李 泉，潘少香，張青青，王文昌，劉雪梅*，李苗苗

（1.中華全國供銷合作總社濟(jì)南果品研究所，山東濟(jì)南 250220；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250100）

杏鮑菇，因兼具杏仁和鮑魚的風(fēng)味而得名，質(zhì)厚爽口，脆嫩鮮美，是高蛋白低脂肪的食藥兩用健康食用菌。杏鮑菇產(chǎn)業(yè)規(guī)模僅次于金針菇，是全國第二大工業(yè)化生產(chǎn)食用菌品種，我國年生產(chǎn)總量接近160 萬t，其中70%以上是工業(yè)化生產(chǎn)的杏鮑菇[1]。杏鮑菇副產(chǎn)物中富含糖類、含氮物質(zhì)、礦物質(zhì)等各種營養(yǎng)物質(zhì)，重金屬含量遠(yuǎn)低于國家安全標(biāo)準(zhǔn)的限量要求[2]，目前未見關(guān)于其存在食品安全問題的報道。

杏鮑菇在生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物較多，在工廠化栽培中產(chǎn)生的副產(chǎn)物約占成品菇產(chǎn)量的24%[3]，深加工產(chǎn)品種類少，商品的附加值較低。杏鮑菇副產(chǎn)物的直接廢棄，造成了極大的資源浪費和環(huán)境污染，亟待研究其綜合利用技術(shù)。已有研究將杏鮑菇副產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)提取再利用，作為食品原料加工制成面點產(chǎn)品、飲品、休閑食品，還能與肉類、面粉等原料進(jìn)行搭配混合，研制出更有營養(yǎng)價值的復(fù)合制品，市場發(fā)展未來可期[4-6]。

杏鮑菇中富含食用菌多糖，占其總糖的50.29%[7]，具有降血糖[8]、降血脂[9-10]、免疫調(diào)節(jié)[11-12]、抗氧化[13]、抗病毒[14-15]等多種活性功能，是一種國內(nèi)外公認(rèn)的重要生物活性成分。目前植物多糖的提取方法有水浴提取法、酶法、亞臨界法和超聲提取法，傳統(tǒng)多糖提取方法以熱水提取法為主，提取時間長、效率低[16]。超聲提取法利用超聲波產(chǎn)生的空化作用和熱效應(yīng)，提高多糖溶解速度的同時，可有效保持生物活性。本研究采用超聲輔助法提取杏鮑菇副產(chǎn)物中的多糖，優(yōu)化提取工藝并對其體外抗氧化性做初步分析，以期為杏鮑菇副產(chǎn)物的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

本試驗所用杏鮑菇副產(chǎn)物鮮品，包括菌腳、邊角料和幼菇，來自于山東恒發(fā)食用菌有限公司。

1.2 試劑

無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；葡萄糖，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；結(jié)晶蒸餾抽提液、抗壞血酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸，煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機，SZ-500B，浙江銳騰食品機器有限公司；1P 空氣能熱泵柜式烘干機，DH-15HC 型，山東大琨能源科技有限公司；分析天平，MS304S，深圳市君達(dá)時代儀器有限公司；超聲波清洗器，KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司；醫(yī)用離心機，Centrifuge-V，賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；電熱恒溫干燥箱，DHG-9202·0型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器，REAX-2000，海道尓夫儀器設(shè)備（上海）有限公司；紫外可見分光光度計，TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 杏鮑菇副產(chǎn)物的預(yù)處理

取杏鮑菇鮮品的副產(chǎn)物包括菌腳、邊角料和幼菇三類，分別切片后平鋪于托盤上，放到熱泵烘干機中55 ℃恒溫烘干，用高速粉碎機粉碎成粉末后，過40 目篩，收集過篩粉末，備用。

1.4.2 超聲法提取多糖

稱取1.000 0 g 杏鮑菇副產(chǎn)物粉于離心管中，加適量的去離子水混合均勻，在500 W 功率下超聲萃取一定時間，離心后取上清液與4 倍體積的無水乙醇混合，放入4 ℃冷藏醇沉，12 h 后取出，離心后將沉淀轉(zhuǎn)移到烘干至恒質(zhì)量的濾紙上，50 ℃真空恒溫干燥得到杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖粉末。

