張尚鵬, 王百群, 王香香, 黃倩雪, 喻佳洛, 徐明哲

(1.中國科學院 水利部 水土保持研究所 黃土高原土壤侵蝕與旱地農業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌 712100; 2.中國科學院大學, 北京 100049; 3.西北農林科技大學 資源環(huán)境學院,陜西 楊凌 712100; 4.西北農林科技大學 林學院, 陜西 楊凌 712100)

在植被恢復的過程中，生物土壤結皮成為干旱和半干旱地區(qū)最具特色的微自然景觀[1-2]，也是干旱荒漠區(qū)、極地地區(qū)等生態(tài)脆弱區(qū)植被演替的重要基礎[3]。生物土壤結皮在調節(jié)土壤養(yǎng)分、穩(wěn)定表層土壤、為土壤生物提供棲息地等方面起著至關重要的作用[4-6]。生物土壤結皮按照藻結皮—地衣結皮—苔蘚結皮的順序演替[7-8]，在某些特定環(huán)境條件下，可以跳躍地衣階段，直接由藻結皮發(fā)育為苔蘚結皮[9]。隨著生物結皮的演替，生態(tài)系統(tǒng)中的群落組成也在發(fā)生變化，處在不同的發(fā)育演替階段時期具有不同的生態(tài)價值，在土壤性能、抗減壓力、水文過程以及固碳(C)、氮(N)效能等方面也有較大差別[10-11]。生物結皮的發(fā)育類型會影響到微生物的代謝，而微生物代謝的變化也被認為是影響土壤養(yǎng)分循環(huán)的最大不確定因素之一[12-13]。因此明確生物結皮發(fā)育過程中微生物的代謝至關重要。

碳、氮、磷(P)代謝是土壤微生物最重要的代謝過程，并且營養(yǎng)化學計量是控制微生物代謝的關鍵驅動力[14]。生物結皮在不同發(fā)育階段下養(yǎng)分狀況會存在差異[15]，當養(yǎng)分化學計量處于不平衡時，微生物代謝就會受到限制[16]。生物土壤結皮在不同發(fā)育階段下微生物受到何種養(yǎng)分限制以及限制如何變化尚不明確。而生態(tài)酶化學計量可用于估計微生物養(yǎng)分需求和土壤養(yǎng)分供應之間的平衡[17]，用于揭示以碳、氮或磷為代表的微生物代謝限制的特征[18]。另外，在黃土垂直節(jié)理發(fā)育的陡壁上所生長的生物結皮更為集中。因此，本研究選擇黃土丘陵區(qū)垂直斷面上所發(fā)育的不同類型生物結皮為研究對象，探究其發(fā)育過程中的養(yǎng)分與生態(tài)酶化學計量特征，進一步明確在生物結皮發(fā)育過程中微生物的限制性養(yǎng)分與影響因素，為科學認識生物結皮的生態(tài)功能以及微生物代謝狀況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于陜西省安塞縣的紙坊溝(109°15′E，36°44′N)、馬家溝(109°16′E，36°50′N)和腰鼓山(109°18′E，36°51′N)3個地區(qū)。該地區(qū)是典型的黃土丘陵溝壑區(qū)，平均海拔1 200 m左右。該區(qū)年均溫8.8℃，年均降水量300～650 mm，年日照時數(shù)約2 400 h，屬于暖溫帶半干旱季風氣候。土壤類型以黃綿土為主，分布的地帶性植被主要有沙棘(Hippophaerhamnoides)、長芒草(Stipabungeana)、茵陳蒿(Artemisiacapillaries)、胡枝子(Lespedezabicolor)等。

