周海佳，劉鵬云，秦超師，王芳芳，白寶寶，紀(jì)兆樂

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710038

多柔比星（DOX）在治療癌癥方面效果顯著，但可導(dǎo)致危及生命的心臟毒性，因此在化療中的應(yīng)用受到很大限制［1］。DOX可導(dǎo)致左心室功能不全，甚至心力衰竭［2］。研究顯示，活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生和心肌細(xì)胞凋亡在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷中具有重要作用。DOX誘發(fā)的氧化應(yīng)激可通過外源性和內(nèi)源性凋亡途徑直接誘導(dǎo)大量心肌細(xì)胞凋亡，引起嚴(yán)重的心功能障礙，但是目前其相關(guān)機(jī)制并不明了［3］。微小RNA（miRNA）屬于非編碼小RNA家族，具有18～25個(gè)核苷酸，可通過阻斷靶信使RNA（mRNA）的翻譯或降解靶基因來調(diào)控多種靶基因的轉(zhuǎn)錄后效應(yīng)。研究顯示，miR-145-5p在心血管疾病的發(fā)生和氧化應(yīng)激過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用［4-5］。沉默調(diào)節(jié)蛋白5（sirt5）是位于線粒體的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙酰酶的家族成員之一，其作為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)器，參與心肌能量代謝多個(gè)方面的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞解毒、氧化應(yīng)激和凋亡中具有重要作用［6］。已有研究發(fā)現(xiàn)，sirt5是miR-299-3p和miR-19b的靶基因［7-8］，但miR-145-5p與sirt5之間是否有關(guān)尚未報(bào)道。2022年2月—7月，本研究觀察了miR-145-5p和sirt5對(duì)DOX誘導(dǎo)小鼠心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，并探討miR-145-5p能否靶向sirt5，為DOX所致心臟毒性的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠90只，8周齡，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2007-007號(hào)。主要藥物：DOX購自美國Sigma公司。主要試劑：乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，超氧化物陰離子熒光探針（DHE）購自美國Invitrogen公司，TUNEL檢測試劑盒購自美國Roche Biochemicals公司，sirt5、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、Kelch樣ECH關(guān) 聯(lián) 蛋 白1（keap1）、超 氧 化 物 歧 化 酶1（SOD1）、血紅素加氧酶1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO-1）及裂解半胱天冬酶3（cleaved Caspase-3）抗體均購自美國Abcam公司；sirt5-MUT和sirt5-WT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由廣州力博生物科技有限公司構(gòu)建，miRNA NC、miR-145-5p mimic和miR-145-5p in?hibitor載體均購自廣州Ribo-Bio公司，miR-145-5p、sirt5、U6和GAPDH的引物均由上海生工生物工程科技有限公司構(gòu)建，sirt5慢病毒載體購自上海和元生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 miR-145-5p對(duì)DOX所致小鼠心肌損傷作用的觀察

1.2.1 動(dòng)物分組及miR-145-5p處理將50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為Control組、DOX組、DOX+NC組、DOX+inhibitor組和DOX+mimic組，每組10只。除對(duì)照組外均腹腔注射DOX 15 mg/kg，Control組注射等體積生理鹽水，DOX+NC組、DOX+inhibitor組和DOX+mimic組在注射DOX前3 d分別經(jīng)尾靜脈注射10 nmol/L的miRNA NC、miR-145-5p inhibitor和miR-145-5p mimic載體。miRNANC序列：5′-CAGUA?CUUUUGUGUAGUACAA-3′，miR-145-5p inhibitor序列：5′-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3′，miR-145-5p mimic序列：5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCC?CU-3′。

1.2.2 心功能采用M型標(biāo)準(zhǔn)二維超聲心動(dòng)圖檢查。各組注射DOX后14 d，異氟醚麻醉后置于操作平臺(tái)上，經(jīng)胸骨旁長軸位M型圖像測量參數(shù)，并計(jì)算出左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS），以此評(píng)價(jià)左心室收縮功能。

1.2.3 心肌組織病理改變采用HE染色。各組心功能檢查結(jié)束后處死，取出心臟，將部分心臟標(biāo)本制備5 μm厚的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水合操作后用生理鹽水洗凈。蘇木素染色30 min，加入0.02%伊紅，光鏡下觀察心肌組織病理變化。

