代莉莉

（武漢大學(xué) 科研公共服務(wù)條件平臺(tái)，湖北 武漢 430072）

目前，化學(xué)、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)﹂_(kāi)發(fā)新材料具有極大的需求，越來(lái)越多高性能的合成聚合物類(lèi)新材料被開(kāi)發(fā)出來(lái). 這些材料的功能特性與化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此對(duì)合成聚合物的結(jié)構(gòu)剖析顯得尤為重要. 質(zhì)譜是高分子化合物結(jié)構(gòu)分析的重要手段，與核磁、紅外等表征手段相互補(bǔ)充[1]. 合成聚合物通常是具有不同鏈長(zhǎng)分子的混合物，存在分子量分布，因此，簡(jiǎn)單的聚合物也會(huì)有相對(duì)復(fù)雜的質(zhì)譜圖.1985年，Karas等[2]提出基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）的概念. MALDI技術(shù)的引入使各種大分子得以解離為氣相離子進(jìn)行質(zhì)譜分析，解決了大分子質(zhì)譜分析的難題，現(xiàn)已成為表征核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的重要手段[3]，也逐漸成為合成聚合物的有力表征手段. 合成聚合物的質(zhì)譜分析中使用最多的是電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）和二次離子質(zhì)譜（SIMS）3種. De Bruycker等[4]對(duì)3種電離技術(shù)分析聚合物的效果進(jìn)行了比較（如圖1所示），結(jié)果表明，ESI質(zhì)譜會(huì)產(chǎn)生多電荷離子，可能導(dǎo)致不同荷電狀態(tài)樣品峰的重疊，同時(shí)質(zhì)譜信號(hào)受ESI源的電位和溫度影響大，可能導(dǎo)致質(zhì)量偏移[5-6]. MALDI產(chǎn)生的多是準(zhǔn)分子離子，在低質(zhì)量區(qū)存在基質(zhì)碎片等信號(hào)干擾. SIMS對(duì)分析物具有更強(qiáng)的破壞性，在低質(zhì)量區(qū)形成的碎片多，而完整的聚合物信號(hào)少. 相比較而言，對(duì)于分子量一般較大的聚合物來(lái)說(shuō)，MALDI是更合適的質(zhì)譜分析方法. MALDI還具有很多不可替代的優(yōu)點(diǎn)：分析速度快、靈敏度高、分辨率高、準(zhǔn)確度高、質(zhì)量上限高、樣品用量少，可進(jìn)行高通量分析[7]. 同時(shí)，MALDI質(zhì)譜是基于“軟電離”技術(shù)，能提供完整的分子離子峰，測(cè)定絕對(duì)分子量，避免了多重電離帶來(lái)的復(fù)雜性[8]. 因此，MALDI質(zhì)譜能夠精確分析合成聚合物分子質(zhì)量分布、重復(fù)單元、末端基團(tuán)以及嵌段長(zhǎng)度[9]，對(duì)聚合物合成機(jī)理和工業(yè)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義[10-11]. 但相比生物大分子，合成聚合物的質(zhì)譜分析難度較大，更具挑戰(zhàn)性[12]. 原因在于合成聚合物通常是混合物，存在分子量分布. 由于本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，合成聚合物不易被電離，因此，樣品制備是分析成功的關(guān)鍵. 樣品制備與激光器的類(lèi)型有一定關(guān)系，目前，許多類(lèi)型的激光器已被用于MALDI質(zhì)譜，波長(zhǎng)范圍從紅外到紫外，脈沖寬度從納秒到飛秒. 紅外激光器包括2.94 μm的Er:YAG激光器和10.6 μm的CO2激光器，紫外激光器包括337 nm的N2激光器、355 nm的Nd:YAG激光器、266 nm的 Nd:YAG激光器以及349 nm的Nd:YLF激光器. 由于可見(jiàn)光的吸收問(wèn)題，可見(jiàn)激光尚未廣泛用于MALDI，目前已有532 nm的Er:YAG激光器. 不同的激光器激發(fā)波長(zhǎng)不同，適用的基質(zhì)也不盡相同[13]. 目前，絕大多數(shù)使用的是紫外激光器（337和355 nm）. 355 nm 的N2激光器是一種耐用且相對(duì)便宜的激光源，355 nm的Nd:YAG激光器滿(mǎn)足了MALDI成像對(duì)于高重復(fù)頻率固體激光器的需求[14]. 除此之外，合成聚合物MALDI-TOF-MS的樣品制備需要合適的基質(zhì)、陽(yáng)離子化試劑以及混樣方法等方面共同作用.