1.2 樣品采集

本研究于2020年8月對生物土壤結皮樣品進行采集。在紙坊溝、馬家溝和腰鼓山3個地區(qū)選擇海拔一致，生物結皮發(fā)育完整的垂直陡壁為采樣點并作為樣地重復，樣地的坡度均接近90°。在每個樣地中，按照蘚的蓋度[19]采集4種類型的生物結皮：淺色藻結皮(LA)、深色藻結皮(DA)、藻蘚混合結皮(AM)和蘚結皮(M)(蘚蓋度分別為0，0%～30%，30%～70%和70%～100%)。其平均厚度分別為2.76，4.03，5.70，7.58 mm。每個采樣斑塊中的生物結皮應均勻分布且每個斑塊間距離在2 m以上。在每個樣地中，按照隨機采樣和多點混合的原則采集每種類型的生物結皮層，每種類型的結皮分5～7點采樣，最終混合作為一個分析樣。另外，采集垂直面上沒有生物結皮發(fā)育的裸土作為對照處理(CK)。每個樣本分為兩個子樣本，一份樣本立即放在4℃冰箱中保存，兩周內用于分析酶活性和微生物量，其他樣本風干后用于理化性質分析。

1.3 樣品測定

用烘干法測定土壤含水量；pH用電位法(水土比為2.5∶1)測定；采用重鉻酸鉀—外加熱法測定土壤有機碳(SOC)的含量；凱氏定氮法測定土壤全氮(TN)含量(KjeltecTM2399，瑞典)；可溶性有機碳(DOC)和可溶性有機氮(DON)提取后由Multi C/N 3100測定。分別用濃硫酸—高氯酸和0.5 mol/L的碳酸氫鈉處理土壤，用鉬銻抗—紫外分光光度法測定全磷(TP)和速效磷(Olsen-P)含量(Hitachi UV2300)。采用氯仿熏蒸法測定微生物生物量[20](MBC，MBN，MBP)，將未熏蒸和熏蒸樣品間的差異作為微生物量，MBC，MBN和MBP的轉化系數(shù)分別為0.45，0.54，0.40。保存在4℃中的樣品用來測定參與碳氮磷循環(huán)的水解酶活性。包括：β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)，β-D-纖維二糖水解酶(CBH)，β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)，L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，堿性磷酸酶(AP)。5種酶活性均采用微孔板熒光法進行測定[21-22]，所有酶活性均以nmol/(g SOM h)來表示。

1.4 計算方法

胞外酶活性的計算公式為：

Ab=FV/(eV1tm)

F=(f-fb)/q-fs

e=fr/(csV2)

q=(fq-fb)/fr

式中:Ab為樣品酶活性[nmol/(g干土h)];F是校正后樣品熒光值;V是懸濁液的總體積;e為熒光釋放系數(shù);V1為微孔板每個孔中加入的樣品懸濁液體積;t為培養(yǎng)時間;m為干土樣的質量;f是酶標儀所讀取樣品的熒光值;fb為空白對照孔的熒光值;q為淬火系數(shù);fs為陰性對照微孔的熒光值;fr為參考標準孔的熒光值;cs是參考標準孔的濃度;V2為所加入?yún)⒖紭藴饰矬w積;fq為淬火標準孔的熒光值。

利用酶計量的矢量模型計算向量長度與角度來量化微生物的養(yǎng)分限制特征[23]，計算公式如下：

Length= SQRT(x2+y2)

Angle(°)=Degrees[Atan2(x,y)]

式中:Length表示向量長度,值越大表示微生物相對C限制越大;Angle表示向量角度,角度小于45°表示微生物受到土壤的N限制,反之受到土壤P限制,微生物N限制隨角度減小而增加,P限制隨角度增加而增大。x為(BG+CBH)/(BG+CBH+AP),y為(BG+CBH)/(BG+CBH+LAP+NAG)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey test多重比較檢驗各處理間的差異性。采用廣義線性模型來確定微生物相對C限制和相對P限制間的關系。利用R軟件的“Vegan”包進行冗余分析(RDA)，利用“plspm”包中的“innerplot”函數(shù)進行偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)分析結皮類型，土壤性質和微生物量對微生物養(yǎng)分限制的直接和間接效應。所有分析和繪圖分別在軟件R(v.3.6.3)和軟件Origin 2021中進行。

