萬 辰 陳思瑋 馬瑛駿 張克強(qiáng) 王 風(fēng) 沈仕洲#

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.大理農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外觀測研究站，云南 大理 671004；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

氮素是滿足作物生長和提高作物產(chǎn)量所必須的營養(yǎng)元素[1]。農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素有多種輸入途徑，但作物獲取的氮素主要來源于土壤和肥料[2]，土壤中90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上氮素以有機(jī)態(tài)氮的形式存在[3]，僅有部分小分子有機(jī)態(tài)氮能被作物吸收利用，大部分需經(jīng)過礦化作用轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮和硝態(tài)氮才能被作物吸收利用[4]。土壤氮素礦化釋放是微生物主導(dǎo)的生物化學(xué)過程，受土壤質(zhì)地、溫度、含水率、有機(jī)質(zhì)含量等因素影響[5-6]，土壤中污染物也會通過抑殺土壤微生物來抑制土壤氮素礦化作用。

抗生素是一類具有干擾、殺死微生物或生物細(xì)胞的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)[7]，在畜禽養(yǎng)殖等方面被廣泛應(yīng)用。有研究表明，只有部分抗生素參與動物的新陳代謝并被有效使用，大部分抗生素直接隨動物尿液和糞便排出體外[8]，并以原藥形式輸入環(huán)境系統(tǒng)[9]。中國畜禽糞便產(chǎn)量較大，2015年畜禽糞便總產(chǎn)量可達(dá)10.19億t[10]，其中80%未經(jīng)無害化處理直接用作農(nóng)作物肥料[11]。這些未經(jīng)處理并且殘留抗生素的糞便作為有機(jī)肥施用于農(nóng)田，不僅會造成土壤、水體污染[12]，還會選擇性抑殺某些土壤微生物，破壞土壤環(huán)境中微生物群落組成和結(jié)構(gòu)[13]。土壤氮素礦化作用依賴于微生物調(diào)控[14]，土壤或肥料中殘留的抗生素會干擾相關(guān)微生物活動，勢必會對土壤氮素礦化造成影響。不同抗生素的藥效不同，對氮素礦化的影響存在差異。YU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度紅霉素對氨氧化菌有明顯抑制作用，而中濃度和高濃度紅霉素對氨氧化菌具有明顯增益作用。HAMMESFAHR等[16]利用磺胺嘧啶污染新鮮和腐熟的豬糞，結(jié)果顯示磺胺嘧啶明顯抑制氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌生長，降低氨氧化微生物的豐富度和多樣性，進(jìn)而抑制氨氧化過程。

畜禽糞便中檢出率較高的抗生素類型有磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類[17]，雖然抗生素在堆肥過程中可由于生物降解等作用有所降低，但難以全部去除，最終通過施肥進(jìn)入土壤。本研究以水稻土作為研究對象，在施加傳統(tǒng)有機(jī)肥條件下，通過室內(nèi)好氧培養(yǎng)試驗探究不同抗生素處理下的土壤氮素礦化特征，及對氮素礦化功能基因的影響，對指導(dǎo)畜禽糞便等有機(jī)物料合理利用具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自云南大理農(nóng)田耕層土壤(0～20 cm)，樣品經(jīng)過風(fēng)干后過1 mm篩備用。供試牛糞采自某奶牛養(yǎng)殖場，經(jīng)測定無抗生素檢出，樣品經(jīng)堆肥腐熟和風(fēng)干后過1 mm篩備用，供試土壤及牛糞基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗設(shè)計

參考有機(jī)肥常規(guī)施加量進(jìn)行試驗設(shè)計，取104 g風(fēng)干土樣于塑料瓶中，加入3.07 g風(fēng)干牛糞，分別加入恩諾沙星(ENR)、四環(huán)素(TCY)和金霉素(CTC)3種畜禽養(yǎng)殖常用抗生素，調(diào)節(jié)混合土樣中抗生素質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100 mg/kg。向混合土樣中加入20 mL蒸餾水，使其含水量與田間持水量基本持平。塑料瓶用蓋封口并扎孔保持通氣，于恒溫避光處培養(yǎng)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，以不加抗生素作為對照(CK)組。試驗期間，每隔2～3天稱量一次補(bǔ)充蒸餾水保持混合土樣含水量。為防止抗生素降解吸附以及微生物適應(yīng)性增強(qiáng)等因素對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響[18]，試驗培養(yǎng)周期設(shè)置為25 d，分別于第3、6、9、16、25 天時采樣。土壤礦質(zhì)氮包括銨態(tài)氮與硝態(tài)氮，因此稱取20 g土樣加入浸提瓶中并加入100 mL質(zhì)量濃度為2 mol/L的氯化鉀浸提液，在恒溫振蕩器中振蕩1 h，過濾收集浸提瓶中的水樣并測定氨氮及硝態(tài)氮含量，折算土樣中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮質(zhì)量濃度[19]，試驗過程中土壤礦質(zhì)氮的增量即為氮素累積礦化量，礦質(zhì)氮的增速即為凈氮礦化速率。