圖1 ESI、MALDI以及SIMS 3種技術(shù)分析聚合物示意圖[4]Fig. 1 Schematic diagrams of polymer analysis by ESI,MALDI and SIMS[4]

1 基質(zhì)

在MALDI-TOF-MS分析中，通常使用較高濃度的基質(zhì)溶液與較低濃度的聚合物溶液相混合來(lái)輔助樣品電離. 合適的基質(zhì)對(duì)于能否成功表征聚合物樣品至關(guān)重要. 選擇基質(zhì)時(shí)，遵循3個(gè)基本原則：基質(zhì)能分散包裹樣品，基質(zhì)和樣品共溶，基質(zhì)能促進(jìn)電離[15]. 好的基質(zhì)具備以下優(yōu)點(diǎn)：具有良好的真空穩(wěn)定性、較低的蒸汽壓，在溶解樣品的溶劑中具有良好的溶解性以及在固態(tài)下與分析物具有良好的混溶性[16].

常用來(lái)分析合成聚合物的基質(zhì)如表1所列. 其中α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2, 5-二羥基苯甲酸（DHB）、2-(4-羥基苯偶氮)苯甲酸（HAHB）等常被用作生物分子分析的基質(zhì)，也可用于一些分子量較小或者溶解度較好的聚合物樣品. 某些聚合物修飾的生物分子也可用此類(lèi)基質(zhì)，如檢測(cè)聚乙二醇修飾的蛋白使用CHCA有很好的效果[17-18]. 但對(duì)于一些難溶或者分子量較大的聚合物，通常需要專(zhuān)門(mén)用于聚合物的基質(zhì)來(lái)進(jìn)行分析才能得到好的效果.

表1 常用于合成聚合物分析的基質(zhì)Table 1 Matrices commonly used for synthetic polymer analysis

因此常規(guī)基質(zhì)的普適性有時(shí)依然較差. 為了得到更好的分析結(jié)果，探索新基質(zhì)是必然的選擇.

Améduri等[19]提出了一種新的基質(zhì)制備方法：使用7, 7, 8, 8-四氰基喹二甲烷、三氟苯甲酸和2, 3,4, 5, 6-五氟肉桂酸的混合物為基質(zhì)，分析常規(guī)基質(zhì)難以分析的聚偏氟乙烯以及含氟量高的聚合物，可得到分辨率很高的譜圖. Yerra等[20]使用低成本合成的2-氰基-3-(2-噻吩基)丙烯酸為基質(zhì)，即使在低濃度（2.5 pmol）下，也能對(duì)高分子質(zhì)量聚乙二醇（PEG103000）顯示出好的信噪比和分辨率. Ramirez-Pradilla等[21]使用α-氰基苯乙烯衍生物作為基質(zhì)，分析性質(zhì)不穩(wěn)定、高反應(yīng)性的功能材料，如納米顆粒、聚合物、卟啉和富勒烯等，與常用基質(zhì)DCTB相比，具有更好的真空穩(wěn)定性和質(zhì)譜效果.