1.4.3 超聲法提取杏鮑菇副產(chǎn)物多糖工藝參數(shù)優(yōu)化

（1）單因素試驗

固定超聲時間30 min、超聲溫度50 ℃，料液比1∶20（g/mL），改變其中一個因素進(jìn)行單因素試驗。料液比設(shè)置為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），超聲溫度設(shè)置為30、40、50、60、70 ℃，在超聲時間設(shè)置為10、20、30、40、50 min 進(jìn)行超聲提取、醇沉、復(fù)溶，測其吸光度值，進(jìn)行3 次平行試驗，以粗多糖含量為評價指標(biāo)。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理[17]，設(shè)置料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）為響應(yīng)面因子，以杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖超聲提取條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面因子和水平見表1。

表1 響應(yīng)面因子和水平表Table 1 Factors and levels and response surface

1.4.4 杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作液（100 μg/mL）于10 mL 具塞試管中，加去離子水至1.0 mL 搖勻，加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 濃硫酸，充分混合后反應(yīng)40 min，測定反應(yīng)液在490 nm 的吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.004 1x-0.005 2（R2=0.999 1）。

（2）多糖含量的測定

將醇沉得到的烘干并冷卻的杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖粉末轉(zhuǎn)移至燒杯中，加一定量去離子水，經(jīng)超聲充分溶解后，定容于100 mL 容量瓶中，取上清液5.00 mL 定容至25 mL，搖勻后取2.00 mL 置于10 mL 具塞試管中，向其中加1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL 濃硫酸，混合均勻后反應(yīng)40 min，在490 nm 處測其吸光度值，空白試樣加入2.00 mL 去離子水置于10 mL 具塞試管中，其余同樣品操作。將測得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中計算杏鮑菇副產(chǎn)物中粗多糖質(zhì)量濃度，單位以百分含量表示，多糖含量根據(jù)公式（1）計算。

式中，m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得多糖提取液中的含糖量，μg；V1為多糖提取液定容體積，mL；V2為比色測定時所移取多糖提取液的體積，mL；m2為提取得到的杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖量，g；0.9 為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)；m為杏鮑菇副產(chǎn)物粉稱樣量，g。

1.4.5 粗多糖體外抗氧化活性研究

將提取得到的杏鮑菇副產(chǎn)物多糖粉末復(fù)溶后，配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的多糖溶液，分別移取4 mL于具塞刻度試管中，再向其中加入配制好的0.2 mmol/L的DPPH 溶液4.00 mL，充分混合后放入暗環(huán)境中反應(yīng)30 min，經(jīng)過離心后取上清液在517 nm 處測定反應(yīng)溶液的吸光度值，記作A1，另取一只具塞試管加入4.00 mL 無水乙醇和4.00 mL 去離子水作為空白調(diào)零試樣。陽性對照組是將1 mg/mL 維生素C 溶液配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的溶液，其余處理步驟同杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖相同，測其吸光度A2。空白對照加入4.00 mL 去離子水和4.00 mL DPPH 溶液，其余處理步驟同杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖相同，測其吸光度A0。杏鮑菇副產(chǎn)物中粗多糖對DPPH 清除率按式（2）計算。

式中，A0為空白對照的吸光度值；Ai為不同質(zhì)量濃度的樣液吸光度值，i=1,2，A1為杏鮑菇多糖吸光度值，A2為維生素C 的吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS 9.0 軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對杏鮑菇副產(chǎn)物提取多糖含量的影響

由圖1 可知，隨著料液比的提高，杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量先增加后減少，在料液比為1∶20（g/mL）時達(dá)到峰值，為26.90%，與其他水平間均存在顯著性差異（P＜0.05），1∶25、1∶30 之間無顯著性差異（P＞0.05），1∶15、1∶35 之間也無顯著性差異（P＞0.05）。說明在一定范圍內(nèi)增加溶劑體積能夠有效促進(jìn)杏鮑菇副產(chǎn)物中水溶性多糖的溶出，從而使得含量增加，但隨著溶劑比例的繼續(xù)增大，由于滲透壓的改變[18]，其他水溶性成分也會一同溶出，從而降低多糖含量。同時液料比過大，后續(xù)沉淀消耗的乙醇量也會增加，造成浪費，也會增加多糖的損失，因此選擇1∶20（g/mL）為最佳料液比。

