黃衛(wèi)彤 劉錦嵩 王宗杰 廖旺 張峰，4 朱茂靈 鄢盛愷*

1南寧市婦幼保健院（南寧 530011）

2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（遵義 563003）

3遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院（遵義 563006）

4中國科學(xué)院北京基因組學(xué)研究所（北京 100101）

聽力損失(hearing loss，HL)，即耳聾，是一種常見的導(dǎo)致聽覺敏感度下降的疾病，嚴(yán)重降低患者的生存質(zhì)量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新數(shù)據(jù)，世界上約有4.3億人患有HL，包括3400萬兒童，超過世界人口的5%；預(yù)計到2050年，患有各種程度HL的人數(shù)將達(dá)25億人，至少7億人需要聽力康復(fù)治療[1]。HL的發(fā)病主要受到遺傳和環(huán)境兩方面因素的影響，其中與遺傳因素相關(guān)的HL占60%，根據(jù)臨床表現(xiàn)，遺傳性HL（hereditary hearing loss，HHL）患者中70%為非綜合征型HL（Nonsyndromic hearing loss，NSHL），30% 為綜合征型 HL（Syndromic hearing loss，SHL）[2]。耳聾的基因組異質(zhì)性很高，廣泛的研究表明，HHL的耳聾基因突變頻率在不同地區(qū)和不同民族之間差異很大，為了進(jìn)一步分析南寧市新生兒耳聾基因突變情況以及耳聾基因突變與HL的關(guān)聯(lián)性，本研究針對GJB2、SLC26A4和GJB3采用靶向捕獲高通量測序方法對1007例聽力初篩未通過的新生兒進(jìn)行測序分析，以評估新生兒聽力篩查的準(zhǔn)確性，為耳聾致病基因聯(lián)合新生兒聽力篩查的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取出生于2016年1月-2018年12月經(jīng)南寧市新生兒疾病篩查中心17000名新生兒聽力初篩未通過的1007例新生兒為研究對象，并收集其足跟血樣本進(jìn)行耳聾相關(guān)基因靶向捕獲高通量測序（包括GJB2、GJB3、SLC26A4），通過廣西全民健康信息平臺查看這些新生兒的基本信息、聽力復(fù)篩和確診結(jié)果。本研究由南寧市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)許可，所有參與該研究的新生兒家屬都簽署了知情同意書。

1.2 新生兒聽力篩查方法

聽力初篩采用RESONANCE?R14O篩查型耳聲發(fā)射儀（意大利產(chǎn)）進(jìn)行耳聲發(fā)射（Otoacoustic emission，OAE）檢測，在新生兒出生后48～72h或出院前完成，初篩未通過者在出生后的42天內(nèi)完成復(fù)篩，復(fù)篩采用OAE和自動聽性腦干誘發(fā)電位反應(yīng)（Automatic auditory brainstem response，AABR）組合檢測，測試環(huán)境噪聲均低于30dB(A)，AABR以在正常聽力級30～35dBnHL能引出V波為通過，一律雙耳復(fù)篩，仍未通過者則在出生后3～6個月時進(jìn)行HL確診檢查。確診檢查采用聽性腦干反應(yīng)（Auditory brainstem response，ABR）閾值做聽力損失分級：平均聽閾31-50dBnHL為輕度，51-70dBnHL為中度，平均聽閾71-90dBnHL為重度，≥90dBnHL為極重度。

1.3 標(biāo)本采集和DNA準(zhǔn)備

由護(hù)士采集新生兒靜脈血或足跟血，制成3個血斑濾紙并晾干，保存于-20度冰箱，留待檢測。用血片打孔器將血斑打孔得到6mm直徑的干燥血斑，經(jīng)萃取后，用DNA提取試劑（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA。

