吳 彥，徐赫男，薛 云，劉啟斌，劉 鴻，李志華，陸 漓，許春平

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南寧 530001；2.康贊（北京）生物科技有限公司，北京 100176；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

近年來(lái)，隨著世界控?zé)熜蝿?shì)的日趨嚴(yán)峻，世界各國(guó)煙草行業(yè)已把研究和開(kāi)發(fā)包括口含型煙草在內(nèi)的新型煙草制品作為解決煙草行業(yè)未來(lái)發(fā)展瓶頸的重要手段和戰(zhàn)略取向［1，2］。由于口含型煙草制品不經(jīng)過(guò)燃燒環(huán)節(jié)，由口腔直接吸收，相對(duì)于傳統(tǒng)卷煙，消除了二手煙的危害，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為其安全性更高，是傳統(tǒng)卷煙的理想替代品［3，4］?？诤蜔煵葜破返难邪l(fā)和銷(xiāo)售在北歐和北美等一些國(guó)家和地區(qū)取得了較快發(fā)展，市場(chǎng)銷(xiāo)量不斷增加。然而，美國(guó)、瑞典等國(guó)家的口含煙制品在口味上并不能廣泛迎合中式卷煙消費(fèi)群體，中國(guó)亟需培育具有中國(guó)特色的新型煙草制品以應(yīng)對(duì)國(guó)際煙草巨頭的挑戰(zhàn)。

中醫(yī)中藥是中華民族的瑰寶。中醫(yī)學(xué)自古以來(lái)就有“藥食同源”理論。根據(jù)中藥的功能性配伍，在口含煙中添加從藥食同源的植物中提取的天然成分，不僅具有調(diào)節(jié)口味的傳統(tǒng)功效，而且其含有的活性成分還是對(duì)吸煙者健康的有益補(bǔ)充。

羅漢果，葫蘆科多年生藤本植物的果實(shí)，被譽(yù)為“神仙果”，是國(guó)家首批批準(zhǔn)的藥食兩用材料之一。羅漢果含豐富的維生素以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等成分，具有潤(rùn)肺止咳、生津止渴的功效。因此，將羅漢果提取物添加到口含煙中發(fā)揮其清咽利喉、生津止咳的功效，既能使消費(fèi)者享受吸煙帶來(lái)的滿足感，同時(shí)又能減輕煙草中的有害物質(zhì)對(duì)人體造成的傷害。然而，傳統(tǒng)方法提取的天然香料粗提物中不可避免地帶有蛋白質(zhì)、淀粉、蠟質(zhì)等大分子物質(zhì)［5，6］，這些物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響口含煙的吸食體驗(yàn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7-14］，復(fù)合生物酶可以降解植物細(xì)胞間質(zhì)中的大分子成分，使之轉(zhuǎn)化為單糖、氨基酸和致香物質(zhì)前體，同時(shí)還能破壞植物細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而改善提取物的口感，提高有效成分的提取得率。

本研究將生物酶解技術(shù)應(yīng)用于功能型口含煙天然香料的提取工藝中，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析化學(xué)成分，利用峰面積歸一化法計(jì)算各個(gè)峰的相對(duì)含量，對(duì)比了普通水提法和酶解法得到的羅漢果香料的揮發(fā)性化學(xué)成分。酶解法不僅能夠優(yōu)化提取物的風(fēng)味品質(zhì)，還可以提高致香成分的含量，為研究和開(kāi)發(fā)具有中國(guó)特色的新型煙草制品供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羅漢果，購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)桂林市；口含煙基料，上海新型煙草研究院提供；α-淀粉酶、纖維素酶、漆酶、果膠酶、風(fēng)味蛋白酶由康贊（北京）生物科技有限公司提供；無(wú)水乙醇、碳酸氫鈉、丙二醇、山梨酸鉀、木糖醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N-1300DW型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA NVP-2000型隔膜真空泵、EYELA CA-116A型 冷卻水循環(huán)裝置，上海艾朗科技有限公司；HWCL-5型集熱式恒溫磁力攪拌浴，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GZ120 GZ120.S型懸臂式恒速?gòu)?qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī)，江陰市保利科研器械有限公司；303-4B型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱，余姚市儀器儀表廠；Q-100A3型高速多功能粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司；TG-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)，常州市金壇高科儀器廠；Agilent 6890/5973型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；MS204S型分析天平，Mettler Toled。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 常規(guī)醇提法制備羅漢果口含煙用香料 將羅漢果粉碎至40目，精確稱(chēng)取100.00 g羅漢果粉末，置于1 000 mL的圓底燒瓶中，每次加入75%的乙醇600 mL，回流提取2次，每次2 h，將2次浸提液合并，于50℃下減壓濃縮，得到相對(duì)密度為1.33的羅漢果浸膏38.75 g。將上述羅漢果浸膏加入100 mL無(wú)水乙醇充分回溶，將其回溶液在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用0.20 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，得到紅棕色羅漢果口含煙用香料，冷凍待分析。

