李 冰，楊祥燕，蔡元保，曾黎明，林玉虹，李季東

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001）

澳洲堅果（Macadamiaspp.）屬山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（MacadamiaF.Muell.）多年生常綠喬木果樹，源自澳大利亞亞熱帶雨林氣候地區(qū)。1843 年德國探險家Leichhardt 最先發(fā)現(xiàn)，命名為昆士蘭堅果，1857 年正式命名為澳洲堅果，隨之先后被引入世界各熱帶、亞熱帶地區(qū)。雖然20世紀70 年代我國才開始引種試種澳洲堅果，但目前我國澳洲堅果的種植面積居于世界首位，已在云南、廣西、廣東、海南和貴州等地區(qū)廣泛種植。澳洲堅果果仁含油量高，多為單一不飽和脂肪酸，且富含蛋白質，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，被譽為“堅果皇后”。澳洲堅果單產(chǎn)和總產(chǎn)量低，且產(chǎn)品在世界各地供不應求，因此，選育出高產(chǎn)優(yōu)質的澳洲堅果品種以提高其產(chǎn)量，是目前澳洲堅果遺傳育種工作的重中之重。

DNA 分子標記技術與傳統(tǒng)育種技術相結合，可以極大的縮短育種年限，加快作物育種進程。目前分子標記技術已經(jīng)在水稻[1]、蘋果[2]、龍眼[3]、番木瓜[4]等作物中得到廣泛的應用，在作物遺傳育種改良中發(fā)揮重要的作用。隨著生物技術的不斷發(fā)展，RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內切酶片段長度多態(tài)性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA 標記）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，簡單序列重復區(qū)間）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）、SSR（Simple Sequence Repeats，簡單重復序列標記）、SCoT（Start Codon Targeted Polymorphism，目標起始密碼子多態(tài)性）等分子標記技術也逐漸應用于澳洲堅果遺傳育種研究。本文主要綜述了分子標記技術在澳洲堅果種質資源遺傳多樣性分析、DNA 分子指紋圖譜構建和遺傳圖譜構建中的研究進展，并分析了其在澳洲堅果研究中的發(fā)展前景。

1 分子標記的類型及用途

分子標記是物種基因組中有其特有位置的DNA片段，是形態(tài)學標記、細胞學標記和生化標記之外的第四種遺傳標記，其主要分為三大類：以分子雜交為基礎的第一代分子標記（RFLP 等）、以PCR技術為核心的第二代分子標記（AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SCoT 等）以及以序列測序為基礎的新一代分子標記SNP、InDel（Insertion Deletion Length Polymorphism，插入缺失長度多態(tài)性）、EST（Expressed Sequence Tag，表達序列標簽）等。分子標記與其他三種遺傳標記相比，具有許多優(yōu)點，包括不受組織類別、發(fā)育階段和生存環(huán)境的影響，標記數(shù)量分布于整個基因組且多為共顯性標記，多態(tài)性高、能遺傳穩(wěn)定等，是一種相對理想的遺傳標記類型。分子標記可應用于標記重要性狀基因、構建遺傳連鎖圖譜、分子標記輔助選擇及分析種質遺傳多樣性等方面，并在植物遺傳育種和基因組研究中發(fā)揮著重要作用。

2 分子標記在澳洲堅果中的研究進展

2.1 澳洲堅果種質資源的遺傳多樣性分析

澳洲堅果種質資源豐富，但是由于交叉引種、自然變異、雜交等因素，遺傳背景復雜，親緣關系比較雜亂。植物的遺傳多樣性是品種遺傳改良的基礎，種質遺傳背景分析可為作物品種鑒定和品種純度監(jiān)測提供科學依據(jù)。利用DNA 分子標記開展澳洲堅果種質資源的遺傳多樣性等研究，可以有效地提高澳洲堅果育種效率，加速澳洲堅果育種進程。