1.4 標(biāo)本采集和DNA準(zhǔn)備

根據(jù)Illumina MiniSeq平臺的操作流程將提取的gDNA用于文庫的構(gòu)建和測序，測序流程可簡單概括為：樣本gDNA濃度的檢測、文庫給構(gòu)建，對目的片段進(jìn)行富集擴(kuò)增以及純化、文庫的定量和質(zhì)檢、上機(jī)測序以及數(shù)據(jù)過濾。儀器包括PCR儀（ABI 2720 PCR），熒光定量PCR儀（ABI 7500）、測序儀（Illumina MiniSeq），配套試劑有PCR反應(yīng)試劑（TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2）、文庫定量試劑盒（KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms）。

1.5 統(tǒng)計分析

等位基因頻率，關(guān)聯(lián)分析，H-W遺傳平衡效驗(yàn)采用PLINK 1.9[3]程序包進(jìn)行分析，P＞0.05符合HW遺傳平衡，關(guān)聯(lián)分析用比值比(odd ratio，OR)表示，P＜0.01為具有統(tǒng)計學(xué)意義；其他數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，突變等位基因頻率和突變攜帶率以百分率（%）表示。

1.6 突變生物信息分析

運(yùn)用BWA（Burrows Wheeler Aligner）軟件與人類基因組hg19進(jìn)行比對單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和插入缺失（indel）。通過Picard和GATK等軟件進(jìn)行鑒定并采用snpEff軟件和dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、HGMD、ClinVar等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋和功能預(yù)測。根據(jù)《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》，將突變的臨床意義定義為“致病的”、“可能致病的”、“意義不明確的(VUS)”、“可能良性的”和“良性的”[4]。

1.7 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用RaptorX在線服務(wù)器[5]預(yù)測候選基因表達(dá)出的三維蛋白結(jié)構(gòu)，用PyMOL對RaptorX預(yù)測的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖像處理。候選突變基因表達(dá)的氨基酸序列參考NCBI數(shù)據(jù)庫，比較突變型和野生型蛋白的二級結(jié)構(gòu)及功能變化。

2 結(jié)果

2.1 新生兒聽力篩查情況

初篩未通過的1007例新生兒在出生后的42天內(nèi)完成復(fù)篩，其中181例（17.97%，181/1007）未通過復(fù)篩，這些新生兒在出生后3～6個月內(nèi)完成HL確診檢查，78例（0.46%，78/17000）確診HL，其中單耳輕度24例，中度2例，重度4例，極重度4例，雙耳輕度29例，中度2例，重度3例，極重度2例，其余8例左耳和右耳的嚴(yán)重程度不同。78例確診HL患兒滿6個月后進(jìn)行藥物治療3例，佩戴助聽器4例，其余71例進(jìn)行了包括聽力補(bǔ)償、聽覺言語康復(fù)、行為康復(fù)治療以及教育等相關(guān)項(xiàng)目等干預(yù)。

2.2 耳聾基因測序結(jié)果

針對GJB2、GJB3、SLC26A4測序共檢測出709個突變等位基因，突變情況及等位基因頻率見圖1。聽力初篩未通過的新生兒中有355例（35.25%，355/1007）攜帶至少一種突變等位基因，237例檢出12種“致病的”或“可能致病的”突變位點(diǎn)，其中58例（24.48%，58/237）確診HL；78例檢出新錯義突變位點(diǎn)（c.217C＞A、c.316T＞G、c.676G＞T、c.739T＞C），其中2例攜帶GJB2c.217C＞A確診HL，13例聽力確診正常者檢出11種非編碼區(qū)多態(tài)突變。GJB2、GJB3、SLC26A4基因的突變攜帶率分別為1.75%（297/17000）、0.66%（113/17000）、0.36%（61/17000），等位基因頻率分別為25.07%（505/2014）、6.51%（131/2014）、3.33%（67/2014）。78例確診HL的新生兒中，檢出GJB2、GJB3、SLC26A4基因突變的占比分別為83.33%（65/78）、12.82%（10/78）、2.56%（2/78），其中檢出GJB2基因復(fù)合雜合突變9例，純合突變38例，均為致病突變，單雜合突變12例，為致病或可能致病突變，GJB3基因單雜合突變3例，多基因突變7例，另有9例（11.34%，9/78）未檢測到基因突變。檢出GJB2基因突變的確診新生兒，輕度聽力損失占68.93%、中度占8.74%、重度占11.65%、極重度占10.68%，檢出GJB3基因突變的確診新生兒，輕度聽力損失占58.33%、中度占8.33%、重度占33.33%、無極重度，檢出SLC26A4基因突變的兩例均為輕度聽力損失。