Carraher等[22]將二號(hào)鉛筆中的石墨作為基質(zhì)分析了含金屬的縮聚聚合物，與CHCA相比能得到更高質(zhì)量的譜圖，且證明石墨在600 u以上不會(huì)形成碳團(tuán)簇，是一種干擾較小的基質(zhì). 石墨基質(zhì)使用時(shí)可直接將鉛筆涂覆在靶板上，方法簡(jiǎn)便，同時(shí)適用于活潑聚合物樣品[9]，之后該課題組還用該方法分析了合成有機(jī)錫聚酯[23]. 此后，各種碳基材料被作為基質(zhì)材料得以應(yīng)用，如碳納米管、石墨烯、有機(jī)金屬框架化合物等，尤其是用于低分子量或非極性化合物的分析. Cho等[24]將多層石墨烯作為基質(zhì)用于1 000 u的極性聚乙二醇和650 u的非極性聚甲基丙烯酸甲酯的分析，獲得了沒(méi)有低質(zhì)量區(qū)干擾信號(hào)的高質(zhì)量譜圖. Wu等[25]制備了沒(méi)食子酸官能化的鋯1, 4-二羧基苯金屬有機(jī)框架化合物作為新基質(zhì)，對(duì)200~10 000 u 質(zhì)量范圍內(nèi)的聚乙二醇都有很好的效果.

Armstrong等[26]使用一系列離子液體為基質(zhì)，分析了肽、蛋白質(zhì)和PEG，某些離子液體比固體基質(zhì)顯示出更高的真空穩(wěn)定性. 使用離子液體N,N-二異丙基乙基銨α-氰基-4-羥基肉桂酸酯分析可生物降解的極性聚合物，與常規(guī)基質(zhì)相比離子液體基質(zhì)所需的激光強(qiáng)度小，能最大限度地減少聚合物降解，從而準(zhǔn)確靈敏地分析不穩(wěn)定極性聚合物的數(shù)均分子量、重均分子量和多分散性[27]. Gabriel等[28]使用MALDI成像方法檢測(cè)了離子液體作為基質(zhì)時(shí)樣品的均勻性，表明離子液體基質(zhì)方法的均勻性和重現(xiàn)性提高，改善了傳統(tǒng)干滴法制樣時(shí)聚合物樣品與基質(zhì)分離的缺點(diǎn).

面對(duì)某一個(gè)或某一類(lèi)樣品，如何從眾多候選基質(zhì)中選擇合適的基質(zhì)至關(guān)重要. Yoo等[29]比較了CHCA、DHB和蒽三酚3種基質(zhì)分析多種合成聚合物的效果，結(jié)果表明，雖然通常使用CHCA和DHB獲得的譜圖較好，但對(duì)某些樣品中，只有使用蒽三酚作為基質(zhì)時(shí)，鬼峰才會(huì)消失. Yang等[30]選擇3種市售聚合物胍殺菌劑為對(duì)象來(lái)研究基質(zhì)的選擇，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)能同時(shí)檢測(cè)出3種聚合物的基質(zhì). 以基質(zhì)和分析物的質(zhì)子親和力來(lái)解釋?zhuān)|(zhì)子親和力較低的基質(zhì)對(duì)質(zhì)子親和力較低的聚合物胍更敏感. 從另一個(gè)角度，樣品需與基質(zhì)固體結(jié)合，并且被基質(zhì)分離，樣品需和基質(zhì)有很好的混溶性，即樣品在基質(zhì)中（而非在溶劑中）能很好的溶解，否則在溶劑蒸發(fā)過(guò)程中基質(zhì)將與樣品分層，影響后續(xù)測(cè)試結(jié)果. 反相液相色譜法研究表明，如果樣品與基質(zhì)的保留時(shí)間相匹配，即極性相似，則可以獲得較好的MALDI-TOFMS結(jié)果，這與我們熟知的“相似相溶原理”相一致[31-32]. 因此，可首先選擇與聚合物極性類(lèi)似的基質(zhì)來(lái)進(jìn)行測(cè)試[33].