1.3.2 酶解法制備羅漢果口含煙用香料 將羅漢果粉碎至40目，精確稱(chēng)取100.00 g羅漢果粉末，置于1 000 mL的圓底燒瓶中。加入50 mL混合酶制劑（其中溶有α-淀粉酶0.2 mol/L、纖維素酶0.3 mol/L、果膠酶0.15 mol/L、風(fēng)味蛋白酶0.3 mol/L），于55℃下酶解反應(yīng)2 h。酶解后，將混合物在115℃下高溫處理，使酶制劑中的酶失活。將經(jīng)酶制劑處理過(guò)的羅漢果用600 mL 75%的乙醇水溶液于80℃下回流提取2次，每次2 h。將2次浸提液合并，減壓濃縮除去溶劑，制得相對(duì)密度為1.32的羅漢果浸膏50.80 g。將上述羅漢果浸膏加入100 mL無(wú)水乙醇充分回溶，將其回溶液在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，用0.20 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，得到棕褐色羅漢果口含煙用香料，冷凍待分析。

1.3.3 羅漢果煙用香料的GC-MS分析

1）樣品的預(yù)處理。準(zhǔn)確稱(chēng)取20.00 g制備好的樣品于1 L圓底燒瓶中，加入300 mL去離子水和適量沸石，同時(shí)蒸餾萃取裝置的另一端為裝有40 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶，在水浴溫度60℃下萃取2 h。萃取完畢后，向萃取液中加入0.2 mL內(nèi)標(biāo)溶液（稱(chēng)取0.50 g硝基苯置于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度），減壓濃縮至2 mL，用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后進(jìn)行GC/MS分析。每個(gè)樣品平行測(cè)定5次。

2）GC/MS分析。GC/MS分析條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度50℃，維持3 min，以5℃/min升溫 至260℃，維 持5 min；汽 化 溫度：270℃；載氣：He，1 mL/min；分流比：5∶1；電離方式：電子轟擊（EI）；檢測(cè)器溫度：300℃；傳輸線溫度：280℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；質(zhì)量掃描范圍：30～700 amu；檢索譜庫(kù)：NIST11譜庫(kù)。

1.3.4 羅漢果風(fēng)味袋裝口含煙的制備 取4份50 g口含煙基料，分別加入5、10、15、20 g口含煙用羅漢果提取物，5 g甜味劑（50%的蜂蜜和50%的木糖醇），在溫度為80℃的條件下，于恒溫恒濕箱中濕熱處理2 h。將濕熱處理后的煙草物料水分含量調(diào)節(jié)到40%。在水分調(diào)節(jié)后的物料中加入2.0 g碳酸氫鈉作為酸堿調(diào)節(jié)劑并混合均勻。在酸堿調(diào)節(jié)后的混合物料中噴灑加入3 g食用薄荷精油。在加香后的物料中添加2 g維生素E、0.15 g山梨酸鉀和2 g丙二醇，密封平衡后用熱封過(guò)濾紙包裝成小袋，紫外殺菌處理后即得羅漢果風(fēng)味的袋裝口含煙制品。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品特征描述

通過(guò)普通醇提法和酶解法制備的羅漢果口含煙用香料的外觀、收率及香型特征如表1所示。由表1可知，酶解法提取的羅漢果口含煙用香料收率為50.80%，明顯高于普通醇提法的收率38.75%，原因是復(fù)合酶可以破壞細(xì)胞間質(zhì)的致密成分，從而減少細(xì)胞滲透阻力，促使有效成分充分溶出。2種提取方法得到的羅漢果浸膏都具有羅漢果的特征香味，酶解提取法得到的羅漢果浸膏顏色加深，香氣更加醇厚，層次感更加豐富，原因是生物酶可以降解羅漢果中的淀粉、蛋白質(zhì)、鞣酸等對(duì)口味不利的大分子物質(zhì)，使之轉(zhuǎn)化為氨基酸、單糖等小分子物質(zhì)和致香物質(zhì)前體，從而改善和豐富提取物的口感。