2 結果與分析

2.1 不同類型生物土壤結皮性質特征

不同結皮類型下的土壤理化性質存在顯著差異(表1)。4種結皮類型(LA，DA，AM和M)的土壤總有機碳、全氮、全磷、可溶性有機碳、可溶性有機氮和土壤含水量均顯著高于CK處理(p<0.05)，CK的速效磷含量(1.29 ± 0.08 mg/kg)在數(shù)值上也小于各個結皮類型。盡管pH在各處理間的差異不顯著，但在數(shù)值上CK的pH最高(8.13±0.10)。除了DOC和pH外，蘚結皮的SOC，TN，TP，DON，Olsen-P和含水量均為最高(p<0.05)，分別為(9.78 ± 0.41)g/kg，(0.87±0.02)g/kg，(0.51±0.01)g/kg，(118±6.09)mg/kg，(4.32±0.52)mg/kg，19.3%±0.75%，并且在大小順序上均表現(xiàn)為M>AM>DA>LA。DOC與其他不同，DA處理最高(p<0.05)，為(304±8.07)mg/kg。總的來說，生物土壤結皮的生長促進了土壤中養(yǎng)分含量以及含水量的增加，并且隨著裸土、淺色藻結皮、深色藻結皮、藻蘚混合結皮和蘚結皮的順序逐漸增加。

表1 不同類型生物土壤結皮理化性質特征

圖1為不同類型結皮的微生物量特征。CK的微生物量碳、氮、磷均為最低(p<0.05)，分別是(127±4.32)mg/kg，(6.84±1.21)mg/kg，(2.02±0.71)mg/kg。與理化性質的結果類似，蘚結皮的微生物量最高(p<0.05)，其微生物量碳、氮、磷分別是CK處理的18.3，27.6，14.1倍。各處理微生物量在數(shù)值上均表現(xiàn)為M>AM>DA>LA>CK?？梢?，生物結皮的發(fā)育促進了微生物量的逐漸增加。

注：CK表示裸土；LA表示淺色藻結皮；DA表示深色藻結皮；AM表示藻蘚混合結皮；M表示蘚結皮。不同小寫字母表示不同類型的生物結皮之間差異顯著(p<0.05)。下圖同。

2.2 不同類型生物土壤結皮胞外酶活性特征

生物結皮類型對土壤胞外酶活性具有顯著影響(表2)。結皮下土壤胞外酶活性均顯著高于裸土(p<0.05)。BG，CBH和NAG的酶活性均表現(xiàn)為隨著LA，DA，AM和M的順序逐漸增加，其中，M處理的CBH顯著高于AM，DA和LA處理，分別是其1.83，2.14，2.19倍。LAP的最大值出現(xiàn)在AM處理(p<0.05)，為(1 852±125)nmol/(g SOM h)。DA處理的AP酶活性最大，為(7 387±251)nmol/(g SOM·h)，但與其他結皮類型間沒有顯著差異。

表2 不同類型生物土壤結皮酶活性

2.3 矢量模型分析微生物代謝特征

利用酶計量的矢量模型計算不同類型結皮的向量長度和角度來量化微生物的相對C限制與相對P限制(圖2A和2B)。結果發(fā)現(xiàn)，CK處理表現(xiàn)為最低的相對C限制(0.72±0.03)與最高的相對P限制(61.0±1.19)，而M處理相反，表現(xiàn)為最高的相對C限制(0.89±0.03)與最低的相對P限制(55.1±1.29)。其他3種類型結皮的相對C和P限制處于二者之間且差異不顯著。通過線性回歸分析了向量長度與向量角度的關系發(fā)現(xiàn)，二者存在顯著的負相關關系(圖2C)，其回歸方程為y=-0.02x+1.98(R2=0.61，p<0.001)。