基質(zhì)添加劑在某些情況下可以改善MALDITOF-MS分析結(jié)果，有時(shí)基質(zhì)單獨(dú)使用沒(méi)有信號(hào)，加入添加劑則能夠獲得理想的圖譜. Kassis等[34]在以二苯甲酚為基質(zhì)分析聚甲基丙烯酸甲酯體系中，添加N-辛基-D-吡喃葡萄糖苷等3種非離子表面活性劑，顯著改善了質(zhì)譜信號(hào). 表面活性劑可降低兩個(gè)不互溶相之間的界面張力，在臨界膠束濃度值附近，表面活性劑分子形成膠束，聚合物和基質(zhì)分子更容易聚集. Bara等[35]使用HPA為基質(zhì)，檸檬酸銨為基質(zhì)添加劑，分析了分子量為50 000~60 000的聚酰胺，并由此推斷鏈中重復(fù)單元在45到55個(gè)之間.

2 離子化試劑

生物分子在MALDI-TOF-MS分析之前，應(yīng)盡量去除緩沖液、金屬離子等以避免信號(hào)干擾，但對(duì)于有些合成聚合物，則需要離子化試劑幫助電離，電離機(jī)制是陽(yáng)離子結(jié)合而不是質(zhì)子化電離. 金屬鹽是常用的離子化試劑，離子化試劑的選擇與樣品相對(duì)應(yīng). 堿離子可與含氧聚合物（如聚酯和聚醚）或含其他雜原子的聚合物加成，堿金屬多是單同位素或含較少同位素，通常不會(huì)擴(kuò)大分布[1]. 含雙鍵或芳香族體系的聚合物（如聚苯乙烯和聚丁二烯）可與過(guò)渡金屬離子（如銀和銅）加成. 不飽和聚合物中的π體系與陽(yáng)離子作用，常常能夠觀察到分析物與離子加合物的峰. 既不含雜原子又沒(méi)有不飽和度的樣品最難離子化，例如聚乙烯類(lèi)材料[36]. 使用易溶于有機(jī)溶劑的堿性鹽（如三氟乙酸銀）或者基質(zhì)對(duì)應(yīng)的堿性鹽可有更好的效果. 離子化試劑的選擇對(duì)聚合物樣品的成功分析也至關(guān)重要. 郝歆愚[37]分別使用銀鹽和鈉鹽測(cè)試含二甲硅烷基的聚苯乙烯樣品，由于結(jié)構(gòu)中有易氧化的Si-H基團(tuán)存在，當(dāng)使用有氧化性的銀鹽作為陽(yáng)離子試劑時(shí)，譜圖中形成較明顯的氧化物峰，對(duì)譜圖解析、結(jié)果判斷造成干擾. 選用無(wú)氧化性的鈉鹽作為陽(yáng)離子試劑則避免了這種干擾. 李仕誠(chéng)等[38]對(duì)非極性聚合物分析時(shí)離子化試劑的選擇進(jìn)行了研究. 以DCTB為基質(zhì)，以聚丁二烯、不同聚合度的聚苯乙烯、聚乙烯等為樣品，考察了9種銅鹽的促離子化作用. 結(jié)果表明，Cu(NO3)2作為離子化試劑對(duì)3類(lèi)非極性聚合物的分析均能獲得最佳信號(hào)強(qiáng)度和分辨率. 使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行形貌分析發(fā)現(xiàn)，相比于其它銅鹽，Cu(NO3)2與樣品和基質(zhì)混合干燥后可得到更均勻的樣品結(jié)晶. Ehlers等[39]通過(guò)理論計(jì)算表明匹配的陽(yáng)離子的大小與聚合物鏈的長(zhǎng)短密切相關(guān). PEG鏈在與較大的陽(yáng)離子相互作用時(shí)可以形成更穩(wěn)定的復(fù)合物. Shimada等[40]研究了不同聚合度的PEG與陽(yáng)離子的親和力，表明較長(zhǎng)鏈的PEG傾向于與更大的陽(yáng)離子結(jié)合. 例如，PEG的聚合度n為34~39時(shí)，與Cs離子結(jié)合更穩(wěn)定. PEG的聚合度n為12~17時(shí)，與Na離子結(jié)合更穩(wěn)定. Conway等[41]使用LiCl分析PEG200，可觀察的聚合度n低至2.

