孫春青， 陶美奇， 姚悅梅， 戴忠良，①

(1. 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 句容 212400； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095)

睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬(NymphaeaLinn.)植物全球共有50余種，其中大多數(shù)種類屬于熱帶睡蓮，僅有少部分種類屬于耐寒睡蓮[1，2]。睡蓮(N.tetragonaGeorgi)別名子午蓮，屬于耐寒睡蓮，在中國分布廣泛[3]。由于睡蓮具有較強的耐寒性和抗病性，常被用作睡蓮屬植物種間雜交育種的親本。

在睡蓮屬植物種間雜交過程中，特別是在耐寒睡蓮與熱帶睡蓮的種間雜交過程中，常存在一系列雜交障礙，難以獲得雜交種子，因而，較難實現(xiàn)將熱帶睡蓮攜帶的優(yōu)異花色和花型基因轉(zhuǎn)入睡蓮中[4]。針對存在雜交障礙的植物雜交親本，利用幼胚培養(yǎng)技術(shù)可成功地克服雜交障礙并獲得雜交子代，而采用幼胚培養(yǎng)技術(shù)的前提之一是詳細了解親本的胚胎學(xué)特征[5]。目前，對一些熱帶睡蓮種類，例如埃及白睡蓮(N.lotusLinn.)[6]和侏儒盧旺達睡蓮(N.thermarumEb. Fisch.)[7]，已進行了胚胎學(xué)特征研究，但由于不同類型睡蓮的開花結(jié)實特性存在差異，因此，有必要了解睡蓮的胚胎發(fā)育過程及其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，可為克服睡蓮種間雜交障礙提供基礎(chǔ)資料。此外，睡蓮屬種類位于被子植物系統(tǒng)發(fā)育樹的基部，因此，睡蓮屬植物的胚胎學(xué)研究對探討被子植物的系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。

鑒于此，作者以廣泛分布于中國的睡蓮為研究對象，采用石蠟切片技術(shù)并利用掃描電子顯微鏡觀察其雌、雄配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化，并對其花粉萌發(fā)率和結(jié)實率進行統(tǒng)計分析，以期為提高睡蓮屬植物種間雜交效果提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試睡蓮引自貴州省黎平縣(東經(jīng)109°01′24″、北緯26°06′22″)，保存于江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，均種植于水深30 cm的淺池內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 雌、雄配子體解剖結(jié)構(gòu)觀察 于2019年5月20日至6月15日，在睡蓮開花前25、22、19、16、13、10、7、4和1 d依次取樣，每次采集3個花蕾(每個花蕾約包含280枚胚珠)。采樣后立刻用FAA固定液〔V(體積分數(shù)70%乙醇)∶V(冰乙酸)∶V(甲醛)=18∶1∶1〕將整個花蕾固定，并置于4 ℃保存、備用。

采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)制片?；ㄋ幒妥臃恳来蚊撍疂B蠟后分別用石蠟包埋，用KQ-2258石蠟切片機(科迪儀器設(shè)備有限公司)連續(xù)切片，獲得花藥橫切和子房縱切切片，切片厚度8 μm；將切片晾干后依次用二甲苯脫蠟2次(每次20 min)、體積比1∶1的二甲苯-乙醇混合溶液脫蠟1次(5 min)，然后分別用體積分數(shù)100%～30%的梯度乙醇溶液各處理5 min；處理后的切片用質(zhì)量體積分數(shù)0.5%蘇木精溶液染色，然后用加拿大樹膠(印度Chemsworth公司)封片，用Olympus BX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)觀察并拍照[8]。

于開花的第2天采集花粉，立即用體積分數(shù)2.5%的戊二醛(用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液配置，pH 7.2)固定2 d以上，然后依次用30%～100%梯度乙醇溶液分別處理20 min，使花粉脫水；脫水后的花粉用叔丁醇處理3次以上(每次10 min)，將溶劑揮干后依次進行冷凍干燥和噴金處理，最后置于Hitachi S-3000N掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)下觀察并拍照。

1.2.2 花粉萌發(fā)率測定 于開花的第2天上午9：00至10：00采集花粉，并采集當天開花花朵的柱頭液，將花粉均勻撒布在載玻片上，滴入適量的柱頭液后將載玻片置于溫度28 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)6～8 h；然后用Olympus BX41光學(xué)顯微鏡觀察花粉的萌發(fā)狀況，選擇10個視野統(tǒng)計萌發(fā)花粉的數(shù)量[8]，每個視野花粉數(shù)量不少于60粒。實驗重復(fù)3次(即制片數(shù)為3片)。