表1 不同提取方法制備的羅漢果香料的外觀及香型特征

2.2 GC/MS分析鑒定結(jié)果

對(duì)羅漢果提取物選用HP-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣0.5 μL，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，采用峰面積歸一法，定量出各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。按照上述GC-MS分析條件對(duì)羅漢果揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行分析，通過(guò)譜庫(kù)檢索（譜庫(kù)：NIST11譜庫(kù)），醇提法和酶解法分別鑒定出揮發(fā)性半揮發(fā)性成分22種和30種，分析結(jié)果如表2和表3所示。

表3 羅漢果提取物揮發(fā)性香味化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果（酶解法）

從表2可以看出，醇提法提取的羅漢果浸膏中，共分離并鑒定出了22種化合物，所鑒定的組分占總峰面積的92.60%。主要成分有角鯊烯（14.32%）、順式十八碳-9-烯酸（12.58%）、香葉基芳樟醇（12.48%）、棕櫚酸（10.26%）、香葉基香葉醇（9.27%）、硬脂酸（8.47%）、2-亞甲基-5α-膽甾烷-3β-醇（7.36%）、5-羥甲基糠醛（4.28%）等。

表2 羅漢果提取物揮發(fā)性香味化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果（醇提法）

從表3可以看出，酶解法提取的羅漢果浸膏中，共分離并鑒定出了30種化合物，所鑒定的組分占總峰面積的95.83%。主要成分有糠醛（12.46%）、香葉基香葉醇（13.34%）、棕櫚酸（12.43%）、香葉基芳樟醇（9.26%）、硬 脂 酸（6.25%）、5-羥 甲 基 糠 醛（6.21%）、2-亞甲基-5α-膽甾烷-3β-醇（5.78%）、2-乙酰基吡咯（4.27%）等。

比較分析表2和表3，醇提法和酶解法提取的羅漢果香料中致香物質(zhì)的成分和含量存在一些差異，采用醇提法制備的羅漢果浸膏中，含量較高的致香成分主要有酸類(lèi)、烯烴類(lèi)、醇類(lèi)和醛類(lèi)等。酶解法制備的羅漢果浸膏中，主要致香成分除了醛類(lèi)、醇類(lèi)和酸類(lèi)外，還包括酯類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)等化合物。酶解法提取的羅漢果香料中含有5-羥甲基糠醛、角鯊烯、金合歡醇、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮、香葉基香葉醇、香葉基芳樟醇、順-β-金合歡烯等豐富的香味成分物質(zhì)，其中，5-羥甲基糠醛具有似焦糖、谷物烘烤氣息，有果香、面包香；角鯊烯是煙葉中非色素的萜烯類(lèi)物質(zhì)，既能增進(jìn)煙葉的香氣和吸味，又可通過(guò)降解轉(zhuǎn)化形成致香成分；金合歡醇［15］具有特有的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻；順-β-金合歡烯、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮等也是煙葉中的重要致香成分。

酶解法提取的羅漢果浸膏致香成分的種類(lèi)更加豐富，原因是復(fù)合酶制劑可以使對(duì)口味不利的蛋白質(zhì)、淀粉、鞣酸、蠟質(zhì)等大分子物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化為致香物質(zhì)前體，從而促進(jìn)致香物質(zhì)的積累和生成。

2.3 羅漢果提取物添加到口含煙的感官評(píng)價(jià)結(jié)果

將酶解法制備的羅漢果提取物添加到口含煙基料中，按“1.3.4”方法制成袋裝口含煙制品。組織專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，該香料添加量為口含煙基料的質(zhì)量百分比30%時(shí)口感最佳，羅漢果的香味醇厚，口味甘甜，潤(rùn)肺止渴生津，且與煙草本身所特有的味道完美融合，口感純正。

3 小結(jié)

酶解法提取的羅漢果香料致香成分含量豐富，適用于口含煙加香。將該香料按照質(zhì)量比30%添加到袋裝口含煙中，羅漢果的香味醇厚，口味甘甜，潤(rùn)肺止渴生津，且與煙草本身所特有的味道完美融合。該羅漢果提取物豐富了袋裝口含煙制品的風(fēng)格特征，改善了袋裝口含煙口感協(xié)調(diào)舒適性，既滿足了吸食者的心理需求，又保護(hù)了吸食者的身體健康，賦予產(chǎn)品多元化功能。