趙佳福， 游敏芳， 諶穎蓮， 吳小敏， 倪 鍇

(1. 貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 3. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

脂肪是動物體的重要儲能物質(zhì)，與機體能量平衡相關(guān)，脂肪在動物體內(nèi)的分布和含量影響肉產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味[1]。脂肪主要是由中胚層的特化細(xì)胞群分化而來，其分化是1個復(fù)雜的調(diào)控過程，伴隨著細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，受到PPARγ、C/EBPα等多種轉(zhuǎn)錄因子和PKA(Protein kinase A system)、MAKP(Mitogen-activated protein kinase)等信號通路的調(diào)控[2]。其中脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase，LPL)是影響脂肪沉積的關(guān)鍵酶之一[3]，由臟器實質(zhì)細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成和分泌，相對分子量為60 kD的糖蛋白。新轉(zhuǎn)錄合成的LPL是無活性的酶前體，活化后的LPL作為脂質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運、清除及脂質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶，能將富含甘油三酯(TG)的乳糜微粒(Chylomicron，CM)、低密度脂蛋白(Low-density lipoproteins，LDL)與極低密度脂蛋白(Very low-density lipoproteins，VLDL)水解為游離脂肪酸和單酰甘油[4]，此外還能清除體內(nèi)過多的甘油三酯，能將血漿中富含脂質(zhì)的脂蛋白降解，是影響脂肪沉積的關(guān)鍵蛋白[5，6]。本試驗前期研究發(fā)現(xiàn)，在豬脂肪前體細(xì)胞分化早期(0～72 h)，LPL基因表達量的高低與脂肪細(xì)胞的分化成正比，可以作為脂肪細(xì)胞分化的重要標(biāo)記基因[7]。此外本課題組采用miRsystem在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-27b-3p也可以靶向調(diào)控LPL基因的表達。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪代謝還受到miRNA的調(diào)控。miRNA由Rosalind C.Lee等在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，可以與Line4基因的3’非翻譯區(qū)形成互補序列，從而抑制該基因的表達。miRNA是1類長度約20個核苷酸的小RNA，通過與靶基因非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合，抑制靶基因的表達，在控制生物發(fā)育、機體代謝[8，9]、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化[10]、細(xì)胞增殖、免疫炎癥和腫瘤發(fā)生等過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[11，12]。在脂肪沉積方面，miRNA-27、miRNA-34、miRNA-130家族中多個成員都參與了脂肪沉積的調(diào)控，如miRNA-27b被確定為人和小鼠重要的脂肪代謝調(diào)控因子，能夠調(diào)節(jié)幾種關(guān)鍵的脂質(zhì)代謝基因的表達[13]；豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，miRNA-34c通過在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平抑制PPARγ、FABP4、FASN的表達，抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化[14]。在對非酒精性脂肪肝的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-27b-3p能顯著促進3T3-L1細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化，并與脂質(zhì)積累和細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量有關(guān)，而且上調(diào)miRNA-27b可通過誘導(dǎo)?；o酶a硫酯酶2的表達促進脂肪細(xì)胞分化[15]。然而，miRNA-27b-3p是否也參與豬脂肪前體細(xì)胞分化目前還不清楚。本試驗通過檢測豬脂肪前體細(xì)胞中miRNA-27b-3p對LPL基因mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響，研究其對豬脂肪前體細(xì)胞分化的作用，為后續(xù)研究miRNA-27b-3p在脂肪沉積中的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料豬脂肪前體細(xì)胞，由本課題組分離并經(jīng)過油紅O染色鑒定。

1.2 主要試劑TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛)，SYBR熒光定量PCR試劑盒(凱杰生物)，2×EsTaqMasterMix(康為世紀(jì)生物科技有限公司)，F(xiàn)uGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑(羅氏公司)，DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基?(Gibco)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(ScienCell)，胰蛋白酶(Hyclone)，RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)，豬脂蛋白酯酶酶聯(lián)免疫試劑盒(Andy gene)。