1.2.3 人工授粉后子房解剖結(jié)構(gòu)觀察和異花自交結(jié)實率統(tǒng)計 于開花前選擇合適的花朵用網(wǎng)袋套袋，并于開花當天的上午9：00用鑷子去雄，同期采集其他套袋花的新鮮花粉，對去雄花的柱頭進行人工授粉并套袋。

2019年6月1日至6月20日，分別在人工授粉后12 h以及1、3、5、8、10、15和20 d各取2個子房，按照上述方法固定并用石蠟制片技術(shù)制片，子房縱切，切片厚度8 μm；用Olympus BX41光學(xué)顯微鏡觀察并拍照[8]。另外，人工授粉后28 d采集5個子房統(tǒng)計異花自交結(jié)實率。

1.3 數(shù)據(jù)計算和處理

采用EXCEL 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采用Adobe Photoshop 7.0軟件進行圖片處理。花粉萌發(fā)率=(每個視野萌發(fā)的花粉數(shù)/每個視野的花粉總數(shù))×100%；結(jié)實率=(每個子房的種子數(shù)/每個子房的胚珠平均數(shù))×100%。

2 結(jié)果和分析

2.1 雌、雄配子體發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化

2.1.1 小孢子和雄配子體解剖結(jié)構(gòu)的變化 睡蓮小孢子和雄配子體橫切面解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果(圖版Ⅰ)表明：睡蓮的雄配子體總體上經(jīng)歷了花粉母細胞期、減數(shù)分裂期、四分體期、小孢子游離期、單核靠邊期、單核花粉期、雙核花粉期，最終發(fā)育成成熟花粉。睡蓮花藥包含4個花粉囊(圖版Ⅰ-1)；花藥壁由外向內(nèi)依次由1層表皮細胞、1層藥室內(nèi)壁細胞、2層中層細胞和1層絨氈層細胞組成(圖版Ⅰ-2)，其中絨氈層細胞屬于分泌型。

開花前25和22 d，花藥中小孢子母細胞未分化；開花前19 d，花藥處于花粉母細胞期，花粉母細胞的細胞核較大，此時藥室內(nèi)壁變薄(圖版Ⅰ-2)；開花前16 d，花藥處于減數(shù)分裂期，此時絨氈層細胞的體積較大(圖版Ⅰ-3)；開花前13 d，花藥處于四分體期，四分體中4個小孢子呈四面體型排列，此時絨氈層細胞開始退化(圖版Ⅰ-4)；開花前10 d為小孢子游離期，小孢子的細胞質(zhì)較濃且細胞核較大，而絨氈層細胞內(nèi)含物減少(圖版Ⅰ-5)；開花前7 d為小孢子單核靠邊期，此時小孢子內(nèi)的液泡將細胞核擠到一側(cè)(圖版Ⅰ-6)；開花前4 d為單核花粉期，此時絨氈層細胞開始解體(圖版Ⅰ-7)；開花前1 d為雙核花粉期，此時絨氈層已經(jīng)完全解體，花藥壁僅由藥室內(nèi)壁和殘余表皮組成，藥室內(nèi)壁以條帶的形式徑向加厚，花粉形成營養(yǎng)核和生殖核2個細胞核(圖版Ⅰ-8，9)。

通過掃描電子顯微鏡觀察可見：睡蓮的成熟花粉粒呈球狀至橢球狀(圖版Ⅰ-10)，花粉溝為環(huán)型萌發(fā)溝(圖版Ⅰ-11)。離體花粉的萌發(fā)率為45.2%。

在睡蓮雄配子體發(fā)育過程中可以觀察到一些發(fā)育異常的現(xiàn)象(圖版Ⅰ-12～15)。在減數(shù)分裂期，2.4%的花藥內(nèi)出現(xiàn)絨氈層細胞內(nèi)含物減少且形態(tài)結(jié)構(gòu)混亂的現(xiàn)象，說明此時絨氈層細胞已經(jīng)開始解體(圖版Ⅰ-12)；在四分體時期，2.6%的花藥內(nèi)可觀察到形狀不規(guī)則的四分體(圖版Ⅰ-13)；在開花前1 d，3.7%的花藥內(nèi)可觀察到干癟且呈不規(guī)則長條狀的花粉(圖版Ⅰ-14)。此外，在掃描電子顯微鏡下也可觀察到花粉發(fā)育不正常的現(xiàn)象，其中有5.0%的花粉干癟不充實，花粉外壁紋飾缺失(圖版Ⅰ-15)。