1.3 土壤功能基因提取與分析

試驗結(jié)束后，準(zhǔn)確稱取0.5 g土樣采用FastDNA?SPIN試劑盒(美國MP Biomedicals)進(jìn)行脫氧核糖核酸(DNA)提取，每個土樣做3個重復(fù)，提取DNA后的樣品置于冰箱中-20 ℃下保存，用于后續(xù)分析檢測。

采用ABI7300型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)儀(美國Applied Biosystems)對amoA、nxrA基因進(jìn)行qPCR分析。qPCR擴(kuò)增過程如下：預(yù)變性95 ℃持續(xù)3 min；95 ℃變性5 s，58 ℃退火/延伸持續(xù)30 s，進(jìn)行40個循環(huán)；熔點曲線分析在72 ℃進(jìn)行。各DNA模板設(shè)置3組平行，以無菌雙蒸水為陰性對照[20]。

表1 供試土壤及牛糞的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic chemical and physical characteristics of cow manure and soil

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素對土樣銨態(tài)氮的影響

施加不同水平的ENR、TCY、CTC后，土樣銨態(tài)氮的變化見圖1。由圖1(a)可見，在不同水平的ENR處理下，土樣銨態(tài)氮總體呈先上升后下降的變化趨勢。其中，ENR為10、25 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮在第3天達(dá)到最大值后開始下降，而ENR為50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮在第6天達(dá)到最大值，分別為16.01、15.92 mg/kg，明顯高于其他處理組。CK處理組的土樣銨態(tài)氮在試驗前9天變化不大，基本維持在12 mg/kg左右，第9天后土樣銨態(tài)氮開始迅速下降；試驗進(jìn)行到第16天后，各處理組土樣銨態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定，試驗結(jié)束時，CK處理組土樣銨態(tài)氮為5.71 mg/kg，ENR為10、25、50、100 mg/kg的處理組土樣銨態(tài)氮分別為3.99、3.79、4.84、3.96 mg/kg，明顯低于CK處理組。由圖1(b)可見，試驗第3天時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為12.68、14.23、14.52、14.91 mg/kg；第3天后，除100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮繼續(xù)升高，其他各處理組土樣銨態(tài)氮均有下降，其中TCY為10、25 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮含量與CK處理組差異不明顯；第6天后，TCY為100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮含量也迅速下降，不同處理間差異逐漸縮??；各處理組土樣銨態(tài)氮含量均在第16天時達(dá)到最小值，然后稍有上升。試驗結(jié)束時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為5.68、4.90、4.91、4.59 mg/kg。由圖1(c)可見，不同CTC處理組土樣銨態(tài)氮在試驗前3天無明顯變化；試驗第6天時，除CTC為10 mg/kg處理組及CK處理組土樣銨態(tài)氮有所下降外，CTC為25、50、100 mg/kg處理組土樣銨態(tài)氮均明顯上升，分別達(dá)到22.27、26.37、25.06 mg/kg，在第6天后，3個CTC處理組土樣銨態(tài)氮均迅速下降，各處理組之間差異逐漸減小。試驗結(jié)束時，CTC為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣銨態(tài)氮分別為5.62、5.58、5.53、5.64 mg/kg，與CK處理組無明顯差異。

圖1 不同抗生素對土樣銨態(tài)氮的影響Fig.1 Effect of different antibiotics on ammonium nitrogen in soil samples

2.2 不同抗生素對土樣硝態(tài)氮的影響

施加不同水平的ENR、TCY、CTC后，土樣硝態(tài)氮的變化見圖2。由圖2(a)可見，在不同水平的ENR處理下，土樣硝態(tài)氮含量總體均呈上升趨勢。試驗前6天，僅CK處理組土樣硝態(tài)氮逐漸上升，其余4個ENR處理組土樣硝態(tài)氮總體無明顯變化。第6天后，ENR處理組土樣硝態(tài)氮開始迅速上升，但與CK處理組間的差距持續(xù)增大。第9天后，各處理組土樣硝態(tài)氮上升趨勢放緩，試驗結(jié)束時，ENR為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為52.95、50.37、48.93、45.25 mg/kg，CK處理組土樣硝態(tài)氮則達(dá)到75.87 mg/kg，明顯高于4個ENR處理組。由圖2(b)可見，TCY處理下土樣硝態(tài)氮變化趨勢與ENR處理基本相似，但與CK處理組土樣硝態(tài)氮的差異有所減小，試驗結(jié)束時，TCY為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為65.33、65.07、65.29、52.80 mg/kg。由圖2(c)可見，試驗期間CTC為10 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮變化與CK處理組十分接近，除試驗第6天時，CTC為25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮出現(xiàn)下降，明顯低于CK處理組，此后各處理組土樣硝態(tài)氮均迅速上升，處理組間差異逐漸減小。試驗結(jié)束時，CTC為10、25、50、100 mg/kg處理組的土樣硝態(tài)氮分別為75.95、73.54、72.80、73.49 mg/kg，與CK處理組差異不大。

