明確的DNA損傷修復(fù)基因突變患者中，客觀緩解率均明顯高于沒有DNA損傷修復(fù)突變的患者[14]，這表明DNA損傷修復(fù)改變對(duì)晚期膀胱癌的免疫治療具有預(yù)測價(jià)值。VIDOTTO等[15]報(bào)道，DNA損傷修復(fù)基因突變與肌層浸潤性膀胱癌中腫瘤免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)有關(guān)，包括PD-1、PD-L1、IDO1、TIGIT、TIM-3、TGFB1、LAG3等，這表明某些特定DNA損傷修復(fù)基因的突變對(duì)免疫治療具有特殊的指導(dǎo)意義。

膀胱癌的生物學(xué)進(jìn)展常伴隨多種DNA損傷修復(fù)基因的突變，因此，將DNA損傷修復(fù)缺陷狀態(tài)同其他腫瘤細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志物一起進(jìn)行研究可以更好地預(yù)測對(duì)ICI的反應(yīng)性。

1.4 分子分型 基因突變是否產(chǎn)生腫瘤新抗原不僅取決于突變的數(shù)量，與突變的類型也密切相關(guān)。根據(jù)膀胱癌的分子特點(diǎn)不同，膀胱癌的分子分型方法主要包括北卡羅來納大學(xué)(UNC)二分法、基因組圖譜(TCGA)四分法、安德森癌癥中心(MDA)三分法以及隆德大學(xué)(Lund)五分法。

一項(xiàng)PD-L1抑制劑阿特珠單抗在晚期膀胱癌中的Ⅱ期研究顯示，TCGA四分法中的管腔樣Ⅱ亞型患者有效率最好，為34%，而管腔樣Ⅰ亞型患者有效率最差，為10%[16]。與之類似的另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，盡管CD8+效應(yīng)基因表達(dá)在基底Ⅲ/Ⅳ亞型中升高，但與管腔樣Ⅱ亞型相比，其反應(yīng)率降低，強(qiáng)烈提示還存在其他免疫抑制因子在不同分型中發(fā)揮作用[17]。一項(xiàng)來自368個(gè)膀胱腫瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，“基因組不穩(wěn)定”的Lund亞型分類對(duì)免疫療法的反應(yīng)性最佳[18]。其潛在的機(jī)制可能是與低水平的TGF-β表達(dá)和高突變/新抗原負(fù)荷相關(guān)，更大規(guī)模的臨床研究和分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。MC CONKEY等[19]則指出，在MDA三分法中p53樣型膀胱癌患者對(duì)化療明顯耐藥，提示對(duì)于p53樣型膀胱癌患者可優(yōu)先考慮免疫治療方案。膀胱癌的分子分型對(duì)進(jìn)一步了解膀胱癌患者的潛在免疫生物學(xué)特性以及開發(fā)合理的序貫治療策略具有重要意義。

2 腫瘤微環(huán)境相關(guān)的標(biāo)志物

2.1 TILs TILs是存在于腫瘤微環(huán)境中的一群高度異質(zhì)性免疫細(xì)胞，以CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞為主。TILs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，與許多腫瘤的免疫治療反應(yīng)及預(yù)后相關(guān)。LEKO等[20]報(bào)道，從5例膀胱癌患者的腫瘤組織中分離、培養(yǎng)TILs，發(fā)現(xiàn)1例之前接受過卡介苗治療的患者CD4+TILs亞群特異性識(shí)別了轉(zhuǎn)錄抑制因子CTBP1中的一個(gè)突變點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)提示，新抗原反應(yīng)性TILs存在于膀胱癌中，也就是說TILs升高有可能是膀胱癌患者對(duì)免疫治療敏感的一個(gè)標(biāo)志。此外，在包括IMvigor210在內(nèi)的研究中顯示，TILs的存在也預(yù)示著尿路上皮癌對(duì)ICI的反應(yīng)有利[21]。TILs亞群與免疫治療的預(yù)后也具有相關(guān)性，CD8+TILs的存在與肌肉浸潤性尿路上皮癌患者的生存率提高有關(guān)，而免疫抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的存在與其生存率降低相關(guān)[22]。因此，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的數(shù)量和亞群對(duì)免疫治療的臨床獲益密切相關(guān)。