1.3 主要儀器梯度PCR儀(ABI，VeritiTM)、實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD，CFX96)、凝膠成像系統(tǒng)(BioRad，UniversalHoodⅡ)、倒置熒光顯微操作系統(tǒng)(Nikon，Ti-S)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek，Synergy H1)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，Midi40)、超微量紫外分光光度計(Thermo，NanoDrop 2000)。

1.4 方法

1.4.1 miRNA模擬物和熒光定量引物的合成利用在線軟件miRsystem(http：//mirsystem.cgm.ntu.edu.tw/)預(yù)測與miRNA-27b-3p具有靶向調(diào)控關(guān)系的候選靶基因，最終選擇與豬脂肪前體細(xì)胞分化相關(guān)的LPL基因為研究對象。miRNA-27b-3p 模擬物(GCGGCATTCACAGTGGCT)、陰性對照(Negative control，NC)由上海吉瑪基因公司合成。根據(jù)GenBank中豬LPL基因mRNA序列(NM_214286.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計LPL基因熒光定量PCR引物，以GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物送上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.4.2 豬脂肪前體細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染(1)細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速37 ℃水浴解凍，細(xì)胞解凍后采用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至細(xì)胞瓶壁90%左右進行傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：為確保后續(xù)試驗中RNA和蛋白質(zhì)的提取量，試驗采用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪板，待細(xì)胞達到80%豐度時開始轉(zhuǎn)染。分別設(shè)計試驗組和對照組，每組3個重復(fù)，各組加樣體系如下。試驗組：miRNA-27b-3p 模擬物 5 μL，脂質(zhì)體10 μL， Opti-MEM培養(yǎng)基100 μL；對照組：NC 5 μL，脂質(zhì)體10 μL，Opti-MEM 培養(yǎng)基100 μL。轉(zhuǎn)染步驟參照FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染試劑說明書方法進行。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24、48 h后進行RNA提取、ELISA試驗和甘油三酯檢測。以上試驗重復(fù)3次：第1次試驗所有細(xì)胞用于提取總RNA，進行熒光定量PCR試驗；第2次試驗用于提取細(xì)胞總蛋白，進行ELISA試驗；第3次試驗用于細(xì)胞中甘油三酯的檢測。

1.4.3 細(xì)胞中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染24、48 h后，將轉(zhuǎn)染不同樣品的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，然后參照TRIzol試劑提取說明書進行各組細(xì)胞總RNA的提取。提取完成后，采用超微量紫外可見分光光度計檢測RNA的濃度和純度，根據(jù)檢測結(jié)果將轉(zhuǎn)染不同樣品的總RNA終濃度稀釋至120 ng/μL，隨后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于熒光定量PCR 試驗。

1.4.4 實時熒光定量PCR以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，以QuantFastTMSYBR?Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。反應(yīng)體系10 μL：PCR Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.7 μL，ddH2O 3.3 μL。根據(jù)事先確定的LPL基因與內(nèi)參基因的最佳退火溫度設(shè)置反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；95 ℃終延伸0.5 s。反應(yīng)結(jié)束后以熔解曲線檢測擴增過程中引物的特異性。

1.4.5 細(xì)胞總蛋白的提取及ELISA分析(1)細(xì)胞蛋白提取：為防止蛋白降解，在提取細(xì)胞總蛋白前，在RIPA裂解液1 mL中加入PMSF 50 μL。然后用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞孔3次，每孔加入RIPA裂解混合液150 μL，冰上裂解30 min，期間采用200 μL移液器反復(fù)吹打3～5次，然后將3個裂解相同樣品的細(xì)胞懸液收集至1支新的Eppendorf管中(1.5 mL)，4 ℃ 13 000 r/min離心2 min，將上清轉(zhuǎn)移至1支新的離心管中，用于ELISA試驗或置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)ELISA試驗：根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明書配制BCA工作液，稀釋牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品，用多功能酶標(biāo)儀測定A562 nm吸光值(D562 nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光值和稀釋濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出待測樣品蛋白濃度。根據(jù)豬脂蛋白酯酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測范圍稀釋蛋白濃度。