圖2 不同抗生素對土樣硝態(tài)氮的影響Fig.2 Effect of different antibiotics on nitrate nitrogen in soil samples

2.3 不同抗生素對土樣凈氮礦化速率的影響

試驗期間，不同抗生素處理下土樣的凈氮礦化速率計算結(jié)果見表2。在0～3 d，3種抗生素處理組的凈氮礦化速率均低于CK處理組，其中ENR處理組及TCY為10、25、50 mg/kg處理組顯著低于CK處理組，CTC處理組略低于CK處理組。在3～6 d，CK處理組土樣的凈氮礦化速率達(dá)到2.47 mg/(kg·d)，ENR處理組及TCY處理組較CK處理組最高分別下降了1.96、2.30 mg/(kg·d)，CTC處理組與CK處理組差異不顯著。在6～9 d，ENR處理組及TCY處理組的凈氮礦化速率與CK處理組的差異達(dá)到最大，其中ENR為100 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率較CK處理組差距最大，相差8.17 mg/(kg·d)；CTC為10 mg/kg處理組的土樣凈氮礦化速率高于CK處理組，其余CTC處理組均低于CK處理組。在9～16 d，各ENR處理組間土樣凈氮礦化速率無顯著差異，且與CK處理組的差異減小，最大凈氮礦化速率差僅為0.36 mg/(kg·d)；TCY為10 mg/kg處理組及CTC為50、100 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率高于CK處理組，其余處理組均低于CK處理組。在16～25 d，除CTC為25 mg/kg處理組土樣凈氮礦化速率顯著高于CK處理組，其余處理組與CK處理組間均無顯著差異。

表2 不同抗生素處理下土樣凈氮礦化速率變化1)Table 2 Changes of net nitrogen mineralization rate in soil after treated by different antibiotics

2.4 不同抗生素對amoA、nxrA基因的影響

經(jīng)計算，培養(yǎng)結(jié)束時CK處理組氮素累積礦化量為62.89 mg/kg，ENR為25、50、100 mg/kg處理組的氮素累積礦化量分別為35.27、35.08、30.79 mg/kg，TCY為25、100 mg/kg處理組的氮素累積礦化量分別為51.27、38.70 mg/kg，顯著低于CK處理組(P<0.05)，各濃度CTC處理組的氮素累積礦化量均與CK處理組無顯著差異(P>0.05)，說明土壤中的CTC殘留不會降低有機(jī)肥氮素礦化量。為探究土壤中抗生素對有機(jī)肥氮素礦化機(jī)制的影響，選取與CK處理組氮素累積礦化量存在顯著差異的處理組土樣進(jìn)行氮素礦化功能基因檢測，其中包括amoA和nxrA基因，結(jié)果見圖3。

圖3 抗生素處理對amoA、nxrA基因的影響Fig.3 Effect of antibiotics on amoA gene and nxrA gene

與CK處理組相比，TCY為25 mg/kg處理組amoA基因豐度無顯著差異，nxrA基因豐度提高0.84%，當(dāng)TCY上升到100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度分別下降了35.35%、52.38%，且為各處理組中的最低水平。ENR為25 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度分別比CK處理組下降了28.17%、31.38%，ENR上升到50、100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度有所上升，且兩處理組間無顯著差異。

3 討 論

抗生素進(jìn)入土壤后將對土壤微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量造成影響，進(jìn)而影響土壤中的氮素礦化。本研究中，ENR在培養(yǎng)開始后便對氮素礦化產(chǎn)生抑制作用，試驗6～9 d抑制作用最明顯，該階段10、25、50、100 mg/kg的ENR對土樣凈氮礦化速率的抑制率分別為43.67%、48.95%、55.71%、71.79%；第16天后，ENR對氮素礦化抑制強(qiáng)度減弱，試驗后期不同ENR處理組土樣的凈氮礦化速率與CK處理組無顯著差異。分析原因，主要是由于ENR對硝化作用產(chǎn)生抑制導(dǎo)致，培養(yǎng)結(jié)束時，各ENR處理組的硝態(tài)氮含量明顯低于CK處理組。閆賽紅[21]研究指出，ENR限制了土壤細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量增長，高濃度下對氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌基因豐度表達(dá)和脲酶活性存在顯著抑制。本研究發(fā)現(xiàn)隨著ENR處理濃度梯度上升，培養(yǎng)結(jié)束后氮素累積礦化量呈遞減趨勢，而amoA、nxrA基因豐度卻呈上升趨勢，原因可能是高濃度ENR雖然不會對微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響，但會通過降低主導(dǎo)氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化。