1.2.4 血清心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH、CK-MB采用酶學(xué)速率法。各組小鼠處死后留取靜脈血，靜置后取上清，檢測血清LDH、CK-MB水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 心肌組織細(xì)胞凋亡采用TUNEL法。將各組心臟組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水合后，用蛋白酶K打孔30 min。按照TUNEL試劑盒說明書避光滴加TUNEL反應(yīng)混合物，于水浴箱中孵育1 h。PBS溶液洗片后加入DAPI染液，復(fù)染細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核顯示為綠色，所有細(xì)胞核顯示為藍(lán)色，以發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)的百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 心肌組織凋亡蛋白cleaved Caspase-3采用Westen blotting法。取各組小鼠心臟組織，提取蛋白質(zhì)樣本，樣品檢測濃度后，采用SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，加入cleaved Caspase-3一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h。以β-actin作為內(nèi)參，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法和生物特征凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白水平，計(jì)算cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 miR-145-5p與sirt5的靶向關(guān)系采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。使用miRanda（http：//www.microrna.org）和TargetScan（http：//www.targetscan.org）篩選miR-145-5p的靶基因，結(jié)果顯示sirt5 3'UTR包含一個(gè)miR-145-5p的結(jié)合位點(diǎn)，提示sirt5是miR-145-5p的潛在靶基因（圖1）。將H9c2細(xì)胞分為四部分，分別共轉(zhuǎn)染sirt5-WT、sirt5-MUT和miR-145-5p mimic、陰性對(duì)照NC質(zhì)粒，采用LB960光度計(jì)測定熒光素酶活性。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染sirt5-WT和miR-145-5p mimic質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于其他細(xì)胞（P均<0.05，圖2），提示sirt5是miR-145-5p的靶基因。

圖1 sirt5 3'UTR與miR-145-5p的結(jié)合位點(diǎn)

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

1.2.8 心肌組織miR-145-5p和sirt5 mRNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組小鼠心臟組織，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)過程：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計(jì)算心肌組織miR-145-5p和sirt5 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-145-5p、sirt5在DOX誘導(dǎo)小鼠心肌損傷中的調(diào)控作用及機(jī)制觀察

1.3.1 sirt5慢病毒質(zhì)粒的制備將sirt5插入pLVX-Puro慢病毒載體。將HEK293T細(xì)胞通過Li?pofactamine 2000轉(zhuǎn)染pLVX-Puro DUSP6（1 000 ng）、psPAX2（100 ng）和pMD2G（900 ng），以制備慢病毒。轉(zhuǎn)染后4～6 h，將細(xì)胞培養(yǎng)基改為生長培養(yǎng)基，48 h后收集病毒質(zhì)粒。

1.3.2 動(dòng)物分組及miR-145-5p、sirt5處理將40只C57BL/6小鼠 隨機(jī) 分為Control1組、DOX1組、DOX+sirt5組及DOX+共處理組，每組10只。除Con?trol1組外均腹腔注射DOX 15 mg/kg，Control1組注射等體積生理鹽水。DOX+sirt5組及DOX+共處理組在注射DOX前3 d經(jīng)尾靜脈注射sirt5慢病毒質(zhì)粒100 μL，DOX+共處理組同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射miR-145-5p mimic 10 nmol/L。各組分組處理后14 d進(jìn)行處死，取出心臟組織。

1.3.3 心肌組織MDA、SOD、GSH和DHE熒光強(qiáng)度將各組小鼠左心室新鮮心臟標(biāo)本置于冷鹽水中，勻漿機(jī)勻漿，離心取上清。采用酶學(xué)速率法檢測MDA、SOD、GSH表達(dá)。將心肌標(biāo)本經(jīng)液氮速凍后制成冰凍切片，按照DHE試劑盒說明書避光滴加DHE反應(yīng)液，于水浴箱中孵育30 min，PBS溶液洗片后用激光共聚焦顯微鏡觀察；采用Image J軟件分析DHE熒光強(qiáng)度，以此表示ROS生成情況。