Peace 等[5]利用分子標記技術，分析了80 多個來自澳大利亞，美國夏威夷、加州，南非，以色列等地收集的澳洲堅果品種，將其品種分為7 個基因庫。其中基因庫1 和2 包含幾乎所有的夏威夷品種和一些以色列品種，基因庫3 和4 主要包含澳大利亞品種，基因庫5 和6 主要是澳大利亞雜交品種，基因庫7 包含來自澳大利亞和南非的雜交種和粗殼種。而且，還分析了75 個澳洲堅果自然種群（共400 多份種質），并確定了光殼種、粗殼種和三葉澳洲堅果這3 個物種特有的分子標記（共120 多個），從DNA 分子水平上闡明了澳洲堅果品種資源的分類。此外，Peace 等[6]還利用RAF 標記輔助篩選出38 個南非澳洲堅果品種，并分析其品種間的遺傳特性和親緣關系，結果表明品種741u 即是741（Mauka），741s 則是800（Makai），791 可能是M.ternifolia第二代雜交種，Nelmak1 是M.inegrifolia和M.tetraphylla的第一代雜交種。這一結果為南非地區(qū)澳洲堅果種質資源的科學利用和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了重要依據(jù)。

Steiger 等[7]利用105 個AFLP 標記鑒定26 份澳洲堅果材料，明確分離出4 個澳洲堅果種，并對三葉澳洲堅果可能為全緣葉澳洲堅果變種這一觀點提出質疑。在澳洲堅果屬物種分類的主類群中，9 個已明確的光殼種品種被分為兩個亞類群，這表明原始基因庫的雜合性有助于澳洲堅果品種的改良。

唐瑩瑩等[8]利用單因素設計法，優(yōu)化了澳洲堅果RAPD-PCR 反應體系，并通過不同引物和種質驗證表明該反應體系可靠性、穩(wěn)定性和分辨率較高，為澳洲堅果種質資源鑒定和遺傳多樣性分析提供了重要工具。Barbosa 等[9]利用RAPD 標記對澳洲堅果栽培種的不同無性系進行遺傳特征分析。通過提取來自巴西和夏威夷的12 份澳洲堅果無性繁殖系葉片的DNA，并利用15 對RAPD 標記引物進行擴增，構建親緣關系樹狀圖。該結果表明，大多數(shù)遺傳變異發(fā)生在群體內部并非群體之間，推測遠緣群體可用于近親繁殖或者雜交。

賀熙勇等[10]利用ISSR 分子標記技術，對收集到的64 個澳洲堅果種質進行分子聚類分析，將64 份種質分為5 類，但是其聚類結果與形態(tài)學分類的一致性相差較大，只有部分種質的親緣關系和種類與已知的分類體系一致。郭凌飛等利用單因素設計法，建立與優(yōu)化了澳洲堅果ISSR-PCR 反應體系[11]，并利用該分子標記分析17 份澳洲堅果品種的親緣關系[12]。其UPGMA 法的聚類結果表明，17 個品種間遺傳相似系數(shù)較大，可分為4 個類群，在最大的一個類群中包括所有夏威夷選育出的品種，而在澳大利亞選育出的品種則為獨立的類群。因此，推測現(xiàn)育的夏威夷品種可能來源于2 個遺傳多樣性不同的群體；而澳大利亞現(xiàn)育品種的遺傳背景和選育過程應該與夏威夷品種有所不同，其遺傳關系可能更復雜。

譚秋錦等[13]對45 份澳洲堅果種質的單核苷酸多態(tài)性位點（SNPs）進行了基因分型、群體結構和UPGMA 聚類分析，將這45 份澳洲堅果種質分為4個類群，其中第1 類群有2 份種質，第2 類群有1份種質，第3 類群有4 份種質，第4 類群有38 份種質，其結果表明澳洲堅果種質資源存在很多品系。通過45 份澳洲堅果種質的親緣關系與遺傳多樣性分析，可為SNP 標記在澳洲堅果輔助育種的應用提供科學依據(jù)。