1.4.6 細(xì)胞中甘油三酯含量的測定由于LPL在將甘油三酯水解為游離脂肪酸和單酰甘油的過程中扮演了限速酶的作用，因此可以通過檢測細(xì)胞中甘油三酯的含量判斷LPL的表達量。測定步驟如下：分別轉(zhuǎn)染miRNA-27b-3p和對照組24、48 h后 ，將不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，再參照甘油三酯檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞，每組3個重復(fù)。將處理好的細(xì)胞按以下程序加樣?？瞻捉M：蒸餾水10 μL+工作液1 000 μL；校準(zhǔn)組：校準(zhǔn)品10 μL+工作液1 000 μL；樣品組：樣品10 μL+工作液1 000 μL。加好樣后混勻，37 ℃孵育10 min，用酶標(biāo)儀測定D562 nm值。甘油三酯含量(mmol/L)=(樣品D562 nm-空白D562 nm)÷(校準(zhǔn)D562 nm- 空白D562 nm)×校準(zhǔn)品濃度(mmol/L)÷待測樣品蛋白濃度(gprot/L)。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(1)qRT-PCR：獲得試驗組和對照組Ct值后，采用2-△△Ct法分析LPL基因在對照組和試驗組中的相對表達量，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示?！鰿t(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。(2)ELISA試驗和甘油三酯檢測：試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，最后采用SPSS Statistics 17.0 數(shù)據(jù)分析軟件和Graphpad Prism 5 圖形分析軟件分別進行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA-27b-3p在轉(zhuǎn)錄水平對LPL基因表達量的影響以GAPDH基因作為qRT-PCR試驗的內(nèi)參基因，得到LPL基因和GAPDH基因表達量的熔解曲線圖(見圖1)。結(jié)果顯示：目的基因LPL和內(nèi)參基因GAPDH的擴增曲線拐點清晰，斜率較高，均呈現(xiàn)S型，表明結(jié)果較好，擴增效率較高；熔解曲線均為光滑的單峰曲線，且退火溫度附近無明顯雜峰，說明引物特異性、重復(fù)性好，無引物二聚體出現(xiàn)，符合試驗要求。qRT-PCR結(jié)果顯示：miRNA-27b-3p轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞中LPL基因的表達量被顯著抑制，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染48 h 后2組間無顯著差異(見圖2)。以上結(jié)果說明在轉(zhuǎn)染24 h后miRNA-27b-3p能顯著抑制豬脂肪前體細(xì)胞中LPL基因的表達，從而在轉(zhuǎn)錄水平降低脂質(zhì)含量的沉積。

A BA.擴增曲線：左側(cè)為GAPDH基因擴增曲線，右側(cè)為LPL基因擴增曲線； B.熔解曲線：左側(cè)為GAPDH基因熔解曲線，右側(cè)為LPL基因熔解曲線圖1 LPL基因的擴增曲線和熔解曲線

**表示差異極顯著(P<0.01) miRNA-27b-3p NC 圖2 轉(zhuǎn)錄水平LPL基因的表達量 圖3 翻譯水平LPL蛋白的表達量 圖4 甘油三酯的表達量

2.2 miRNA-27b-3p在翻譯水平對LPL蛋白表達量的影響ELISA試驗結(jié)果顯示：在豬脂肪前體細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-27b-3p 24、48 h后對細(xì)胞中的LPL蛋白表達量均有極顯著抑制作用(P<0.01)(見圖3)。

2.3 miRNA-27b-3p對豬脂肪前體細(xì)胞中甘油三酯含量的影響甘油三酯測定結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-27b-3p 24、48 h后對豬脂肪前體細(xì)胞中甘油三酯的表達量均有極顯著抑制作用(P<0.01)(見圖4)。