1.3.4 心肌組織sirt5通路相關(guān)Nrf2、keap1、SOD1、HO-1及NQO-1蛋白參照“1.2.6”，以β-actin為內(nèi)參，采用Westen blotting法檢測心肌組織sirt5通路相關(guān)Nrf2、keap1、SOD1、HO-1及NQO-1蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組小鼠LVEF、LVFS比較DOX+inhibitor組、Control組>DOX組、DOX+NC組>DOX+mimic組（P均<0.05）。見表1。

表1 五組小鼠LVEF、LVFS比較（±s）

表1 五組小鼠LVEF、LVFS比較（±s）

注：與DOX+mimic組比較，*P<0.05；與DOX組和DOX+NC組比較，#P<0.05。

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2.2 五組小鼠心肌組織病理學(xué)改變比較與Con?trol組相比較，DOX組和DOX+NC組小鼠心肌組織空泡化變性顯著，且出現(xiàn)不同程度的肌纖維紊亂和斷裂；與DOX組比較，DOX+inhibitor組小鼠心肌組織空泡化變性及肌纖維紊亂、斷裂情況均減輕，而DOX+mimic組則均加劇。見OSID碼圖1。

2.3 五組小鼠血清LDH及CK-MB水平比較DOX+inhibitor組、Control組

表2 五組小鼠血清LDH、CK-MB水平比較（±s）

表2 五組小鼠血清LDH、CK-MB水平比較（±s）

注：與DOX+mimic組比較，*P<0.05；與DOX組和DOX+NC組比較，#P<0.05。

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2.4 五組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較DOX+inhibitor組、Control組

表3 五組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 五組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

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2.5 五組小鼠心肌組織miR-145-5p、sirt5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較miR-145-5p：DOX+inhibitor組、Con?trol組DOX組、DOX+NC組>DOX+mimic組（P均<0.05）。見表4。

表4 五組小鼠心肌組織miR-145-5p、sirt5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 五組小鼠心肌組織miR-145-5p、sirt5 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與DOX+mimic組比較，*P<0.05；與DOX組和DOX+NC組比較，#P<0.05。

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2.6 四組小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH表達(dá)和DHE熒光強(qiáng)度比較MDA、DHE熒光強(qiáng)度：DOX+共處理組、DOX1組>DOX+sirt5組、Control組，SOD、GSH：DOX+共處理組、DOX1組

表5 四組小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH表達(dá)和DHE熒光強(qiáng)度比較（±s）

表5 四組小鼠心肌組織MDA、SOD、GSH表達(dá)和DHE熒光強(qiáng)度比較（±s）

注：與DOX+共處理組比較，*P<0.05；與DOX+sirt5組比較，#P<0.05；與DOX1組比較，△P<0.05。

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2.7 四組小鼠心肌組織Nrf2、keap1、SOD1、HO-1及NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Nrf2、SOD1、HO-1及NQO-1：DOX+共處理組、DOX1組DOX+sirt5組、Control1組（P均<0.05）。見表6、OSID碼圖5。

表6 四組小鼠心肌組織Nrf2、keap1、SOD1、HO-1及NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表6 四組小鼠心肌組織Nrf2、keap1、SOD1、HO-1及NQO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與DOX+共處理組比較，*P<0.05；與DOX+sirt5組比較，#P<0.05；與DOX1組比較，△P<0.05。

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3 討論

DOX是一種從鏈霉菌中提取的蒽環(huán)類藥物，其廣譜的抗腫瘤作用以及長期使用后嚴(yán)重的不良反應(yīng)均引起了人們的廣泛關(guān)注［9］。DOX對(duì)各種器官特別是心臟有損傷作用，當(dāng)DOX達(dá)到一定累積劑量時(shí)，可誘發(fā)充血性心力衰竭，并且DOX誘導(dǎo)的心肌損傷可出現(xiàn)在任何治療階段［3］。因此，有必要尋找有效的治療措施，以對(duì)抗DOX誘導(dǎo)的心肌損傷。miR-145-5p在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用。HUANGFU等［4］研 究 表 明，miR-145-5p通 過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡。WU等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p通過靶向調(diào)控DUSP6分子誘導(dǎo)缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡。HE等［11］研究發(fā)現(xiàn)，西地那非通過抑制miR-145-5p表達(dá)，可減輕豬心臟驟停復(fù)蘇后的心肌功能障礙。本研究結(jié)果顯示，與Control組比較，DOX組小鼠心肌組織miR-145-5p表達(dá)升高，LVEF、LVFS均降低，血清LDH及CK-MB水平升高，心肌組織病理損傷及細(xì)胞凋亡增加；與DOX組比較，DOX+mimic組上述指標(biāo)均升高，DOX+inhibitor組上述指標(biāo)均降低；這提示DOX可引起小鼠心肌損傷，抑制miR-145-5p表達(dá)可以減輕DOX誘導(dǎo)的這種心肌損傷。因此，miR-145-5p可能是參與DOX誘導(dǎo)心肌損傷的關(guān)鍵因子。