圖1 料液比對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.1.2 超聲溫度對杏鮑菇副產(chǎn)物提取多糖含量的影響

由圖2 可知，隨著超聲溫度增加時，杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量先增加后減小，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時，達(dá)到最大值，此時多糖含量為24.07%，與其他水平間均存在顯著性差異（P＜0.05），50 ℃和70 ℃之間無顯著性差異（P＞0.05），30 ℃、40 ℃之間也無顯著性差異（P＞0.05）。分析其原因可能是隨著溫度的升高，細(xì)胞中的分子運動加快，使得多糖浸出量增加，但如果萃取溫度過高，可能引起多糖的分子結(jié)構(gòu)被破壞，降低其萃取效率[19]。所以最佳超聲溫度為60 ℃。

圖2 超聲溫度對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the content of polysaccharide by-products of P. eryngii

2.1.3 超聲時間對杏鮑菇副產(chǎn)物提取多糖含量的影響

由圖3 可知，隨著超聲時間的延長，杏鮑菇副產(chǎn)物多糖提取含量也總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)超聲時間為30 min 時，其最大含量為25.45%，與其他水平間均出現(xiàn)了顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)超聲時間為50 min 時，出現(xiàn)了第二個峰值，其多糖含量為23.18%。分析原因是在一定范圍內(nèi)增加超聲時間，能夠有效破壞杏鮑菇細(xì)胞壁，利于多糖溶解在提取液中。在超聲時間為40 min 時，杏鮑菇副產(chǎn)物中多糖的含量降低主要是因為超聲的機械作用引起的。在超聲時間為50 min 時發(fā)現(xiàn)多糖含量再次升高，這可能是在長時間超聲作用下，導(dǎo)致杏鮑菇細(xì)胞中的其他長鏈物質(zhì)分解為短鏈物質(zhì)，從而提高了杏鮑菇副產(chǎn)物多糖的提取含量[20]。所以選定超聲時間為30 min 為最佳工藝參數(shù)。

圖3 超聲時間對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the content of polysaccharide in by-products of P. eryngii

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化杏鮑菇多糖超聲提取工藝參數(shù)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

為明確超聲輔助提取杏鮑菇下腳料多糖工藝的最佳參數(shù)，基于單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken 的設(shè)計方法，響應(yīng)面優(yōu)化杏鮑菇多糖超聲提取工藝參數(shù)結(jié)果如表2（見下頁）所示，對17個實驗點進(jìn)行回歸模型擬合，得到杏鮑菇下腳料多糖含量相關(guān)料液比（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）的回歸模型方程為：杏鮑菇下腳料多糖含量（%）=28.60-0.50A-0.78B-0.090C+1.43AB-1.82AC-0.16BC-2.50A2-2.36B2-5.49C2。

表2 響應(yīng)面結(jié)果Table 2 Response surface results

該公式的二次項系數(shù)都是負(fù)值，由此說明有最大值，可以進(jìn)行最優(yōu)解的求解。通過一次項系數(shù)的絕對值大小，可以推測出三種因素對多糖提取含量的影響程度，其中超聲溫度對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的影響最大，其次是料液比，超聲時間影響較小。

2.2.2 響應(yīng)模型的方差分析

由表3 可得，模型的F=116.99，其對應(yīng)的P值＜0.000 1，說明模型的差異非常顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬項P=0.553 1＞0.05，意味著失擬項相對于純誤差并不顯著，無失擬項因子存在。R2=0.993 4（＞0.8），這表明所建立的模型具有很好的擬合性，且誤差較小，與實際情況比較相符，可以用此回歸公式來代替實測值。校正決定系數(shù)R2Adj為0.984 9（＞0.80）和變異系數(shù)（CV）為1.92%，表示此模型可說明98.49%的變化，因此能夠做出準(zhǔn)確的預(yù)測。

