劉立棟，徐臘梅，高潔，李潔，邵英，田雄濤，劉曉宇

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，是終末期腎臟疾病的主要原因之一［1］。目前，DN在糖尿病病人中占全球并發(fā)癥的30%以上［2］，吸引了許多研究人員的目光。DN的特征是腎小球中細胞外基質(zhì)成分的過量產(chǎn)生和積累，最終可能導致腎小球硬化［3］。眾所周知，腎小球系膜細胞（mesangial cells，MC）在維持腎小球完整性方面起著重要作用，并負責細胞外基質(zhì)的積累［4］。先前的研究表明，高葡萄糖誘導的MC增殖和細胞外基質(zhì)積累是DN中最重要的病理變化，隨著DN進程中氧化應激的長期激活和炎癥反應的發(fā)生，可能進一步加重DN［5］。根據(jù)報道，白藜蘆醇能以劑量依賴性方式降低鏈脲佐菌素誘導的大鼠胰島素抵抗，并改善DN大鼠的腎臟功能和脂質(zhì)代謝［6］。白藜蘆醇可以減輕糖尿病小鼠的蛋白尿，降低丙二醛含量，同時增加錳超氧化物歧化酶（manganese-superoxide dismutase，Mn-SOD），抑制腎小球足細胞和腎小管上皮細胞的凋亡，從而改善糖尿病小鼠的足細胞損傷［7］。白藜蘆醇通過自噬增加轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)微小RNA（MicroRNA，miRNA）-18a-5p表達，改善DN［8］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在人的DN中起著重要作用［9］。其中miR-574-3p在DN病人中的表達下調(diào)［10］。然而白藜蘆醇在DN中的功能機制是否涉及miR-574-3p仍未可知。因此，本研究旨在2019年1月1日至2020年6月1日調(diào)查白藜蘆醇對暴露于高葡萄糖的大鼠腎小球系膜細胞（rat mesangial cells，RMC）的增殖、遷移、氧化應激和炎癥反應的影響，并初步探索白藜蘆醇的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、細胞與試劑白藜蘆醇（美國Sigma公司），RMC（武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心），Lipofectamine 2000、TRIzol（美國Invitrogen公司），miScript RT試劑盒和miScript PCR系統(tǒng)（上海Qiagen公司），anti-miR-574-3p、anti-miR-NC（上海GenePharma公司），噻唑基藍四唑溴化物（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT；上海生工生物公司），白細胞介素（interleukin，IL）-1β酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（英國Abcam公司），丙二醛、乳酸脫氫酶（lactate dehydrofenase，LDH）檢測試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組與處理將RMC在含有5.3 mmoL∕L葡萄糖和10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37℃，5%二氧化碳和95%空氣中培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)RMC，并根據(jù)不同的實驗目的進行分組，共八組：（1）白藜蘆醇作用實驗：正常對照組（NG，葡萄糖濃度為5.3 mmoL），高糖組（HG，葡萄糖濃度為30 mmoL［11］），HG+低劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為5 μmoL），HG+中劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL），HG+高劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為20 μmoL［12］）。（2）白藜蘆醇機制實驗：HG+中劑量組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL），HG+中劑量+anti-miR-NC組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL，轉(zhuǎn)染anti-miR-NC），HG+中劑量+anti-miR-574-3p組（葡萄糖濃度為30 mmoL，白藜蘆醇濃度為10 μmoL，轉(zhuǎn)染anti-miR-574-3p）。其中，葡萄糖和白藜蘆醇的作用時間為48 h。RMC轉(zhuǎn)染時，依照Lipofectamine 2000制造商（美國Invitrogen）的說明步驟，將anti-miR-574-3p及anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染RMC，24 h后用葡萄糖和白藜蘆醇繼續(xù)處理48 h，即為HG+中劑量+anti-miR-574-3p組和HG+中劑量+anti-miR-NC組。

1.3 MTT檢測細胞增殖RMC以5×103細胞∕孔的密度接種在96孔板中，并在完全DMEM中培養(yǎng)。當RMC匯合率為70%～80%時，根據(jù)“1.2”中八組進行分組及實驗處理，處理結束后，將10 μL MTT溶液（5 g∕L）添加到每個孔中，然后孵育4 h。丟棄MTT溶液后，將DMSO加入每個孔中，并在室溫下孵育10 min。最后，用酶標儀在490 nm的波長處測量吸光度OD值。

1.4 Transwell法檢測細胞遷移收集“1.2”分組的八組RMC在無血清DMEM中懸浮，將1×105個RMC接種到Transwell上室，同時將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基放入下室。培養(yǎng)24 h后，將殘留在上膜上的細胞丟棄，固定貼壁于膜下的細胞，用0.5%結晶紫染色。在顯微鏡下對3個隨機視野進行了計數(shù)，其平均值作為細胞遷移數(shù)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）檢測細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21蛋白表達使用蛋白質(zhì)提取試劑盒從“1.2”分組的八組RMC中提取總蛋白質(zhì)。然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。使用抗Cyclin D1抗體（1∶1 000），抗p21抗體（1∶1 000），抗β-actin抗體（1∶1 000）與膜4℃孵育12 h。隨后在室溫下將膜與結合HRP的二抗（1∶3 000稀釋）孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光試劑可視化印跡。

