蔣錦雷

（濮陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 濮陽 457000）

分子標記在遺傳學(xué)這門學(xué)科發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用，同時也是觀賞園藝植物遺傳育種的重要工具。隨著遺傳學(xué)學(xué)科的縱深發(fā)展，遺傳標記的種類和數(shù)量也在不斷擴充，主要種類包括形態(tài)標記、細胞學(xué)標記、DNA 標記和生化標記4 類。其中DNA 標記是分子水平遺傳變異的直接反映，而其他三類標記都是對基因的間接反映，并且對植物各發(fā)育階段都能進行精準的分子鑒定，其數(shù)量豐富且結(jié)果可靠性高。

1 兩大類分子標記技術(shù)原理和特點

DNA 分子標記是分子水平上遺傳多態(tài)性的直接表現(xiàn)。生物技術(shù)的進步和科研成果的運用，為觀賞植物遺傳育種提供了基于DNA 多態(tài)性的分子標記，該技術(shù)的重要性早已被觀賞植物育種領(lǐng)域所公認，其應(yīng)用突出表現(xiàn)：直接以DNA 多態(tài)性形式表現(xiàn)，對觀賞植物個體各個生長發(fā)育時期的細胞均可檢測，不受時間、環(huán)境、取樣部位等條件限制，且可覆蓋到整個基因組[1]。鑒于多方面的優(yōu)越性，現(xiàn)已大量地應(yīng)用于觀賞園藝植物分子育種研究[2]。

1.1 基于Southern技術(shù)類標記

該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對各類DNA分子片段酶切后，用特異性探針進行Southern雜交技術(shù)，再通過放射自顯影技術(shù)或非同位素顯色來證明DNA分子的多態(tài)性。其中表現(xiàn)最典型的是發(fā)現(xiàn)最早的RFLP（restriction fragment length polymorphisms）標記，它屬于共顯性標記，呈孟德爾式遺傳，結(jié)果穩(wěn)定可靠，特別適合于建立連鎖圖譜，不足是RFLP探針的開發(fā)費用較高[3]。

1.2 基于PCR技術(shù)類分子標記

RAPD（random amplified polymorphic DNA）標記。設(shè)計的隨機引物由10 個堿基組成，由該引物對樣品的全基因組進行PCR 擴增，獲得DNA 多態(tài)性條帶。其具有分辨率高、簡單、成本低等優(yōu)點，因隨機擴增基因組而致使其穩(wěn)定性較差[4]。

SSR（simple sequence repeats）標記。該標記利用簡單序列重復(fù)次數(shù)的差異設(shè)計引物，利用該引物一般檢測到單一的多等位基因位點，而開發(fā)SSR 引物前期費用較高[5]。

AFLP（amplified fragments length polymorphism）標記。通過選擇性擴增基因組DNA 的酶切片段，為共顯性或顯性，穩(wěn)定性強，結(jié)果可靠[6]。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）標記。該標記利用基因外顯子里GC 含量不同，同時啟動子和內(nèi)含子里AT 含量不同的特點來設(shè)計引物，利用該引物對不同材料的ORFs（open reading frames）進行擴增，擴增出多態(tài)DNA 條帶，具有簡便、穩(wěn)定、便于克隆目標片段等特點[7]。

EST（expressed sequence tags）標記。該標記是通過對cDNA 文庫隨機擴增，進而對所得的cDNA 不同端序列進行測序，一般長度為150 bp～500 bp，易于開發(fā)[8]。

TRAP（target region amplified polymorphism）標記。該標記依據(jù)生物信息學(xué)及表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)庫DNA 信息，找出目標候選基因區(qū)，對照設(shè)計不同DNA標記[8]。

2 遺傳圖譜中常見分子標記技術(shù)的應(yīng)用

1）RAPD 標記。Debener 等[9]通過運用305 個RAPD 分子標記、AFLP 分子標記構(gòu)建了一張觀賞植物玫瑰的連鎖圖譜。Peltier 等[10]利用RAPD 分子標記和形態(tài)學(xué)標記手段構(gòu)建了一張觀賞植物矮牽牛BC1群體的分子圖譜，有7 個連鎖群，覆蓋基因組長262.9 cM，平均圖距為8.2 cM。謝偉等[11]利用RAPD 分子標記對春蘭、春劍、蕙蘭進行了分子研究，構(gòu)建它們的DNA 分子指紋圖譜，并進一步探究了它們的親緣關(guān)系。黃翠娟[12]利用RAPD、SSR 兩種分子標記，以F1雜交群體為材料，構(gòu)建了觀賞植物梅花的分子圖譜。黃少玲[13]利用RAPD 標記構(gòu)建了一張春石斛分子遺傳圖譜，圖譜包含9 個連鎖群、121 個標記位點，其總長度為6 568.7 cM，標記間平均距離為50.11 cM。

2）SSR 標記。胡興華等[14]以1 個茶花品種為試材研究不同體系，利用SSR 標記構(gòu)建茶花分子指紋圖譜。于超[15]以月季四倍體為材料，構(gòu)建7 個連鎖群，包含295 個多態(tài)性位點，總圖距為874 cM，平均圖距為2.9 cM。

