楊柳 熊小平 馬國斌 李昱 胡林 丁海強(qiáng) 曾圣強(qiáng) 王洪

高脂血癥是指人體內(nèi)的血脂水平過高,嚴(yán)重危害人的身體健康,可引起各種急、慢性并發(fā)癥［1］。尤其是植入心臟支架的患者,更應(yīng)嚴(yán)格控制血脂水平［2,3］。近幾十年來,如何有效降脂的問題越來越受到研究者的關(guān)注。目前,在臨床常規(guī)治療中應(yīng)用的降脂藥物種類較多,西藥主要有他汀類、貝特類藥物［4］以及煙酸類及其衍生物等,以及較新的前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)抑制劑等［5］。與此同時(shí),傳統(tǒng)中醫(yī)藥因其毒性副作用小且具有降低血脂效應(yīng)已成為研究的熱點(diǎn)［6］。黃芪(AS-Ⅳ為黃芪提純的單體)具有益氣固表之功效?？山档托哪X血管壁的壓力,減輕胰島素抵抗［7］。已被描述用于治療高脂血癥,在高脂血癥患者中具有減輕血脂代謝紊亂,保護(hù)心肌作用［8,9］。然而,關(guān)于AS-Ⅳ的降脂作用、其潛在的分子機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路的數(shù)據(jù)有限。

Toll-like 受體(TLRs)信號(hào)通路在高脂血癥患者中有廣泛的跨細(xì)胞膜表達(dá)［10］,不易受環(huán)境因素的影響。其中Toll 樣受體2(TLR2)和TLR4 與高脂血癥有關(guān)［11］,當(dāng)TC 和TG 升高時(shí),TLR2 和TLR4 基因表達(dá)上調(diào),此外,國內(nèi)報(bào)道OXLDL/Beta2GPI/ANTI-Beta2GPI 復(fù)合物可通過TLR4 途徑激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的活性分子［12］。結(jié)合黃芪臨床上的作用和之前的研究結(jié)果,作者有理由猜測(cè)AS-Ⅳ通過影響TLRs 信號(hào)通路參與多靶點(diǎn)降低血脂的過程。黃芪作為祖國中醫(yī)藥對(duì)降脂藥物的重要補(bǔ)充,還有進(jìn)一步研究機(jī)制的拓展空間。

HepG2 為人源性肝癌細(xì)胞系,由于其保留了與人體生物代謝相關(guān)的完整酶,能正常表達(dá)mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)水平,因此在評(píng)價(jià)中藥降脂活性方面,被多項(xiàng)研究采用［13］。所以,體外培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞系是降脂藥物的新藥篩選和藥效評(píng)價(jià)的重要模型?；诖?本研究以該細(xì)胞模型為干預(yù)對(duì)象,研究不同濃度的AS-Ⅳ的作用從而來驗(yàn)證作者的假想。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2。

1.1.2 藥物配置 AS-Ⅳ：購自中國藥品生物制品檢定所(純度≥98%,中國北京)。配置：將其溶解在二甲基亞砜(DMSO)中,使原液濃度為2 mmol/L。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,US)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安,中國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems 7500 Fast,USA)；移液槍(Eppendorf)。

1.1.4 主要試劑 Dulbecco 培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies,Grand Island,NY,USA)；0.25%胰蛋白酶(Gibco Life Technologies)；10% 胎牛血清；油酸；DMSO(USA)；RIPA 細(xì)胞裂解液；引物序列(sinotec,CHINA)；QuantNva? SYBR? Green PCR Kit試劑盒(QIA-GEN,GERMANY)；BCA 蛋白定量試劑盒(Themo,USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2 肝癌細(xì)胞株細(xì)胞在混合10%胎牛血清的低碳水化合物Iscove 改良而成的杜爾貝克培養(yǎng)基(USA,NY)中進(jìn)行孵育,并在37℃條件下,培養(yǎng)基每隔一天更換一次,使用0.25%胰蛋白酶 (Gibco Life Technologies) 消化和傳代細(xì)胞。

