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關(guān)鍵詞：化妝品檢測(cè)；醫(yī)美評(píng)估；雙光子顯微鏡；皮膚成像

傳統(tǒng)的皮膚病理檢測(cè)通常需要切取一定大小的皮膚組織制作成病理切片，經(jīng)過HE染色處理，然后用顯微鏡成像觀察。這種離體成像方式有創(chuàng)且耗時(shí)長(zhǎng)，因此大量的研究者致力于研發(fā)無創(chuàng)、在體、實(shí)時(shí)、無標(biāo)記的成像技術(shù)。雙光子顯微成像技術(shù)便是其中之一[1]。這是一種將雙光子吸收、激發(fā)原理和激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)兩者相結(jié)合的成像技術(shù)。因其具有穿透深度大、層析成像能力強(qiáng)、可激發(fā)外源與內(nèi)源性熒光團(tuán)、亞微米級(jí)分辨率等諸多優(yōu)點(diǎn)，自問世以來，就成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常重要的一種成像技術(shù)[2]。生物組織中的內(nèi)源性熒光團(tuán)，如NADH（Nicotinamideadeninedinucleotide，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、FAD（Flavinadeninedinucleotide，黃素腺嘌呤二核苷酸）、膠原纖維、彈性纖維、黑色素、角蛋白等，都能實(shí)現(xiàn)有效地雙光子激發(fā)[3]。雙光子成像不僅能夠提供形態(tài)學(xué)信息，還能提供光譜信息，這對(duì)于臨床輔助診斷、醫(yī)美早中期療效評(píng)價(jià)、護(hù)膚品檢測(cè)等，具有重大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

然而目前雙光子顯微成像技術(shù)所使用的成像組件的體積大，人機(jī)工程學(xué)設(shè)計(jì)欠佳，導(dǎo)致在臨床使用上檢查部位受限；且由于內(nèi)部空間光路結(jié)構(gòu)復(fù)雜精密，導(dǎo)致其穩(wěn)定性和可靠性較差。因此，我們研發(fā)了一款便攜的手持式雙光子顯微鏡，由主機(jī)和手柄兩部分組成，主機(jī)和手柄用柔性光電復(fù)合線纜連接，便于握持的手柄設(shè)計(jì)方便操作人員對(duì)被測(cè)者全身各個(gè)部位進(jìn)行快速檢查，從而可對(duì)人體皮膚進(jìn)行高時(shí)空分辨在體三維雙光子顯微成像。

01原理方法和設(shè)備

1.1雙光子成像原理

雙光子顯微成像技術(shù)利用顯微物鏡將百飛秒量級(jí)的近紅外激光脈沖聚焦至樣本內(nèi)，在焦點(diǎn)處的熒光分子發(fā)生雙光子吸收而躍遷至高能級(jí)，在返回基態(tài)的過程中放出熒光光子。在掃描系統(tǒng)的控制下，激光對(duì)樣本進(jìn)行X、Y、Z三軸掃描，記錄每一個(gè)像素點(diǎn)的灰度值信息，從而實(shí)現(xiàn)3D層析成像。除了上述雙光子熒光（TPEF）過程外，成像過程中還會(huì)發(fā)生其他非線性效應(yīng)，例如二次諧波（SHG）、三次諧波（THG）、三光子熒光（3PEF）等。只要選擇合適的激光參數(shù)，并調(diào)整相應(yīng)的探測(cè)波段，就能夠?qū)崿F(xiàn)多模態(tài)的多光子顯微成像。

1.2皮膚的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性熒光團(tuán)分布

皮膚是人體最大的器官。人的表皮，除了手掌和掌跎部位以外，由淺至深可分為角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層，再往深便是真皮層[4]。角質(zhì)層由細(xì)胞核和細(xì)胞器消失的角質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)構(gòu)成，富含角蛋白，具有強(qiáng)烈的TPEF信號(hào)；顆粒層由1～3層扁平或菱形細(xì)胞所組成，胞質(zhì)內(nèi)部有少量線粒體（富含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）、黑素顆粒等熒光團(tuán)，TPEF信號(hào)很弱；棘層由4～8層多角形細(xì)胞組成，棘細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有許多線粒體和少量黑素顆粒，具有較強(qiáng)的TPEF信號(hào)；基底層為一層柱狀或立方狀的基底細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)含有許多線粒體，核的上方通常有排列成帽狀的黑素復(fù)合體，具有較強(qiáng)的TPEF信號(hào)。再往下是真皮淺層，富含膠原纖維和彈性纖維。膠原纖維成束存在，直徑在2-～15μm之間，由膠原原纖維組成；膠原原纖維由膠原分子聚合平行排列而成，并形成周期性橫紋，因而能夠產(chǎn)生SHG信號(hào)。彈性纖維直徑為1～3μm，纏繞在膠原束之間，也具有較強(qiáng)的TPEF信號(hào)。由于表皮組織對(duì)近紫外至近紅外的光具有強(qiáng)烈的散射作用，皮膚的雙光子成像深度通常不超過200～250μm，這個(gè)深度能夠覆蓋大多數(shù)部位皮膚的表皮，到達(dá)真皮淺層處。