1.6 ELISA檢測炎性因子IL-1β、TNF-α水平收集“1.2”分組的八組RMC培養(yǎng)上清液，使用商購的英國Abcam公司的ELISA分析試劑盒，根據(jù)制造商的說明檢測培養(yǎng)上清液中IL-1β和TNF-α水平。

1.7 試劑盒檢測氧化應激因子丙二醛、LDH水平收集“1.2”分組的八組RMC培養(yǎng)上清液，根據(jù)上海碧云天生物技術研究所的丙二醛、LDH檢測試劑盒的說明步驟，通過比色法測定丙二醛、LDH水平。

1.8 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-574-3p表達“1.2”分組的八組RMC的RNA在TRIzol試劑中，嚴格按照美國Invitrogen制造商的方案進行分離。使用miScript RT試劑盒和miScript PCR系統(tǒng)根據(jù)上海Qiagen公司的方案進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應。引物設計如下：miR-574-3p正向引物序列為5’-GAGGGACAGGCCTCCTTACTC-3’，反向引物序列為5’-GCTTGTGTCCGAAGGAACGGCC-3’；U6正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。擴增條件如下：93℃變性30 s，64℃退火30 s，73℃延伸40 s，總共34個循環(huán)，和72℃延伸8 min。使用ABI 7500熒光定量操作系統(tǒng)對實驗結果進行了分析和比較。所有樣品均一式三份運行，并使用2-ΔΔCt法計算miR-574-3p相對于U6的表達。

1.9 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的定量數(shù)據(jù)表示為xˉ±s。多組定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞增殖和遷移的影響MTT、蛋白質(zhì)印跡法的結果顯示，與NG組相比，HG組RMC細胞活性增強，Cyclin D1蛋白表達量升高，p21蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HG組相比，HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC細胞活性均逐漸減弱，Cyclin D1蛋白表達量降低，p21蛋白表達量升高，細胞遷移數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1，2；表1。

圖1 各處理組RMC細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和p21表達變化

表1 不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞增殖和遷移的影響∕xˉ±s

2.2 不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥、氧化應激和miR-574-3p表達的影響ELISA、試劑盒的結果表明，與NG組相比，HG組RMC炎性因子IL-1β、TNF-α水平增加，氧化應激因子丙二醛、LDH水平同樣增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與HG組相比，HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC的IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。qRT-PCR檢測數(shù)據(jù)表明，HG組RMC中miR-574-3p表達量低于NG組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；HG+低劑量組、HG+中劑量組和HG+高劑量組RMC的miR-574-3p表達量均高于HG組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥及氧化應激和miR-574-3p表達的影響

表2 不同濃度白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥及氧化應激和miR-574-3p表達的影響

注：IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，LDH為乳酸脫氫酶。①與NG相比，P＜0.05。②與HG相比，P＜0.05。

2.3 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞增殖和遷移的影響qRT-PCR、MTT、western blotting的結果顯示，HG+中劑量+antimiR-574-3p組RMC的miR-574-3p表達量比HG+中劑量組低，細胞活性、細胞遷移數(shù)、Cyclin D1蛋白表達量比HG+中劑量+anti-miR-NC組高，并且p21蛋白表達量比HG+中劑量組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但上述指標在HG+中劑量組與HG+中劑量+anti-miR-NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3，4；表3。

表3 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞增殖和遷移的影響

表3 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞增殖和遷移的影響

注：p21為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，OD為光密度，p21為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，Cyclin D1為細胞周期蛋白D1。①與HG+中劑量組比較，P＜0.05。

圖3 各處理組RMC細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和p21表達變化

2.4 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥及氧化應激的影響ELISA、試劑盒的結果表明，與HG+中劑量組相比，HG+中劑量+anti-miR-574-3p組RMC中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平在HG+中劑量組與HG+中劑量+anti-miR-NC組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥及氧化應激的影響

表4 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC炎癥及氧化應激的影響

注：IL為白細胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，LDH為乳酸脫氫酶。①與HG+中劑量組相比，P＜0.05。

組別HG+中劑量HG+中劑量+anti-miR-NC HG+中劑量+anti-miR-574-3p F值P值重復次數(shù)9 9 9炎性因子IL-1β∕（μg∕L）41.78±1.79 43.56±1.57 63.33±1.15①51.21＜0.001 TNF-α∕（μg∕L）24.00±1.08 24.78±0.78 42.33±1.55①77.50＜0.001氧化應激因子丙二醛∕（μmoL∕g）35.89±1.28 35.78±0.76 51.56±1.52①54.48＜0.001 LDH∕（U∕L）52.33±2.17 53.33±1.64 82.22±1.75①82.82＜0.001