由表3 可看出，超聲溫度、料液比對杏鮑菇副產(chǎn)物中的多糖含量有明顯的影響。通過對不同因子F、P值的分析，發(fā)現(xiàn)不同因素對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的影響由大到小的順序為超聲處理溫度、料液比、超聲處理時間。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸方程建立響應(yīng)面曲線，結(jié)果如圖4 所示。通過等高線圖和3D 圖可以分析響應(yīng)面所選取的三個響應(yīng)面因子兩兩之間對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的交互影響。從圖4 可以看出，料液比和超聲溫度、料液比和超聲時間以及超聲溫度和超聲時間的等高線圖是橢圓形的，表明各響應(yīng)面因素兩兩之間彼此均有相互作用，結(jié)合響應(yīng)面的傾斜程度和方差分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)料液比和超聲處理溫度、料液比和超聲處理時間對杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量有顯著的交互作用。

圖4 各因素間對多糖含量影響的等高線圖和3D 圖Fig.4 Contour map and 3D map of the effect of various factors on polysaccharide content

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

通過軟件分析，模擬出超聲提取杏鮑菇副產(chǎn)物多糖的最佳工藝條件參數(shù)為：料液比1∶20（g/mL），超聲提取溫度57.82 ℃，超聲提取時間30.24 min，杏鮑菇副產(chǎn)物多糖含量的預(yù)測值為28.73%，為保證實驗的可操作性，超聲最佳提取溫度設(shè)為58℃，超聲最佳提取時間設(shè)為30min。在此條件下進(jìn)行3 次驗證試驗，得到實際多糖含量為29.06%，和預(yù)測值接近，說明該模型可用于擬合分析杏鮑菇副產(chǎn)物多糖提取工藝且效果較好，具有一定的應(yīng)用價值。

2.3 杏鮑菇副產(chǎn)物多糖體外抗氧化活性研究

由圖5 可看出，杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時清除能力最強，與0.2、0.4、0.6 mg/mL 間均存在顯著性差異（P＜0.05），略高于0.8 mg/mL 的杏鮑菇副產(chǎn)物多糖的清除率。維生素C 在0.6、0.8、1.0 mg/mL 的質(zhì)量濃度的清除率無顯著性差異（P＞0.05），但與0.2、0.4 mg/mL 之間存在顯著性差異（P＜0.05）。在杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖提取液的濃度為0.2～0.8 mg/mL 時，杏鮑菇副產(chǎn)物中粗多糖對DPPH 的清除效果與多糖質(zhì)量濃度成正線性相關(guān)（R2=0.955 9）。當(dāng)粗多糖含量大于0.8 mg/mL時，對DPPH 自由基的抑制效果逐步穩(wěn)定下來，在杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖提取液的濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時，對自由基清除率可達(dá)56.96%。以維生素C 作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)在杏鮑菇副產(chǎn)物粗多糖提取液的質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時，對DPPH 自由基的抑制作用可達(dá)到維生素C 清除效果的53.93%。通過回歸擬合，推測杏鮑菇副產(chǎn)物中的粗多糖對DPPH 的清除能力的IC50為0.700 mg/mL。

3 結(jié)論

杏鮑菇素有“平菇王”之稱，其營養(yǎng)價值極高，富含杏鮑菇多糖等活性物質(zhì)，可進(jìn)行保鮮加工，是一種廣受歡迎的食用菌。杏鮑菇下腳料中含有較高含量的杏鮑菇多糖，具有抗氧化、殺菌、抗病毒等多種功能。本論文采用超聲輔助提取法從杏鮑菇下腳料中提取粗多糖，通過單因素與響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計，得到粗多糖提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶20（g/mL），超聲溫度58 ℃，超聲功率500 W，超聲時間30 min，在此條件下，從杏鮑菇下腳料中提取的粗多糖含量達(dá)到29.06%。所提取的杏鮑菇粗多糖對DPPH 自由基的抑制作用的IC50為0.700 mg/mL，進(jìn)一步證實了杏鮑菇下腳料中的多糖具有一定的抗氧化活性，為杏鮑菇可食副產(chǎn)物的后續(xù)處理及綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。