1.3儀器設(shè)計(jì)

手持式雙光子顯微鏡如圖1所示。位于主機(jī)里的摻鉺鎖模激光器產(chǎn)生的飛秒激光脈沖經(jīng)光纖沿主機(jī)與手柄之間的線纜傳輸?shù)绞直械奈⑿突p光子顯微成像探頭。在探頭中，激光經(jīng)過兩個(gè)反射鏡后入射微機(jī)電（MEMS）掃描振鏡，該MEMS掃描振鏡可以柵格掃描方式支持9fps@512×512像素的幀率，掃描視場(chǎng)大小約為140μm×140μm。整個(gè)探頭的軸向運(yùn)動(dòng)由一個(gè)線性位移臺(tái)控制，可對(duì)樣本進(jìn)行300μm以上厚度的層切掃描。飛秒激光被數(shù)值孔徑為0.9的物鏡聚焦到樣本上，樣本被激發(fā)產(chǎn)生的信號(hào)被收集到一根玻璃光纖束中，并沿主機(jī)與手柄之間的線纜傳輸回到主機(jī)中的光探測(cè)模塊。該模塊由TPEF通道（420～580nm）和SHG通道（375～410nm）構(gòu)成，分別探測(cè)雙光子熒光信號(hào)和二次諧波信號(hào)。每個(gè)像素的信號(hào)強(qiáng)度存儲(chǔ)為16位灰度值，并由基于ZYNQ主控板和上位機(jī)的控制軟件進(jìn)行處理，重構(gòu)出掃描的圖像。顯微鏡使用了數(shù)值孔徑為0.9浸沒介質(zhì)為硅油或者硅凝膠的物鏡，實(shí)現(xiàn)了小于0.6μm的橫向分辨率和小于3.0μm的軸向分辨率，如表一所示。

1.4操作流程

1）接通電源，開啟主機(jī)，開啟上位機(jī)軟件，等待系統(tǒng)啟動(dòng)完成；

2）輸入被測(cè)者信息；

3）打開手柄保護(hù)蓋，將手柄前端的成像探頭保護(hù)窗片用醫(yī)用消毒酒精擦拭，清除窗片表面雜質(zhì)的同時(shí)，對(duì)手柄前端與皮膚直接接觸的部位作消毒處理；

4）用濕巾潤(rùn)濕和擦拭待測(cè)部位皮膚，并用干紙巾拭干；

5）將探頭對(duì)準(zhǔn)并貼住皮膚，操作上位機(jī)軟件即可實(shí)時(shí)觀察雙光子成像結(jié)果；

6）成像完畢，清潔手柄和探頭，蓋上探頭保護(hù)蓋，放置好手柄；

7）關(guān)閉上位機(jī)軟件，關(guān)閉主機(jī)。

02結(jié)果

2.1皮膚的3D掃描成像

我們對(duì)皮膚狀況正常的某位志愿者（男性，34歲，171cm，68kg，皮膚Fitzpatrick分型為III-IV型）的前額、臉、胸、腹、腰、前臂、大腿等部位進(jìn)行了3D掃描成像。成像時(shí)，僅對(duì)被測(cè)部位皮膚進(jìn)行簡(jiǎn)單清潔和潤(rùn)濕。成像及程序參數(shù)為：圖像分辨率設(shè)為512×512，幀率為9fps；以2μm、3μm或5μm為步距；每層拍攝20幀并以灰度平均的方式疊加為1幀；雙通道各自存儲(chǔ)原始數(shù)據(jù)，并將TPEF通道數(shù)據(jù)賦予紅色偽彩、SHG通道數(shù)據(jù)賦予綠色偽彩后以RGB格式合成偽彩圖像進(jìn)行展示。