3 討論

DN是導致末期腎臟疾病的最常見原因之一，可導致糖尿病病人死亡。腎小球MC是一種腎臟固有細胞，越來越多的證據(jù)表明，MC異常增殖和遷移在腎小球損傷引起的腎小球性腎炎的發(fā)病機理中起作用［13］，并且它們與DN的發(fā)生和發(fā)展高度相關［14］。MC增殖的增加被認為是DN的重要特征［15］。已有報道證實，高糖刺激可增強MC的增殖［14-15］。過度的氧化應激和炎癥反應是DN發(fā)病的關鍵致病因素［16］。DN早期某些炎性因子如TNF-α，IL-1β，IL-6的分泌失調(diào)，促進DN的發(fā)展［17］。氧化應激是導致DN發(fā)生的另一個重要因素。過度的氧化應激會激活凋亡信號通路，從而導致細胞損傷和死亡，這在DN的發(fā)病機制中起著至關重要的作用［15］。已有文獻證明，高糖處理可誘導MC中氧化應激因子（如SOD、丙二醛）和炎性細胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）的產(chǎn)生［18］。因此，調(diào)節(jié)細胞增殖、氧化應激和炎癥將是保護MC免受高糖損傷的重要方法，并可能增進對DN的發(fā)病機制和治療方法的了解。本研究利用高糖損傷RMC，觀察到高糖使RMC的細胞活性和遷移能力增強，并刺激炎性因子IL-1β、TNFα和氧化應激因子丙二醛、LDH的產(chǎn)生，與前述報道相符，表明成功建立高糖損傷RMC模型。

中藥已在許多研究中廣泛用于治療和控制糖尿病及其并發(fā)癥，例如DN，并且可能提供DN機制的見解，并成為藥物的有益補充劑DN的治療［19-20］。白藜蘆醇是一種天然植物多酚，具有抗氧化，抗炎、抗糖尿病、保肝、神經(jīng)保護和抗癌的特性［21］。先前的研究還表明，白藜蘆醇可以減弱DN的進展，例如白藜蘆醇通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激保護腎小管細胞免受高糖誘導的DN細胞凋亡［22］。白藜蘆醇可以抑制氧化應激介導的足細胞凋亡，而有效地減輕了DN的腎臟損害［23］。白藜蘆醇可能通過激活AMPK，降低4E-BP1和S6磷酸化，發(fā)揮抗增殖、抗肥大作用，從而抑制DN的發(fā)生發(fā)展［12］。但是，其作用機制仍不清楚。與先前報道［24］的結果一致，本研究觀察到，白藜蘆醇一方面可緩解高糖誘導的RMC增殖，并觀察到Cyclin D1蛋白的下調(diào)與p21蛋白的上調(diào)。另一方面，白藜蘆醇減輕高糖誘導的RMC細胞中IL-1β、TNF-α、丙二醛、LDH水平。這些結果表明，白藜蘆醇抑制了高糖刺激的RMC的增殖、遷移、氧化應激和炎癥，與前人報道的白藜蘆醇改善DN的效果［22-23］相吻合。

資料顯示，白藜蘆醇通過miR-30d-5p∕SIRT1∕NF-κB軸保護H9c2細胞免受缺氧誘導的凋亡［25］。白藜蘆醇通過下調(diào)miR-34a，顯著降低卵清蛋白誘發(fā)的哮喘小鼠血清和支氣管肺泡液中的IL-5，IL-13和TGF-β，減輕肺部過敏性哮喘和相關炎癥［26］。本研究假設白藜蘆醇保護高糖損傷RMC的作用與miR-574-3p有 關。miR-574-3p是 卵 巢 癌［27］、食 道癌［28］、結直腸癌［29］等腫瘤的抑制劑，被報道在慢性中風的病人［30］中表達下調(diào)，可能作為疾病的可診斷或治療靶點的miRNA。本研究以高糖損傷RMC模型，檢測到高糖使RMC中miR-574-3p的表達顯著下調(diào)，這與前人報道的miR-574-3p在DN病人［9］中低表達的結果吻合，提示miR-574-3p可能是DN進展的關鍵調(diào)控因子。而白藜蘆醇能夠顯著提高高糖誘導后RMC中miR-574-3p的表達，并且，抑制miR-574-3p表達后，白藜蘆醇抑制高糖誘導的RMC細胞增殖、遷移、炎癥及氧化應激的影響被逆轉(zhuǎn)。這些結果表明，miR-574-3p的上調(diào)可能是白藜蘆醇保護MC免受高糖損傷的作用機制之一。

總之，本研究表明，不同濃度的白藜蘆醇可以抑制高糖誘導的RMC增殖、遷移、炎癥和氧化應激，機制與上調(diào)miR-574-3p表達有關。表明白藜蘆醇可能成為DN治療的有價值的藥物。鑒于本研究體外實驗的局限性，有必要在將來進行進一步研究，以了解miR-574-3p在DN中的詳細作用。

（本文圖2，4見插圖1-1）

圖2 各處理組腎小球系膜細胞細胞遷移情況（結晶紫染色×200） 圖4 抑制miR-574-3p表達能逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對高糖誘導的RMC細胞遷移的影響（結晶紫染色×200）