圖1 耳聾相關(guān)基因突變情況及等位基因頻率,“致病的”或“可能致病的”突變顯示為紅色柱。Fig.1 Deafness-related gene mutation and allele frequency,"pathogenic"or"possibly pathogenic"mutation is shown as red columns.

2.3 突變位點(diǎn)與HL的關(guān)系

以確診HL且突變陽性的新生兒為病例組、未確診HL且突變陽性的新生兒為對照組。分析本研究檢出的耳聾相關(guān)基因突變位點(diǎn)與HL之間的關(guān)聯(lián)，選取突變例數(shù)達(dá)到統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的候選突變位點(diǎn)GJB2:c.109G＞A（8.99%）、c.79G＞A（4.82%）、c.608T＞C（2.53%）、c.341A＞G（3.77%），GJB3:c.357C＞T（3.92%）進(jìn)行分析；哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)和基因型與表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表1、2。結(jié)果顯示除c.109G＞A（c2=23.907；P＜0.001）外，其他候選位點(diǎn)的等位基因頻率在病例組和對照組中均符合HW遺傳平衡；除 c.608T＞C（Z=1.407；P＞0.05）外，其他候選位點(diǎn)的突變基因型與表型的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Hardy-Weinberg's equilibrium test result

表2 表型-基因型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 2 Results of phenotype-genotype association analysis

2.4 蛋白預(yù)測結(jié)果

結(jié)果顯示（圖2），c.109G＞A和c.79G＞A對應(yīng)的氨基酸序列改變分別為GJB2p.Val37Ile、GJB2p.Val27Ile，兩個位點(diǎn)都是由纈氨酸（Val）置換為異亮氨酸（Ile），這兩個種氨基酸都為非極性，兩種預(yù)測的突變型蛋白氫鍵連接、α-螺旋、β-折疊與其野生型相比均沒有差異，因?yàn)镚JB3:c.357C＞T屬于同義突變，GJB2：c.341A＞G屬于非外顯子突變，故不能生成相應(yīng)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

圖2 候選突變基因野生型和突變型預(yù)測三維蛋白結(jié)構(gòu)對比圖,黃色虛線表示氫鍵，氨基酸殘基上藍(lán)色表示氫鍵受體，紅色表示氫鍵供體；蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲分別以綠色、紫色、粉色著色；Val：纈氨酸、Ile：異亮氨酸。Fig.2 Comparison diagram of three-dimensional protein structure predicted by wild-type and mutant of candidate mutant genes.The yellow dotted line represents the hydrogen bond,the hydrogen bond receptors and donors on amino acid residues were colored as blue and red respectively;α-Helix,β-Sheet,and random coil were colored as green,purple,and pink respectively.Val:valine,Ile:isoleucine.

3 討論

近年來，許多基因位點(diǎn)的變異被證實(shí)與HL有關(guān)，截至2021年8月，已報道了約124個耳聾基因，存在約192個突變位點(diǎn)[6]，據(jù)報道，新生兒中HL的患病率約為1.8/1000，到5歲時，這一比率將達(dá)到約2.7/1000[7]，因此，HL的早期篩查和干預(yù)對于改善患兒語言、溝通和認(rèn)知發(fā)展至關(guān)重要。新生兒普遍聽力篩查在我國已經(jīng)實(shí)施了20多年，這將確診HL的平均年齡從24-30個月下降到2-3個月，然而，目前的新生兒普遍聽力篩查方案對巨細(xì)胞病毒誘導(dǎo)的HL、氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的HL和遲發(fā)性或進(jìn)行性HL的診斷等存在局限性，因此將耳聾基因的檢測介入新生兒普遍聽力篩查計劃能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)聽力篩查的局限性。