2.2圖像分析與指標(biāo)計(jì)算

成像結(jié)果如圖2所示，表皮的各層角質(zhì)形成細(xì)胞以及真皮淺層的彈性纖維與膠原纖維等清晰可見，且呈現(xiàn)出一些有趣的特點(diǎn)。例如，前額的角質(zhì)形成細(xì)胞分布更為平坦，真表皮交界起伏較小，膠原纖維呈條狀；面部皮膚的彈性纖維和膠原纖維含量非常豐富，呈明顯的網(wǎng)狀分布；胸、腹、腰部位皮膚的呈蒙古包形狀的基底細(xì)胞將富含彈性纖維與膠原纖維的真皮乳頭包裹覆蓋，在層切成像模式下，呈現(xiàn)典型的真皮乳頭形態(tài)。前臂和大腿部位的皮膚，真皮乳頭的尺寸比前面這些部位的尺寸都要大。

根據(jù)圖2中的成像結(jié)果，可以計(jì)算得到包括表皮厚度、SAAID（SHGtoAutofluorescenceAgingIndexofDermis，由二次諧波與自發(fā)熒光定義的真皮老化指數(shù)）等在內(nèi)的指標(biāo)。圖2中的“前臂”數(shù)據(jù)的YZ視圖如圖3所示。圖中標(biāo)注了該處的表皮厚度為30μm。方框所選深度區(qū)域內(nèi)計(jì)算得到的SAAID平均指數(shù)為SAAID=（SHG-TPEF）/（SHG+TPEF）=0.28。采用同樣的方法處理圖2中的其他數(shù)據(jù)，得到表皮的厚度在20～100μm不等，表明不同部位皮膚的表皮厚度差異較大，且真表皮交界存在明顯的起伏。

03討論

雙光子顯微鏡通過逐層掃描成像，可以重構(gòu)出被測(cè)區(qū)域皮膚的3D結(jié)構(gòu)，獲得皮膚的三維形貌特征，例如角質(zhì)層厚度、表皮厚度、真表皮交界、皮溝深度等。其熒光通道能清晰地區(qū)分出細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，觀察到線粒體的分散與聚團(tuán)，彈性纖維的密度和網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成方式等；二次諧波通道則能觀察到膠原纖維的分布情況；通過膠原的出現(xiàn)與否，可判斷成像深度是否到達(dá)真表皮交界部位，便于對(duì)基底層的準(zhǔn)確定位。另一方面，由于雙光子熒光信號(hào)來源于分子的熒光，其信號(hào)強(qiáng)度正比于發(fā)光物質(zhì)的濃度，因此雙光子顯微鏡還可以進(jìn)行功能成像，例如在體檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞的耗氧率[5]、測(cè)量皮膚的SAAID/ELCOR指數(shù)[6]、檢測(cè)動(dòng)脈阻斷再灌注過程中的熒光上升速率與下降速率等。

手持式雙光子顯微鏡的用途遠(yuǎn)不止于皮膚成像。作為一臺(tái)通用的雙光子顯微鏡，它可以被用來觀察離體樣本，對(duì)動(dòng)物、植物進(jìn)行活檢，直接觀察培養(yǎng)的細(xì)胞、微生物等。另外，利用相同的手持探頭技術(shù)，只需開發(fā)出相應(yīng)波長(zhǎng)的小型化飛秒激光器，即可成為一臺(tái)相應(yīng)波長(zhǎng)的手持式雙光子顯微鏡，用于觀察各種內(nèi)源性的和外源性的熒光和高次諧波產(chǎn)生。

04結(jié)語

便攜的手持式雙光子顯微鏡，可實(shí)現(xiàn)以往只能在臺(tái)式雙光子顯微鏡或可移動(dòng)臺(tái)式雙光子顯微鏡才具有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。僅重12kg的手持式雙光子顯微鏡的研發(fā)，為廣大與皮膚相關(guān)的科研工作者、醫(yī)生、美容和化妝品行業(yè)從業(yè)人員提供了一種便捷的選擇，能夠隨時(shí)隨地實(shí)現(xiàn)“在體、原位、無創(chuàng)、無標(biāo)記”的高時(shí)空分辨率雙光子顯微成像，在皮膚疾病輔助診斷、化妝品功效檢測(cè)、醫(yī)美評(píng)估領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。