2.1.2 大孢子和雌配子體解剖結(jié)構(gòu)的變化 睡蓮大孢子和雌配子體縱切面解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果(圖版Ⅱ-1～7)表明：睡蓮的雌配子體經(jīng)歷了大孢子母細胞期、二分體期、四分體期、單核胚囊期、雙核胚囊期、四核胚囊期，最終發(fā)育成完整的胚囊。睡蓮的胚珠為雙珠被、厚珠心和邊緣胎座(圖版Ⅱ-1)。

開花前16 d為大孢子母細胞期，此時大孢子母細胞具有明顯的細胞核，其體積大于周圍其他細胞(圖版Ⅱ-2)；開花前13 d為大孢子二分體期，二分體細胞的細胞質(zhì)濃厚且細胞核明顯(圖版Ⅱ-3)；開花前10 d為大孢子四分體期，其中靠近合點區(qū)的大孢子為功能大孢子(圖版Ⅱ-4)；開花前7 d為單核胚囊期，此時珠孔區(qū)的3個大孢子解體，合點區(qū)的功能大孢子形成單核胚囊(圖版Ⅱ-5)；開花前4 d為雙核胚囊期，此時單核胚囊經(jīng)過有絲分裂形成雙核胚囊，但體積無明顯增大(圖版Ⅱ-6)；開花前1 d為四核胚囊期，其中體積較大的1個核在胚囊的中央成為極核，另外3個核位于珠孔區(qū)，此時胚囊已發(fā)育完成(圖版Ⅱ-7)，其成熟胚囊為4細胞4核型胚囊，由1個單核中央細胞、1個卵細胞和2個助細胞組成。

在睡蓮雌配子體發(fā)育過程中也會出現(xiàn)一些異?，F(xiàn)象(圖版Ⅱ-8，9)。例如：大孢子出現(xiàn)發(fā)育停滯現(xiàn)象，敗育率為6.7%，此時胚珠珠心細胞開始降解(圖版Ⅱ-8)；當雌配子體發(fā)育到成熟胚囊階段時，可觀察到胚囊內(nèi)細胞核異常解體且胚珠珠心細胞已開始降解(圖版Ⅱ-9)，敗育率為5.8%。

2.2 人工授粉后子房解剖結(jié)構(gòu)的變化

人工授粉后睡蓮子房縱切面解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果(圖版Ⅱ-10～13)表明：睡蓮的胚胎發(fā)育經(jīng)歷了球形胚、橢球形胚和菱形胚3個階段。人工授粉后12 h，卵細胞完成受精作用形成受精卵，此時助細胞已經(jīng)退化消失(圖版Ⅱ-10)；受精極核與1個精子結(jié)合形成初生胚乳核，初生胚乳核分裂形成1個橫壁結(jié)構(gòu)，橫壁將胚囊分為珠孔區(qū)和合點區(qū)(圖版Ⅱ-10)，胚乳為細胞型胚乳；合點區(qū)的胚乳發(fā)育成單細胞單核的管狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅱ-10)，胚乳的發(fā)育早于胚的發(fā)育；受精后胚胎細胞不斷分裂，至人工授粉后8 d胚胎發(fā)育至球形胚期(圖版Ⅱ-11)；人工授粉后12 d，胚胎體積有所增大并呈橢球狀(圖版Ⅱ-12)；人工授粉后20 d，胚胎呈菱形，此時胚乳已經(jīng)消失(圖版Ⅱ-13)；人工授粉后28 d，種子發(fā)育成熟。統(tǒng)計結(jié)果表明：睡蓮的異花自交結(jié)實率較高，達到74.6%。

人工授粉后睡蓮子房的發(fā)育也會出現(xiàn)一些異?，F(xiàn)象(圖版Ⅱ-14，15)。在4.2%的子房中可以觀察到胚胎發(fā)育異常結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為胚胎停止發(fā)育且結(jié)構(gòu)混亂和細胞核解體等現(xiàn)象。

3 討論和結(jié)論

3.1 睡蓮繁殖器官發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的變化

睡蓮的花藥壁由5～7層細胞組成，與大部分被子植物的花藥壁結(jié)構(gòu)一致[9]?；ǚ鄢墒旌笏幨覂?nèi)壁增厚，這與睡蓮科萍蓬草屬(NupharSm.)[9]和水盾草屬(CabombaAubl.)[10]的藥室內(nèi)壁發(fā)育模式相似。睡蓮具有分泌型絨氈層，也與睡蓮科其他植物的絨氈層類型相同，如萍蓬草屬[9]和莼菜屬(BraseniaSchreb.)[11]，但也有研究者[12]認為萍蓬草屬和睡蓮屬的一些種類具有周原生質(zhì)型絨氈層。