1.2.2 脂肪堆積細(xì)胞造模(高脂細(xì)胞模型) 選用油酸最終濃度250 μmol/L 誘導(dǎo)HEPG2 細(xì)胞脂肪堆積,同時(shí)處理12 h,棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定30 min,PBS 潤(rùn)洗2 次,加入終質(zhì)量濃度為2 mg/L 油紅O 染色40 min,PBS 潤(rùn)洗3 次,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照；每孔加入1 ml 異丙醇溶解,將孔內(nèi)溶液全部轉(zhuǎn)于1.5 ml EP 管中,取1 ml 異丙醇溶液作對(duì)照,于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度反映脂滴含量。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為AS-Ⅳ低、中、高(0.05、0.1、0.2 mmol/L)劑量組,對(duì)照組,抑制劑組［TLR4 抑制劑TAK-242(最終濃度為1 μmol/L)］,AS-Ⅳ+抑制劑組。

1.2.4 藥物干預(yù) 在96 個(gè)孔板中接種5000 個(gè)細(xì)胞/孔密度的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEPG2 細(xì)胞,在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使細(xì)胞粘連在一起。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,在處理組中加入不同濃度的AS-Ⅳ,并在37℃下再培養(yǎng)細(xì)胞使用8 個(gè)重復(fù)孔。沒有使用AS-Ⅳ,而加入等量的培養(yǎng)基的細(xì)胞被用作每個(gè)板的對(duì)照組。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)血脂水平測(cè)定 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)血脂水平采集細(xì)胞沉淀溶于0.3 ml PBS,超聲破裂冰浴條件下(功率300 W,5 s/次,間隔30 s,重復(fù)3 次),勻漿。制備好的細(xì)胞試樣采用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.2.6 細(xì)胞增殖能力的測(cè)定方法CCK-8法使用CCK-8 細(xì)胞活力測(cè)試試劑盒(CK04；Dojindo Laboratories,Japan)測(cè)定HepG2 細(xì)胞的活力。每孔10 μl CCK-8 溶液加入到培養(yǎng)基中。使用光譜儀(Multiskan FC;Thermo Fisher Scientific,Germany)在450 nm 處測(cè)量吸光度值(a)。使用以下公式計(jì)算存活細(xì)胞的百分比:細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A/對(duì)照孔A)×100%。

1.2.7 RT-PCR 檢測(cè)TLR,TRAF6 和MyD88 mRNA 等表達(dá) ①按說明提取核糖核酸。PCR 反應(yīng)系統(tǒng)：2×SYBR Green PCR Master Mix 10。設(shè)置內(nèi)參,RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 在PCR 管中配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液反應(yīng)體系為20 μl: RNaseFree Water 4 μl,補(bǔ)足20 μl,攪拌均勻,短暫離心后,放入PCR 儀中。反應(yīng)條件為42℃、45 min,85℃、5 min。②進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10 min；然后94℃變性15 s,60℃退火1 min,共40 個(gè)循環(huán)。對(duì)目的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。③擴(kuò)產(chǎn)產(chǎn)品。PCR 條帶采用Quantityone 軟件進(jìn)行半定量分析,重復(fù)以上結(jié)果3 次,取平均值。設(shè)計(jì)引物見表1。

表1 引物序列

1.2.8 WB 法檢測(cè)各組TLR4、MyD88、TRAF6 等蛋白的表達(dá) ①所得細(xì)胞PBS 洗滌2 次,再加入適量的RIPA300 μl(內(nèi)加入100×PMSF),加 入RIPA后轉(zhuǎn)移到離心管,放置冰塊,提取粗蛋白；最后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。之后將蛋白儲(chǔ)存于-80℃。取一部分蛋白,煮沸10 min,儲(chǔ)存于-20℃/-80℃待用。②用等量蛋白樣本(50 μg)作SDS-PAGE 凝膠電泳,封閉后,除去封閉液。③加入密閉液稀釋后的MYD88(1∶1000)、TLR4(1∶500)、TRAF6(1∶1000)、TBST 漂洗濾膜4 次,10 min/次。將HRP 標(biāo)記的二抗(1∶4500)在室溫下?lián)u晃、孵化2 h,然后用TBST 將薄膜充分洗凈,通過一臺(tái)凝膠成像裝置進(jìn)行成像。作為內(nèi)參蛋白的GAPDH表達(dá)、MyD88 的測(cè)定、TLR4 和TRAF6 水平的測(cè)定等用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用Mann-Whitneytest。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HepG2 細(xì)胞增殖能力比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AS-Ⅳ介入HEPG2 細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率作圖得到劑量反應(yīng)曲線,求出AS-Ⅳ的半抑制濃度(IC50)值為2.107 mmol/L,獲得 AS-Ⅳ低、中、高給藥劑量分別為0.05、0.1、0.2 mmol/L。