GJB2、SLC26A4和GJB3基因是我國最常見的熱點(diǎn)耳聾基因，占HHL的70%～80%，其中GJB2基因占55%[8]。本研究確定了356例新生兒耳聾易感基因突變情況，由于檢測方法和研究對象的差異，突變檢出率高于其他研究，其中GJB2基因（占63.19%）的突變攜帶率（1.75%）最高，c.109G＞A等位基因頻率（8.987%）最高，其結(jié)果病例組不符合H-W遺傳平衡是由于突變頻率在病例組中比較高，GJB3、SLC26A4基因突變攜帶率較低，但略高于本地其他研究[9-10]。與我國南方其他地區(qū)相比，本研究GJB2和SLC26A4的基因突變攜帶率均低于成都市（2.20%、1.27%）、東莞市（4.16%、5.22%）、深圳市（1.98%），GJB3基因突變攜帶率與這三個地區(qū)的差異不大[11-13]。值得注意的是，355例耳聾基因陽性新生兒中有40.28%（143/355）的壯族人，有研究報道廣西地區(qū)漢族GJB2、GJB3和SLC26A4的突變攜帶率均高于壯族[14]，這或許是本研究突變攜帶率較低的原因，另外，本研究有51例（65.38%，51/78）確診HL者攜帶c.109G＞A，其中32例為壯族新生兒，由于壯族樣本量少，尚不能確定壯族成分對研究結(jié)果的影響。

GJB2基因的變異會影響間隙連接蛋白-26的表達(dá)，目前推測縫隙連接蛋白-26的缺失可能損害K+離子的循環(huán)，高濃度K+抑制谷氨酸的攝取，最終導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡[15]。GJB2c.109G＞A是否致聾存在爭議，孫菲菲[16]在耳聾患者家系中明確c.109G＞A會引起輕度的聽力損傷，劉清明等[17]發(fā)現(xiàn)攜帶c.109G＞A伴c.235delC的復(fù)合雜合突變者在3年的聽力密切隨訪未通過，而c.109G＞A純合突變者均通過。針對蛋白預(yù)測結(jié)果與本研究統(tǒng)計結(jié)果不符的情況，我們認(rèn)為原因如下，在線服務(wù)器根據(jù)人工智能從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中尋找相似度最高的蛋白結(jié)構(gòu)為模板擬合出的三維模型，并不能完全反映出蛋白表達(dá)的實(shí)際情況，c.109G＞A和c.79G＞A突變的確診HL新生兒中有13.06%的新生兒為GJB2復(fù)合雜合突變，甚至有7.25%為多基因突變，可能由多基因、多位點(diǎn)的復(fù)雜突變導(dǎo)致的HL，僅用單個位點(diǎn)的突變預(yù)測出的蛋白模型難以驗(yàn)證與表型的關(guān)聯(lián)。

本研究的不足:1）作為針對新生兒的隨機(jī)篩查研究，我們的病例組樣本不夠大，還應(yīng)增加樣本量，另外，應(yīng)該對所有進(jìn)行聽力初篩的新生兒進(jìn)行耳聾基因測序。2）我們僅對3個耳聾相關(guān)基因進(jìn)行測序，這些基因的覆蓋范圍很小，故存在一定程度的漏診，突變陰性的患者是否攜帶其他致病突變?nèi)匀晃粗?，后續(xù)的研究需盡量采用全外顯子組測序以鑒定其他罕見的耳聾基因。3）我們無法收集到新生兒父母及其他親屬的樣本，故不能構(gòu)建核心家系，從遺傳的角度進(jìn)行研究分析。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GJB2c.109G＞A是廣西南寧市新生兒攜帶率最高的耳聾基因突變。獨(dú)立進(jìn)行聽力篩查和耳聾基因測序篩查存在一定的缺陷，結(jié)合兩種篩查方法是臨床早期干預(yù)NSHL的有效策略。目前的結(jié)果對廣西地區(qū)耳聾基因篩選方案的建立應(yīng)該是有價值的。