SSR 分子標記重復性高，其實驗結果穩(wěn)定可靠，兼具PCR 反應的優(yōu)點，廣泛應用于作物遺傳多樣性分析、種質資源鑒定以及遺傳育種工作中[14]。2006年，Schmidt 等[15]開發(fā)利用SSR 引物，分離出33個微衛(wèi)星位點，為SSR 標記在澳洲堅果中的應用提供重要的位點標記。2013 年，李玉宏等[16]從100 對引物中篩選得到19 對SSR 引物，其中2 對可以應用于900×294 雜交組合的F1 代鑒定，為澳洲堅果分子標記輔助育種提供了理論依據(jù)。2019 年，唐瑩瑩等[17]利用單因素設計法，對SSR-PCR 的反應體系進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的反應體系穩(wěn)定可靠，對不同引物和澳洲堅果種質驗證的分辨率更高，可適用于澳洲堅果SSR 分析，也為后續(xù)基于PCR 擴增反應的澳洲堅果相關試驗提供一定理論和技術基礎。2022 年，井敏敏等[18]利用9 對SSR 引物對91 份國外引進以及自主選育澳洲堅果品種進行遺傳多樣性分析，結果表明供試澳洲堅果具有較高的多態(tài)性。其UPGMA 聚類分析將91 份澳洲堅果材料分為2大類，親緣關系與地理來源關系無明顯相關性；AMOVA 分析結果表明澳洲堅果群體內遺傳變異顯著高于群體間變異。這些研究結果可為澳洲堅果種質資源的創(chuàng)新與利用提供雜交親本的遺傳背景。

2022 年，Ranketse[19]等利用13 個nSSRs（Nuclear microsatellite markers，核微衛(wèi)星標記）對南非栽培澳洲堅果種質的遺傳多樣性和結構進行了研究，對來自夏威夷農業(yè)實驗站31 份、澳大利亞19份、加州2 份、以色列1 份、南非31 份、兩家當?shù)剞r戶的26 份供試材料進行了比較。研究結果為南非所選澳洲堅果材料含有豐富的雜種基因型，夏威夷和澳大利亞的供試材料大多含有M.integrifolia或者混合基因。這一結果為南非澳洲堅果基因育種改良提供了依據(jù)。

2.2 澳洲堅果DNA 分子指紋圖譜的構建

以DNA 分子標記為基礎的DNA 指紋鑒定技術在品種鑒定和純度監(jiān)測等方面具有高效的準確性。利用DNA 分子標記技術獲得品種的DNA 分子指紋圖譜，可用于鑒定品種的真實性與純度，新品種登記、注冊與知識產(chǎn)權保護等。

Steiger 等[7]利用105 個AFLP 標記鑒定26 份澳洲堅果材料，分離出了四個澳洲堅果種，且每個堅果種都顯示出不同的AFLP 指紋圖譜，表明這些種質中含有大量的遺傳變異。蔡元保等[20]利用單因素設計法建立了澳洲堅果SCoT 最適反應體系，通過3 對SCoT 引物可將供試材料完全區(qū)分，并構建了12 份澳洲堅果種質材料的指紋圖譜，置信概率到達99.99%，為澳洲堅果種質（品種）鑒定和遺傳多樣性分析等提供技術支持，也為澳洲堅果品種的登記注冊和產(chǎn)權保護提供了一種有效的技術手段。劉小翠等[21]利用SRAP 分子標記對45 份澳洲堅果材料進行基因組擴增和遺傳多樣性分析，將45 份澳洲堅果種質資源分為6 個種群；并構建DNA 指紋圖譜，有效的鑒定了澳洲堅果種質資源間的遺傳關系，為澳洲堅果種質資源利用和種質鑒定提供科學依據(jù)。李志強等[22]以4 份差異較大的種質為材料，從240對SSR 引物中最終選擇22 對擴增穩(wěn)定、多態(tài)性高的SSR 引物進行熒光標記。利用篩選出的22 對多態(tài)性引物對83 份澳洲堅果種質資源進行熒光檢測，獲得了83 份澳洲堅果基因組數(shù)據(jù)，并利用其中9 對熒光引物組合，構建該種質的SSR 指紋圖譜，為澳洲堅果種質資源的鑒定工作提供了指紋數(shù)據(jù)信息。