試驗前3天，僅TCY為100 mg/kg處理組未對氮素礦化產(chǎn)生顯著影響，其余各TCY處理組土樣凈氮礦化速率顯著低于CK處理組。隨著試驗的進(jìn)行，各TCY處理組對氮素礦化抑制作用均有所增強(qiáng)，其中TCY為100 mg/kg處理組在6～9 d的凈氮礦化速率抑制作用最明顯，抑制率達(dá)到45.61%。試驗第9天后，TCY對氮素礦化抑制作用逐漸減弱，各TCY處理組凈氮礦化速率與CK處理組均無顯著差異。TCY對氮素礦化作用的抑制主要體現(xiàn)在對硝化作用的影響上，各TCY處理組土樣硝態(tài)氮含量明顯低于CK處理組。有研究指出TCY對土壤細(xì)菌和真菌生長有顯著抑制作用，高濃度TCY可顯著抑制土壤酶活性[22]；張繼旭等[23]研究表明，低濃度TCY對土壤氮素礦化及硝化過程均產(chǎn)生促進(jìn)；吳穎等[24]研究表明，高濃度TCY可顯著抑制amoA、nxrA基因豐度。本研究也發(fā)現(xiàn)，TCY為100 mg/kg處理組土樣amoA、nxrA基因豐度分別比CK處理組下降了35.35%、52.38%。本研究發(fā)現(xiàn)TCY由25 mg/kg上升至100 mg/kg時，amoA、nxrA基因豐度均顯著降低，說明TCY會對土壤氮素礦化相關(guān)的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。

試驗3～6 d，CTC為25、50、100 mg/kg處理組土樣硝態(tài)氮含量明顯下降，該階段CTC抑制了硝化作用，隨著試驗時間延長，CTC對硝化的抑制作用立即減弱。試驗結(jié)束時，不同濃度CTC處理對土樣氮素累積礦化量均無顯著影響，這與其他研究結(jié)果不同。易良銀[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤培養(yǎng)時間延長，CTC會顯著抑制土壤礦化過程，不同濃度處理間無顯著差異；袁德梽[26]的研究也表明CTC對土壤礦化存在抑制作用。本研究中外源添加CTC未對土樣累積氮素礦化量產(chǎn)生影響，分析原因可能是本研究使用土樣為施肥土壤，使CTC在土壤中快速降解或被土壤強(qiáng)烈吸附[27]，降低了其對氮素礦化和硝化相關(guān)微生物的毒害作用，施肥后土樣中微生物活性較高，對CTC脅迫適應(yīng)性強(qiáng)，而CTC對氮素礦化影響時間較短暫，導(dǎo)致試驗過程中未能表現(xiàn)出對氮素礦化的影響。

總體看來，不同抗生素對土壤氮素礦化的影響并不相同，ENR、TCY對氮素礦化具有抑制作用，CTC對土壤氮素礦化影響不明顯。ENR、TCY對氮素礦化的抑制強(qiáng)度隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且均體現(xiàn)在對硝化作用的影響上，但對氮素礦化及硝化的影響不會持續(xù)存在。從功能基因豐度上看，ENR、TCY對氮素礦化的抑制存在差異，ENR主要通過降低主導(dǎo)氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化，而TCY對相關(guān)的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。若土壤中有ENR或TCY殘留時，會抑制有機(jī)物料的礦質(zhì)氮釋放，可能造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降。

4 結(jié) 論

(1) 不同抗生素對土壤氮素礦化的影響并不相同。培養(yǎng)試驗結(jié)束時，各ENR處理組及TCY為25～100 mg/kg處理組土樣銨態(tài)氮均明顯低于CK處理組，各ENR處理組及各TCY處理組土樣硝態(tài)氮均明顯低于CK處理組，而各TCT處理組土樣銨態(tài)氮與硝態(tài)氮與CK處理組相差均不明顯。

(2) ENR、TCY對氮素礦化的抑制強(qiáng)度隨培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，試驗6～9 d的抑制作用最明顯，第16天后抑制強(qiáng)度減弱，各處理組間無顯著差異，說明抗生素對氮素礦化及硝化的影響不會持續(xù)存在。ENR、TCY對氮素礦化的抑制作用均體現(xiàn)在對硝化作用的影響上。

(3) ENR、TCY對氮素礦化的抑制存在差異，ENR可能主要通過降低主導(dǎo)氮素礦化的微生物酶活性來抑制氮素礦化，而TCY可能主要對相關(guān)的功能微生物菌群數(shù)量產(chǎn)生影響。