3 混樣方法

樣品、基質(zhì)及陽(yáng)離子化試劑以合適的濃度和比例混合可以改善信號(hào)強(qiáng)度和分子量分布等[42-43]. 樣品濃度過(guò)高，即溶劑揮發(fā)時(shí)，樣品將最先達(dá)到溶解極限發(fā)生沉淀，共結(jié)晶的效果很差. Gabriel等[44]使用光學(xué)顯微鏡、MALDI成像質(zhì)譜和紅外成像光譜儀等分析了當(dāng)改變基質(zhì)與樣品的比例和基質(zhì)的濃度時(shí)，干滴法制備的樣品點(diǎn)的形貌和均勻性. 結(jié)果表明，使用常規(guī)基質(zhì)質(zhì)量濃度（10 mg/mL）時(shí)，樣品點(diǎn)呈環(huán)狀（咖啡環(huán)效應(yīng)），而較高濃度的基質(zhì)溶液傾向于形成均勻的樣品層. 樣品和基質(zhì)的分離主要是由干燥過(guò)程中的基質(zhì)遷移引起的，基質(zhì)遷移是馬蘭哥尼效應(yīng)和毛細(xì)管效應(yīng)相互作用的結(jié)果. 使用高濃度的基質(zhì)溶液可以避免基質(zhì)和聚合物以及不同分子量的聚合物同系物之間的分離. 基質(zhì)濃度高，則沉淀（伴隨晶體生長(zhǎng)）進(jìn)行快，毛細(xì)管效應(yīng)無(wú)法對(duì)較大的基質(zhì)晶體進(jìn)行傳輸及固定. 基質(zhì)/分析物的質(zhì)量比（M/A）通常在100∶1到106∶1范圍內(nèi)，該比例往往隨著聚合物分子大小的增加而增加，即需要更多的基質(zhì)作為每個(gè)分析物分子的分散劑、解吸劑和電離劑[45-46]. 增加M/A比例可減少多聚體的形成，但對(duì)分子量較大的聚合物來(lái)說(shuō)，過(guò)大的M/A導(dǎo)致可電離的分析物較少[47]. Wang等[48]在聚合物/基質(zhì)比例不變時(shí)，不斷增加陽(yáng)離子化試劑的用量，起初能夠增加聚合物的信號(hào)強(qiáng)度，之后譜圖信號(hào)沒(méi)有明顯改善，反而會(huì)因陽(yáng)離子加成簇峰干擾分析. Hoteling等[49]發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加的銀的濃度與聚合物近似化學(xué)計(jì)量時(shí)，可獲得好的MALDI譜圖. 當(dāng)銀的濃度高出一個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，過(guò)多陽(yáng)離子化試劑會(huì)形成基質(zhì)鹽團(tuán)簇，抑制樣品信號(hào). Schriemer等[50]使用聚苯乙烯研究了試驗(yàn)所得的數(shù)均分子量（Mn）與聚合物、基質(zhì)、陽(yáng)離子試劑三者的比例關(guān)系. 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加高質(zhì)量組分時(shí)，所得Mn降低，這可能與多聚體的形成有關(guān)，質(zhì)量較高的組分更易形成多聚體，降低了主分布強(qiáng)度，如圖2所示. 改變M/A也會(huì)影響Mn測(cè)定，M/A較高時(shí)，由于在計(jì)算Mn時(shí)僅考慮主分布，更多的基質(zhì)將有助于更好地分離聚合物鏈，多聚體的減少使Mn隨著基質(zhì)與分析物的比例增加. 此外，低質(zhì)量組分和高質(zhì)量組分解吸/電離效率存在根本差異，低濃度下，解吸/電離有利于高質(zhì)量組分. 對(duì)陽(yáng)離子化試劑研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子化試劑種類(lèi)的不同也可引起不同組分的質(zhì)量歧視.