3 結(jié)論

miRNA-27b-3p通過靶向作用降低LPL基因的表達，抑制豬脂肪前體細(xì)胞的分化，進而影響脂肪的形成。

4 討論

4.1成熟的脂肪細(xì)胞是由脂肪前體細(xì)胞分化而來，而脂肪前體細(xì)胞在轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細(xì)胞的過程中，先后需要經(jīng)過細(xì)胞增殖、生長停滯和終末分化幾個階段，而這一轉(zhuǎn)化過程受諸多調(diào)控因子的影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在脂肪分化過程中發(fā)揮著重要的作用。如：miRNA-130b可與PPARγ、C/EBP-β3基因的3’UTR端結(jié)合，降低其mRNA水平，從而抑制豬脂肪的沉積[15，16]；miRNA-425-5p在豬骨骼肌中富集，在豬肌內(nèi)脂肪前體細(xì)胞中miRNA-425-5p下調(diào)PPARγ、FABP4、FASN的表達，從而抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化[17]；同樣在豬脂肪前體細(xì)胞中miRNA-34a可通過靶向抑制ACSL4基因的表達來促進脂肪細(xì)胞的增殖分化，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞脂滴含量的積累增多[18]；其次miRNA-34c可與E2F3和KLF4基因靶向結(jié)合，過表達miRNA-34c導(dǎo)致豬脂肪前體細(xì)胞中的PPARγ、FABP4、FASN的mRNA與蛋白均被顯著下調(diào)，抑制脂肪細(xì)胞的增殖與分化[14]。除此之外，miRNA-27家族的多個成員已經(jīng)被證實在脂肪沉積中具有重要調(diào)控作用。如：3T3-L1細(xì)胞中，miRNA-27a通過結(jié)合PPARγ基因非翻譯區(qū)來阻遏下游多種脂肪生成的標(biāo)志基因脂聯(lián)素、CD36、LPL的表達，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[19]；另外對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSCs)的研究發(fā)現(xiàn)，視黃醇X受體a(RXRa)被證實是miRNA-27a和miRNA-27b的靶點，miRNA-27a和miRNA-27b可以通過靶向RXRa基因進而調(diào)節(jié)HSCs脂肪代謝和細(xì)胞增殖[20]。

4.2鑒于miRNA-27家族在脂肪沉積中的重要作用，本試驗通過miRsystem在線軟件對miRNA-27b-3p的靶基因進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPL基因是miRNA-27b-3p的重要互作靶點。已有其他研究發(fā)現(xiàn)，LPL基因在脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的過程中對脂肪酸代謝發(fā)揮了重要作用，尤其是在肌內(nèi)脂肪合成時能控制脂肪和肌肉中甘油三酯的分配，控制肌內(nèi)脂肪的沉積和代謝[21]，因此常被作為脂肪生成的重要標(biāo)志基因。本試驗通過在豬脂肪前體細(xì)胞中過表達miRNA-27b-3p，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平觀察miRNA-27b-3p的上調(diào)對LPL基因表達的影響，間接判斷miRNA-27b-3p靶向調(diào)控LPL基因?qū)χ厩绑w細(xì)胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miRNA-27b-3p的上調(diào)均在一定程度上抑制了LPL基因的表達，間接影響了細(xì)胞的分化。為了證明結(jié)果的可靠性，試驗還觀察了上調(diào)miRNA-27b-3p后對脂肪前體細(xì)胞中甘油三酯表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：上調(diào)miRNA-27b-3p后，脂肪前體細(xì)胞中甘油三酯的表達量均極顯著降低。由于甘油三酯升高是脂肪細(xì)胞堆積的重要指標(biāo)，因此從另一方面說明miRNA-27b-3p上調(diào)抑制了LPL基因的表達，間接抑制了脂肪前體細(xì)胞的分化和脂肪的生成。此外，隨著對非編碼RNA的研究發(fā)現(xiàn)，除了miRNA對脂肪分化存在調(diào)控作用，LncRNA(長鏈非編碼RNA)也在脂肪調(diào)控中發(fā)揮重要作用[22，23]。本試驗結(jié)果表明，miRNA-27b-3p可通過靶向降低LPL基因的表達，進而抑制豬脂肪前體細(xì)胞的分化與脂肪的形成。但是在此過程中是否有LncRNA參與這一調(diào)控過程目前還不清楚，因此關(guān)于LPL、miRNA-27b-3p及相關(guān)LncRNA共同調(diào)控豬脂肪前體細(xì)胞的分化還需進一步研究。