2.2 AS-Ⅳ對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)血脂水平的影響 AS-Ⅳ在中高劑量下,能明顯降低血脂水平。與對(duì)照組相比,AS-Ⅳ低劑量組TG、TC、LDL 水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.33＞0.05)；TG、TC、LDL 水平在AS-Ⅳ高劑量組中顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；AS-Ⅳ中劑量組TG、TC、LDL 水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見圖1。

圖1 對(duì) HepG2 細(xì)胞內(nèi)血脂水平的影響

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法測(cè)定TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 PCR 分析結(jié)果顯示：AS-Ⅳ高、中、低劑量組,對(duì)照組,抑制劑組以及AS-Ⅳ+抑制劑組分別在1、2、3、4、5、6 泳道。用Image J 軟件分析后得出高,AS-Ⅳ中劑量組中TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而AS-Ⅳ低劑量組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示上述mRNA 表達(dá)水平隨AS-Ⅳ干預(yù)濃度的降低而逐步提高。說明中、高劑量AS-Ⅳ干預(yù)有效,但是低劑量AS-Ⅳ干預(yù)作用不明顯。抑制劑組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；AS-Ⅳ+抑制劑組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示AS-Ⅳ通過抑制相關(guān)TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達(dá)來干預(yù)血脂調(diào)節(jié)。見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法測(cè)定TLR4、MyD88、TRAF6 mRNA 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.4 WB 法測(cè)定TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 Western blot 條帶結(jié)果分析見圖3。對(duì)照組對(duì)于Toll-like 信路相關(guān)的分子蛋白(TLR4、MyD88、TRAF-6) 均有表達(dá),其中表達(dá)量相對(duì)較少的是MyD88。AS-Ⅳ高劑量組中相關(guān)分子蛋白的表達(dá)均顯著下降,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。AS-Ⅳ中劑量組中相關(guān)分子蛋白表達(dá)均顯著減低,比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。AS-Ⅳ低劑量組與對(duì)照組的蛋白質(zhì)表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在Toll-like 信號(hào)通路重要節(jié)點(diǎn)蛋白分子的表達(dá)中,明確AS-Ⅳ能有效阻斷Toll-like 依賴信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。和PCR 結(jié)果相似,AS-Ⅳ低劑量組幾乎沒有起到相應(yīng)的作用。抑制劑組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；AS-Ⅳ+抑制劑組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。和PCR 結(jié)果類似,提示AS-Ⅳ通過抑制相關(guān)TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白來干預(yù)血脂調(diào)節(jié)。

圖3 WB 法測(cè)定TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

高脂血癥在當(dāng)今世界中對(duì)人類危害巨大,目前降血脂藥物種類繁多,中醫(yī)藥在此方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),但是,大多數(shù)詳細(xì)的機(jī)制仍不清楚。中藥現(xiàn)代化研究的優(yōu)勢(shì)是多組分、多靶點(diǎn)和多種藥理作用,也是關(guān)鍵問題［14］。本研究的目的即在于揭示AS-Ⅳ在HepG2 高脂細(xì)胞模型中降低血脂的作用機(jī)制。