睡蓮大孢子母細胞減數(shù)分裂后形成大孢子四分體，這與侏儒盧旺達睡蓮[7]的大孢子發(fā)育模式一致，但Zhou等[9]則認為同科種類萍蓬草〔Nupharpumila(Timm) de Candolle〕大孢子母細胞減數(shù)分裂后形成大孢子三分體。睡蓮科植物的雌配子體發(fā)育模式可分為4細胞4核和7細胞8核2類，例如，侏儒盧旺達睡蓮和萍蓬草的雌配子體為4細胞4核[7，9]，蓮屬(NelumboAdans.)種類則具有7細胞8核雌配子體[13]。Friedman等[14]以北美萍蓬草(NupharpolysepalaEngelm.)為研究對象，推斷睡蓮科植物可能均具有4細胞4核雌配子體，即成熟胚囊由1個卵細胞、2個助細胞和1個單核的中央細胞組成。睡蓮雌配子體發(fā)育過程的觀察結(jié)果表明：睡蓮的成熟胚囊為4細胞4核結(jié)構(gòu)，印證了Friedman等[14]對睡蓮科植物雌配子體發(fā)育模式的推論。Friedman等[14]認為，具有7細胞8核的雌配子體是被子植物的進化特征，據(jù)此可推斷4細胞4核雌配子體可能是被子植物的祖先特征，從側(cè)面進一步佐證了睡蓮屬種類是被子植物系統(tǒng)進化樹的基部類群[15]。

睡蓮科種類的胚乳發(fā)育類型為細胞型胚乳，例如萍蓬草屬[9]和蓮屬[16]的一些種類和睡蓮屬的侏儒盧旺達睡蓮[7]的胚乳均為細胞型胚乳。作者的觀察結(jié)果表明：睡蓮的胚乳為細胞型胚乳，在合點區(qū)發(fā)育成單細胞單核的管狀結(jié)構(gòu)，這一特征與Floyd等[17]對萍蓬草胚乳發(fā)育過程的觀察結(jié)果一致。

3.2 睡蓮繁殖器官發(fā)育過程中解剖結(jié)構(gòu)的異常變化

絨氈層主要為小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)，對小孢子的發(fā)育起關(guān)鍵作用[18]；絨氈層的提前解體勢必會影響小孢子的發(fā)育[19]。作者的觀察結(jié)果表明：睡蓮小孢子絨氈層細胞的提前解體可能對其小孢子發(fā)育產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致四分體形狀不規(guī)則，進而形成畸形花粉。睡蓮的形態(tài)異?；ǚ郾壤秊?.0%，花粉結(jié)構(gòu)異常勢必會影響花粉的萌發(fā)狀況，導(dǎo)致其花粉萌發(fā)率降低(僅45.2%)。但睡蓮花粉萌發(fā)率降低并不是影響其異花自交結(jié)實率下降的主要因子，而花粉數(shù)量是否滿足受精需要則是主要因子。

植物大孢子發(fā)生階段存在一定的敗育率，例如羊草〔Leymuschinensis(Trin.) Tzvel.〕的大孢子發(fā)育階段的敗育率為5%～15%[20]。作者的觀察結(jié)果表明：在睡蓮的大孢子和雌配子體發(fā)育過程中也存在多種敗育現(xiàn)象，其原因可能是功能大孢子的細胞壁胼胝質(zhì)積累異常[20]，也可能是珠心組織的解體導(dǎo)致大孢子和雌配子體的發(fā)育得不到足夠的營養(yǎng)供給。異花授粉后睡蓮有4.2%的胚胎在發(fā)育過程中敗育，其敗育機制可能與胚胎和胚乳發(fā)生過程中的細胞程序性死亡有關(guān)[21]。

綜上所述，睡蓮功能大孢子位于合點端，其成熟胚囊為4細胞4核結(jié)構(gòu)，這些生殖特征不同于大多數(shù)被子植物；另外，在大、小孢子，雌、雄配子體和胚胎發(fā)育過程中絨氈層細胞的提前解體、胚囊和胚胎的敗育可能會降低睡蓮異花自交結(jié)實率。