圖2 不同類型生物土壤結皮的向量長度與夾角特征及其二者關系

2.4 環(huán)境因子對生物土壤結皮酶活性及微生物養(yǎng)分限制的影響

利用RDA分析了生物土壤結皮下的土壤性質與土壤C，N，P獲取酶的關系(圖3)，土壤性質能夠解釋酶活性59.2%的變異，其中軸1與軸2的解釋率分別為56.1%和3.10%。微生物C獲取酶與土壤養(yǎng)分(SOC，TN，TP)和微生物量(MBC，MBN，MBP)存在正相關，P獲取酶相反，N獲取酶與pH間存在較強正相關。

注：C獲取酶包括β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)和β-D-纖維二糖水解酶(CBH)，N獲取酶包括β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和L-亮氨酸氨肽酶(LAP)，P獲取酶為堿性磷酸酶(AP)。

通過偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)確定各因素對微生物C，P限制的直接和間接效應(圖4A和4B)。生物結皮類型直接影響?zhàn)B分含量、微生物量和含水量，進而對微生物的相對C，P限制造成影響。結皮類型(+0.75)、養(yǎng)分含量(+0.43)和微生物量(+0.60)對微生物的相對C限制影響最大(圖4C)，對微生物相對P限制影響最大的是結皮類型(-0.71)和養(yǎng)分含量(-0.72)(圖4D)。

注：實線和虛線分別表示正向和負向影響(p<0.05)，箭頭上方的數(shù)字表示標準化路徑系數(shù)，R2表示每個變量解釋的方差。其中，養(yǎng)分含量包括：DOC，DON和Olsen-P；微生物量包括：MBC，MBN和MBP。

3 討 論

3.1 生物土壤結皮的性質

生物土壤結皮的發(fā)育改善了土壤的養(yǎng)分狀況。在本研究結果中，4種生物土壤結皮類型(LA，DA，AM和M)的總有機碳、全氮、全磷、可溶性有機碳、可溶性有機氮和土壤速效磷含量均高于裸土(表1)，與以往的研究結果類似。Elbert等[24]研究表明每年由生物結皮對C的吸收約為3.9 Pg，相當于陸地植被凈初級生產(chǎn)力的7%，同時生物結皮顯著增加了表層土壤有機碳的含量[25]。生物結皮對氮元素的固定起著重要作用，Russow等[26]通過研究生物結皮和大氣氮沉降的關系，發(fā)現(xiàn)大氣中84%以上的氮可以通過生物結皮進行固定；而生物結皮中的藍藻和藍藻共生地衣，能夠將大氣中的N2固定為可被植物利用的氮進入土壤，增加了表層土壤N的輸入[27]；此外，明姣等[28]研究發(fā)現(xiàn)生物結皮的形成顯著的提高了土壤全氮的含量，并且對土壤中氮素的貢獻主要集中在結皮層。生物結皮的發(fā)育也可以加速土壤有效磷的積累，一方面生物結皮分泌的有機酸能夠溶解磷酸鹽而釋放磷；另一方面，生物結皮通過提高結皮層土壤堿性磷酸酶的活性和有機質含量，降低土壤pH，進而提高了土壤磷素有效性[29-30]。盡管在本研究中各處理間的pH沒有顯著差異，但是各結皮處理的pH均小于裸土，這與上述結果是一致的。

與裸土相比，4種類型的生物結皮生長顯著增加了微生物生物量碳氮磷(p<0.05，圖1)。這與本研究中土壤養(yǎng)分和土壤含水量的變化是一致的，在適宜的養(yǎng)分與水分條件下，可以為微生物的生長提供有利的條件[14]，偏最小二乘路徑模型結果也展示出養(yǎng)分含量對微生物量的直接作用更為顯著(圖4)。當然，微生物的生長也可以促進養(yǎng)分的積累和水分的涵養(yǎng)[31]。生物結皮一般會按照藻結皮—地衣結皮—苔蘚結皮的順序演替[7-8]，在本研究中土壤養(yǎng)分、水分和微生物量均隨裸土、淺色藻結皮、深色藻結皮、藻蘚混合結皮和蘚結皮的順序逐漸增加，反映出在生物結皮發(fā)育過程中有助于土壤性質的改善。