3）ISSR 標記?？姾惚虻萚16]利用ISSR 標記進行PCR 擴增，獲得多態(tài)性譜帶114 條，并利用標記多態(tài)性構(gòu)建了菊花的指紋圖譜。葛亞英等[17]利用12 條ISSR 引物，以41 個麗穗鳳梨品種為材料，構(gòu)建了麗穗鳳梨品種的分子指紋圖譜。

4）SRAP 標記。潘俊松等[18]以黃瓜自交系S06 與S52 雜交產(chǎn)生的F2群體（共93 個單株）為作圖群體，應(yīng)用SRAP 標記構(gòu)建觀賞黃瓜的分子遺傳框架圖譜。Gao 等[19]利用92 對SRAP 標記，以白姜花與圓瓣姜花雜交的F1個體為材料，構(gòu)建兩張中等密度的父母本的遺傳圖譜，其中母本連鎖圖有18 個連鎖群，包含139 個標記，總長917 cM；父本的連鎖圖有23 個連鎖群，包含203個標記，總長1 386.8 cM。Sun等[20]利用SRAP標記對梅花的圖譜進行了連鎖研究。

5）多種標記的綜合應(yīng)用。以下綜述了常見的十種觀賞園藝植物的分子圖譜構(gòu)建中多種分子標記的聯(lián)合應(yīng)用研究。Li 等[6]以羽衣甘藍與花椰菜的86 個RI 系個體為作圖群體，利用SRAP 標記、AFLP 標記作圖，構(gòu)建了羽衣甘藍的分子圖譜。Zhang 等[21]利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標記初步構(gòu)建了菊花的遺傳連鎖圖譜，共有567 個標記。張飛[22]以142 個F1為作圖群體，利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標記，分別構(gòu)建菊花父母本遺傳圖譜。Bossolini 等[23]以兩個種間矮牽牛雜交個體為作圖群體，運用SSR 標記、AFLP 標記構(gòu)建了矮牽牛的分子圖譜，圖譜總長分別為970 cM和700 cM。潘宏兵[24]利用8個SSR標記、28個ISSR 標記和194 個SRAP 標記，構(gòu)建了石斛遺傳連鎖圖，該圖譜有26 條連鎖群，總圖距為1 548.9 cM，平均圖距為9.91 cM。王萬興[25]利用SSR、SNP 標記對結(jié)球甘藍的DH 群體進行了遺傳圖譜構(gòu)建，覆蓋基因組總長度為1 197.9 cM，平均遺傳距離和物理距離分別為0.98 cM 和503.3 Kb。唐楠[26]對郁金香的圖譜研究表明，母本連鎖群有27 條，包含110 個SNP 標記、2個SSR標記、238個AFLP標記，總圖距為1 707 cM，平均圖距為3.9 cM；父本連鎖群有21 條，連鎖群含有99 個SNP 標記、3 個SSR 標記、190 個AFLP 標記，總圖距為1 201 cM，平均圖距3.1 cM。Venkat 等[27]采用Anthurium ornatum“A1”和Anthurium“Eternity”雜交的41 個F1代單株用于遺傳作圖，共使用三種標記，其中有RAPD 標記99 個、ISSR 標記21 個和SRAP 標記108 個，對兩個紅掌親本分別構(gòu)建圖譜，母本的圖譜圖距為1 233.5 cM，而父本的圖譜總圖距為1 023.5 cM。蔡長福[28]采用牡丹的F1代群體中195 株單株為作圖群體，利用SLAF、SSR 標記，構(gòu)建了牡丹的分子連鎖圖譜，該圖譜總圖距為1 061.94 cM，平均圖距為0.84 cM。

3 存在的問題及展望

分子標記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳育種中。隨著分子生物學(xué)的進一步發(fā)展，分子標記技術(shù)在觀賞園藝植物育種領(lǐng)域的運用將更加廣泛。但是現(xiàn)在大多數(shù)試驗僅停留在少數(shù)幾種標記技術(shù)的應(yīng)用，在以后的研究中如果能把多種標記同時用在一個試驗中，就會構(gòu)建出飽和度更高的遺傳圖譜。SRAP 和TRAP 標記系統(tǒng)是簡便、高效的標記系統(tǒng)，易于實現(xiàn)自動化，在一次實驗中可產(chǎn)生大量的多態(tài)性片段。SRAP 標記可以和RAPD、AFLP 等其他分子標記相結(jié)合，構(gòu)建大多數(shù)觀賞園藝植物高度飽和的遺傳圖譜。大量篩選適用于觀賞園藝植物花品種的SSR 標記，將是深入開展觀賞園藝花品種指紋圖譜研究必須應(yīng)對的重要挑戰(zhàn)。在與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用和開發(fā)更為高效的分子標記方法（例如EST-SSR 標記）成為觀賞園藝植物標記育種研究的重點之一。