藥理研究表明,黃芪具有降血脂、利尿等功效［15］。本研究使用HepG2 高脂細(xì)胞模型來驗(yàn)證AS-Ⅳ對(duì)高脂血癥的干預(yù)作用。研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,AS-Ⅳ低劑量組TG、TC、LDL 水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,AS-Ⅳ中、高劑量組則能顯著降低TG、TC、LDL 水平。這與很多學(xué)者應(yīng)用大鼠模型研究等得出結(jié)論一致［16,17］。并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,代謝綜合征中的TLR-4、MF-KB 等信號(hào)途徑在脂代謝紊亂中的價(jià)值也得到重視［18］。最重要的結(jié)果(圖2,圖3)提示,AS-Ⅳ高、中劑量組TLR4、MyD88、TRAF6 表達(dá)和對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,低干預(yù)濃度的AS-Ⅳ和對(duì)照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示中、高劑量AS-Ⅳ濃度干預(yù)可降低血清中mRNA或蛋白表達(dá)的水平。這表明,AS-Ⅳ通過下調(diào)該通路中TLR4、MyD88、TRAF6 的表達(dá)而達(dá)到降低血脂的作用。這其中可能的原因有,首先,TLRs 被認(rèn)為是近幾年研究顯示的一種損害誘導(dǎo)炎癥的主要因素。TLR2和TLR4 在各種生理和病理?xiàng)l件下具有共同的配體和相似的功能［19,20］。無論是細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),還是動(dòng)物研究,在胰島素抵抗和2 型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中,慢性炎癥的作用已經(jīng)得到了證實(shí)［21］。Laureline 等［22］發(fā)現(xiàn)TLR4 缺乏預(yù)防間歇性缺氧(IH)誘發(fā)的胰島素抵抗。而眾所周知,血脂、肥胖和2 型糖尿病聯(lián)系起來,胰島素抵抗是一個(gè)樞紐,顯然,降低胰島素抵抗能有效的降低血脂［23］。

其他研究者發(fā)現(xiàn),膳食中的飽和脂肪酸和棕櫚酸能夠激活TLR2 和(或)TLR4,并導(dǎo)致NF-κB 活化［24］。而同時(shí)TLR4-MyD88 的過度激活可能導(dǎo)致了更嚴(yán)重的脂肪代謝障礙,顯然抑制 TLR4-MyD88能夠逆轉(zhuǎn)過度激活。

最后,TRAF6 在細(xì)胞內(nèi)屬于重要的適配蛋白TRAF 家族,具有獨(dú)特的受體結(jié)合能力。TRAF6 參與下游效應(yīng)蛋白Toll/IL-1 信號(hào)級(jí)聯(lián),TLR4/MyD88 信號(hào)通路［25］。說明抑制TRAF6,在一定程度上逐步放大抑制信號(hào),信號(hào)通路被激活完成。

這一發(fā)現(xiàn)與之前的一些研究一致,即通過藥理抑制TLR4,膽固醇濃度和TG 濃度在正常小鼠血清中顯著降低［26］。另外,一些流行病學(xué)調(diào)查顯示,HMGB-1(TLR4 配體之一)可作為胰島素抵抗和肥胖的重要診斷標(biāo)志物［27］。而與之對(duì)應(yīng)的是,使用抗HMGB-1 中和抗體可以有效減輕肥胖小鼠的心臟損傷［28］。

此外,AS-Ⅳ低劑量組幾乎沒有發(fā)現(xiàn)顯著對(duì)高脂細(xì)胞模型的作用,這可能說明AS-Ⅳ在低劑量下作用不明顯。在黃芪建中湯對(duì)脾胃虛寒型胃潰瘍模型大鼠JAK2/STAT3 信號(hào)通路作用下,白敏等［29］發(fā)現(xiàn)了黃芪建中湯的功效,而高劑量的組分更明顯地影響了這一通路。這與作者的研究類似。這可能的原因是中,高劑量的AS-Ⅳ才能有效的抑制該通路相關(guān)基因的表達(dá)。抑制劑組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；AS-Ⅳ+抑制劑組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示AS-Ⅳ可能通過抑制相關(guān)TLR4,MyD88,TRAF6mRNA,蛋白來干預(yù)血脂調(diào)節(jié)。

總之,本次研究表明,AS-Ⅳ可以作用于Toll-like受體通路,通過下調(diào)HepG2 模型中TLR4、MyD88、TRAF6 的表達(dá)而達(dá)到降低血脂的作用。其作用可能通過抑制TLR4 和MyD88 的激活以及TRAF6 的放大作用等來降低脂肪代謝紊亂,減輕胰島素抵抗達(dá)進(jìn)而達(dá)到目的(機(jī)制示意圖見圖4)。本研究重點(diǎn)分析AS-Ⅳ對(duì)HEPG2 高脂細(xì)胞模型Toll-Like 通路的影響,旨在對(duì)臨床高脂血癥中AS-Ⅳ的應(yīng)用進(jìn)行補(bǔ)充和提高。

圖4 AS-Ⅳ通過Toll-like 通路下調(diào)TLR,MyD88 以及TRAF6 降低血脂的可能機(jī)制