圖2 多聚體形成對(duì)Mn值的影響（a） 聚苯乙烯5 050（100 pmol）和聚苯乙烯11 600（100 pmol），Mn期望值為8 245，（b）聚苯乙烯5 050（100 pmol）和聚苯乙烯11 600（100 pmol）以及聚苯乙烯35 000（75 pmol）[50]Fig. 2 Effect of multimer formation on measured Mn values(a) polystyrene 5 050 (100 pmol) and 11 600 (100 pmol),expected Mn value was 8 245, (b) polystyrene 5 050(100 pmol), 11 600 (100 pmol) and polystyrene 35 000 (75 pmol) [50]

溶劑也是混合制樣時(shí)的重要因素之一. 所用溶劑對(duì)樣品形態(tài)和分子量分布檢測(cè)有很大影響，應(yīng)避免使用難以溶解聚合物樣品的溶劑[51]. 根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果樣品難溶于溶劑，呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)或者底部沉淀狀態(tài)，通常在后續(xù)分析中都無(wú)法得到質(zhì)譜信號(hào). 使用快干溶劑（即薄層法）可以促進(jìn)共結(jié)晶的形成[52]. 因此，具有溶解范圍寬和揮發(fā)速度快的溶劑是聚合物樣品制備的理想選擇. 但是通常聚合物或者基質(zhì)都不一定具有好的溶解度. 一些較難溶解的聚合物可能需要添加適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行溶解，如二氯甲烷、四氫呋喃、六氟異丙醇、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲苯、二甲基甲酰胺等. 聚合物MALDI-TOF-MS分析常見(jiàn)的兩個(gè)問(wèn)題是質(zhì)量歧視和重現(xiàn)性差，使用二元溶劑可能會(huì)造成上述問(wèn)題，因此最好將基質(zhì)和樣品溶解在同一種溶劑中[53]. 如果使用二元溶劑，優(yōu)先使用共沸物，揮發(fā)時(shí)可保持溶劑組成不變，使樣品點(diǎn)保持均勻穩(wěn)定[18]. Wu等[54]研究了尼龍-6和基質(zhì)HABA在6組溶劑中的效果. 使用共聚焦激光掃描顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察共晶的形態(tài)，表明溶解度更好的溶劑結(jié)晶更小，具有更高的比表面積，因此可能具有更高效的能量轉(zhuǎn)移，從而使MALDI質(zhì)譜的效果也更好. 有研究證明小尺寸晶粒也可在點(diǎn)與點(diǎn)之間提供更好的重現(xiàn)性[55]. Wang等[48]選取甲醇、四氫呋喃、丙酮溶解不同聚合物進(jìn)行MALDI分析，表明極性最弱的四氫呋喃與非極性聚合物PEG6000獲得的譜圖信號(hào)最佳，這可能是由于它們的極性都相對(duì)較小，因而具有好的相溶性，從而具有好的離子化效果.

4 總結(jié)及展望

合成聚合物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析中樣品制備非常關(guān)鍵. 合適的樣品制備可以使樣品均勻地混溶于液體基質(zhì)乃至結(jié)晶后的固體基質(zhì)中，從而產(chǎn)生良好的質(zhì)譜信號(hào). 基質(zhì)的選擇是第一步也是最重要的一步. 合適的離子化試劑以及混樣方法對(duì)于檢測(cè)結(jié)果也有重要影響. 探索出更多適合于聚合物分析同時(shí)具有一定普適性的基質(zhì)，簡(jiǎn)化樣品制備時(shí)的試錯(cuò)過(guò)程，仍是未來(lái)MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)的研究方向.