臨床中，腫瘤免疫微環(huán)境的改變對(duì)膀胱癌的治療具有重要的指導(dǎo)意義。由此推測，將腫瘤微環(huán)境中的標(biāo)志物和腫瘤細(xì)胞本身的相關(guān)標(biāo)志物結(jié)合，可能對(duì)免疫治療具有更強(qiáng)的陽性預(yù)測價(jià)值。

2.2 PD-L1 PD-L1是目前研究最為廣泛的免疫抑制劑預(yù)測性生物標(biāo)志物，其表達(dá)情況通常以陽性表達(dá)率來表示。在一項(xiàng)單臂Ⅱ期KEYNOTE-052臨床試驗(yàn)中顯示，在順鉑不耐受的晚期膀胱癌患者中，派姆單抗具有持久的臨床反應(yīng)，并與總生存期延長相關(guān)，尤其是在PD-L1高表達(dá)的患者中[23]。在一項(xiàng)多中心Ⅲ期IMvigor130臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與化療相比，阿特珠單抗對(duì)不耐受順鉑治療且PD-L1表達(dá)較高的晚期膀胱癌患者的總生存期有著顯著改善[24]。以上研究不僅揭示了免疫抑制劑在晚期膀胱癌中的臨床意義，而且確立了PD-L1作為膀胱癌免疫治療生物標(biāo)志物的地位。

在腫瘤的進(jìn)程中，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)逐漸上升和T淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制之一。從理論上來說，腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1蛋白表達(dá)越多，患者對(duì)PD-L1/PD-1抑制劑的療效越好。但PD-L1的陰性預(yù)測價(jià)值相對(duì)較低。據(jù)報(bào)道，多達(dá)16%的PD-L1陰性的膀胱癌患者受益于ICI[9]。產(chǎn)生該現(xiàn)象的主要原因?yàn)椋篜D-L1檢測方式、判定手段不一致，另外腫瘤組織內(nèi)的時(shí)間和空間異質(zhì)性以及PD-L1表達(dá)的不穩(wěn)定性也會(huì)影響最終的檢測結(jié)果；ICI不僅作用于T淋巴細(xì)胞，還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞，并且對(duì)腫瘤基因突變負(fù)荷、特定基因的突變等都會(huì)產(chǎn)生影響；免疫系統(tǒng)是一個(gè)極其復(fù)雜的系統(tǒng)，即使是微小的差異也有可能產(chǎn)生截然不同的效益。因此，PD-L1單獨(dú)的作為預(yù)測因素來指導(dǎo)膀胱癌患者的治療顯然不夠充分。

3 液體活檢相關(guān)的標(biāo)志物

在免疫治療過程中，外周血和其他血液標(biāo)志物可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者對(duì)ICI的反應(yīng)性。例如，外周血樹突狀細(xì)胞升高與PD-L1通路負(fù)相關(guān)，可能參與膀胱癌患者的免疫逃逸[25]。有研究結(jié)果顯示，通過從外周血中分離游離DNA(cfDNA)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)或循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，可作為ICI反應(yīng)的預(yù)后和預(yù)測標(biāo)志物[26]。目前，已有大量研究證實(shí)膀胱癌中的液體活檢生物標(biāo)志物可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)和藥物反應(yīng)等[27]。

液體活檢在臨床中簡單易行、無需侵入性取樣、可重復(fù)性高，并且不易受到腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響，相信未來會(huì)有更大規(guī)模的研究及更新進(jìn)的技術(shù)來提高液體活檢的有效性和敏感度，進(jìn)一步來監(jiān)測膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。

針對(duì)不同階段的膀胱癌患者，免疫治療不僅要考慮治療的有效性，還要考慮治療的安全性。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，新的免疫治療標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、檢測手段的進(jìn)步、新興技術(shù)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)以及極有可能聯(lián)合多種生物標(biāo)志物進(jìn)行評(píng)分來指導(dǎo)免疫治療等相關(guān)策略的出現(xiàn)，未來必定會(huì)有更細(xì)致、更準(zhǔn)確的指導(dǎo)方案來規(guī)范免疫治療，最終實(shí)現(xiàn)膀胱癌患者的個(gè)體化貫序治療，減輕治療過程中帶來的痛苦以及改善患者的預(yù)后。