3.2 生物土壤結皮的酶活性和微生物養(yǎng)分限制

參與C，N和P循環(huán)的相關酶活性均表現(xiàn)為結皮的酶活性顯著大于裸土(p<0.05，表2)，這表示微生物在生物結皮中的C，N，P代謝速率更快，與微生物量的結果相對應。此外，以往的研究表明，土壤酶活性受到土壤養(yǎng)分狀況影響較大[32]，并且在養(yǎng)分匱乏時微生物可以分泌酶到環(huán)境中來獲取所需的養(yǎng)分[33]。本研究中，RDA結果表明土壤的養(yǎng)分狀況(SOC，TN和TP)與酶活性存在較強的相關性，并且能夠解釋酶活性大部分的變異(圖3)。因此不同結皮類型間的養(yǎng)分差異會影響到土壤酶的活性。

酶計量的矢量模型結果表示在各個類型下微生物均受到相對C限制和相對P限制，并且微生物相對C，P限制間存在顯著負相關關系(圖2)。其中裸土的相對C限制低于各結皮處理，而相對P限制高于各結皮處理(圖2A和2B)。這可能是由于土壤本身的P元素較為匱乏，不能滿足微生物生長需求，并且從裸土發(fā)育到淺色藻結皮、深色藻結皮和藻蘚混合結皮的過程中，土壤速效磷含量并沒有顯著變化(p>0.05)。P元素的限制也會影響到微生物對其他養(yǎng)分的吸收和微生物代謝[34]。為了緩解P限制，微生物群落在分泌與P代謝相關的酶時會消耗掉一定的C[35]；有機質分解也會釋放P供微生物利用[36]，微生物需要分泌更多的C獲取酶水解有機質來緩解自身P的限制，這些過程都會導致微生物相對C限制的增加。此外，從裸土發(fā)育到結皮的過程中，微生物量顯著增加，微生物間對資源的競爭也會造成相對C限制的加劇。

在淺色藻結皮發(fā)育到蘚結皮的過程中，盡管相對C限制在各類型間差異不顯著，但是數(shù)值上表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢。DA處理的相對C限制最低，其可溶性有機碳含量在此時是最高的(表1)。Sinsabaugh等[33]指出速效養(yǎng)分對微生物生長影響更大，高的養(yǎng)分可利用性一定程度上能夠緩解微生物的養(yǎng)分限制[18]。同理，蘚結皮的速效磷含量最高而P限制最低，與此觀點是一致的。并且偏最小二乘路徑模型結果也展示出速效養(yǎng)分含量對相對C，P限制均有較大影響。另外，土壤水分在低水平時的微生物代謝活性會受到抑制[37]，在裸土和結皮發(fā)育初期的水分含量很低，微生物對有機物質的分解較慢也會造成較高的磷限制。結合偏最小二乘路徑模型的結果來看，生物結皮的類型會直接影響到土壤中的養(yǎng)分狀況、水分和微生物量進而間接影響微生物的代謝限制。本文主要基于酶活性及其計量模型對于微生物代謝情況進行判斷和分析，在后續(xù)工作中需要結合微生物的群落特征以及參與碳氮磷循環(huán)的功能基因特征進行更全面以及深入的探討。

4 結 論

(1)從裸土到生物土壤結皮各發(fā)育階段，結皮養(yǎng)分、水分和微生物量均逐漸增加，表明生物結皮發(fā)育過程對土壤性質的改善起到積極作用。

(2)參與C，N和P循環(huán)的相關酶活性增加，反映出微生物在生物土壤結皮中的C，N，P代謝速率加快，并且受到不同結皮類型間養(yǎng)分差異的影響。

(3)生物土壤結皮的發(fā)育造成微生物相對碳限制的增大與相對磷限制的減小，受到養(yǎng)分可利用性的影響。另外，生物土壤結皮的類型會直接影響到其中的養(yǎng)分狀況、水分和微生物量進而間接影響微生物的代謝限制。