2.3 澳洲堅果遺傳連鎖圖譜的構建

遺傳連鎖圖譜是在染色體重組的基礎上，用遺傳標記為路標，以兩位點間的重組值作為遺傳標記間的距離構建的圖譜。構建遺傳連鎖圖譜是識別與控制性狀表達的基因相關標記的第一步，在闡明數(shù)量性狀方面起著重要作用[23]。高密度遺傳圖譜的構建對于分子標記輔助育種和基因圖位克隆在農作物發(fā)展應用起了重大推動作用。Peace 等[24]以Keauhou 和A16 的56 個F1 代為供試材料，通過RAF、RAPD、SSR 三種分子標記，分析出382 個標記，繪制了第一張澳洲堅果遺傳圖譜，為澳洲堅果遺傳育種方面的QTL 定位和分子標記輔助育種打下堅實的基礎。

Langdon[25]等利用澳洲堅果品種741 自交和雙親雜交（‘741’ × ‘A4’，‘741’ × ‘268’，‘A4’ × ‘268’）等組合建立了四個定位群體，總共構建了9 個遺傳連鎖圖譜。其中741 自交圖譜完全由共顯性SNP 標記構建，而親本雜交圖譜同時包含了SNP 和PAV 標記。每個圖譜由14 個連鎖群組成，與澳洲堅果單倍體染色體數(shù)目一致。這些遺傳連鎖圖譜被成功地用于澳洲堅果基因組支架的錨定和定位以及第一個假染色體尺度組裝的構建，增強了對澳洲堅果遺傳背景和基因組的了解，為未來澳洲堅果育種提供了重要工具。

3 分子標記在澳洲堅果研究中的應用前景

培育出穩(wěn)定遺傳、高產(chǎn)優(yōu)質的澳洲堅果品種是目前澳洲堅果產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。雜交育種是澳洲堅果新品種選育的常用方法，雜交種與親本相比也具有更高的生產(chǎn)潛力。已有研究表明SSR 分子標記可被用于鑒定澳洲堅果雜交種[16，26]。通過連鎖分子標記進行基因型和表型篩選，實現(xiàn)將多種優(yōu)質高產(chǎn)基因聚合到同一澳洲堅果品種中，形成形狀優(yōu)良的聚合品種，是未來澳洲堅果分子標記育種的重要方向。近年來，澳洲堅果主產(chǎn)區(qū)十分重視澳洲堅果品種鑒定和分子遺傳多樣性分析，并取得了一些重要進展。這為世界澳洲堅果種質資源遺傳多樣性評價、種質創(chuàng)新與利用、分子標記輔助育種和新品種培育方面奠定了基礎。隨著澳洲堅果重要農藝性狀的優(yōu)異基因挖掘與功能驗證[27-29]，其連鎖的分子標記也將深入開發(fā)，從而使分子標記輔助育種技術在澳洲堅果遺傳育種中的應用更加精準高效。尤其是隨著澳洲堅果葉綠體基因組的公開及其基因組序列特性的分析[30]，基于葉綠體基因組的cpSSR 標記也將逐步應用到澳洲堅果種質資源和雜交品種的遺傳特性分析。

利用分子標記分析澳洲堅果種質（品種）的遺傳多樣性，明確其分子遺傳背景及其親緣關系，可以對澳洲堅果種質資源進行創(chuàng)新與利用，有利于對澳洲堅果種質資源的保護。目前，澳洲堅果品種選育還是多選取傳統(tǒng)育種方法，難以實現(xiàn)對目標性狀快速高效的改良選育。轉基因技術、分子標記技術等分子育種技術具有周期短、效率高、定向育種精確度高等優(yōu)點，將這些現(xiàn)代分子生物學技術應用于遺傳育種以提高果實的產(chǎn)量與品質，是澳洲堅果遺傳改良的最重要育種目標。但與水稻、玉米、棉花等大田作物相比，澳洲堅果分子育種技術的研究和應用較為滯后，加強分子生物學技術在果樹育種領域的研究應用將是未來育種的重要方向。但是，分子標記在澳洲堅果應用研究中存在技術含量不高和未能有效利用的問題，導致通過該技術獲得的澳洲堅果新品種并不多。因此，開發(fā)出更多更有效的分子標記，并將分子標記育種技術與常規(guī)育種技術有效結合起來，將會有效提高澳洲堅果育種效率，選育出更多優(yōu)良品種。