DOX致心臟毒性的發(fā)病機(jī)制是近年來研究的熱點(diǎn)，許多研究表明DOX誘導(dǎo)的心肌損傷可能與氧化應(yīng)激、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)，其中氧化應(yīng)激在DOX誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［12］。DOX在代謝過程中產(chǎn)生的半醌型狀態(tài)能迅速將其不成對(duì)的電子轉(zhuǎn)移到氧分子上，產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、線粒體功能障礙和DNA損傷［13］。同時(shí)，DOX還可以與鐵結(jié)合破壞鐵的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的ROS。ROS與細(xì)胞線粒體膜上的磷脂相互作用也可導(dǎo)致線粒體功能障礙，繼而影響能量代謝［14］。更重要的是，DOX誘發(fā)的氧化應(yīng)激可通過內(nèi)、外源性凋亡途徑誘導(dǎo)大量心肌細(xì)胞凋亡，引起嚴(yán)重的心功能障礙［13］。因此，抑制氧化應(yīng)激可能是預(yù)防和治療DOX致心臟毒性的有效方法之一。

研究證明，多種分子機(jī)制和信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，miR-145在參與調(diào)控氧化應(yīng)激過程中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。HUI等［15］研究表明，miR-145可以調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。XIN等［5］研究顯示，miR-145-5p可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)。LI等［16］研究顯示，薯蕷皂苷可通過調(diào)節(jié)miR-145-5p介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而改善甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝、腎損傷。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果證實(shí)，miR-145-5p可以直接靶向調(diào)控sirt5基因，Westen blotting法結(jié)果顯示二者的表達(dá)是負(fù)調(diào)控關(guān)系，因此為進(jìn)一步探討miR-145-5p能否通過調(diào)節(jié)sirt5信號(hào)通路而促進(jìn)DOX誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷提供了依據(jù)。

sirt5廣泛分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，被認(rèn)為在維持細(xì)胞正常代謝中扮演重要角色。sirt5可通過其N端過氧化物酶體定位信號(hào)，進(jìn)入過氧化物酶體，減少細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生，從而在細(xì)胞氧化中起主要作用［6］。此外，研究證實(shí)sirt5可通過調(diào)控Nrf2表達(dá)來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激［17］。激活后的Nrf2能負(fù)向調(diào)控其與keap1的聚合或解離，轉(zhuǎn)位到核區(qū)并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，從而控制各種抗氧化基因和酶的表達(dá)，以對(duì)抗氧化應(yīng)激［18］。本研究結(jié)果顯示，與Control1組、DOX+sirt5組比較，DOX1組、DOX+共處理組小鼠心肌組織SOD、GSH表達(dá)均降低，MDA表達(dá)及DHE熒光強(qiáng)度升高，sirt5下游通路分子Nrf2、SOD1、HO-1和NQO-1表達(dá)均降低，keap1表達(dá)升高；提示sirt5高表達(dá)可減輕DOX誘導(dǎo)的小鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷，但是可以被miR-145-5p高表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)，以上結(jié)果進(jìn)一步提示miR-145-5p可靶向負(fù)調(diào)控sirt5表達(dá)，并進(jìn)一步抑制sirt5下游通路分子Nrf2、SOD1、HO-1和NQO-1的表達(dá)，以促進(jìn)DOX誘導(dǎo)的心肌氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，miR-145-5p參與了DOX誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷，其機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控sirt5表達(dá)，并進(jìn)一步抑制sirt5下游通路分子Nrf2、SOD1、HO-1和NQO-1表達(dá)，從而促進(jìn)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。因此，通過抑制miR-145-5p或促進(jìn)sirt5表達(dá)可能成為未來DOX治療患者發(fā)生心肌損傷時(shí)進(jìn)行干預(yù)的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。