陳麗霞，宋桂先，楊 梅，黃 英,3，衛(wèi) 鋼，陶 朱*

(1.貴州大學(xué) 貴州省大環(huán)化學(xué)及超分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 神奇民族醫(yī)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550005；3.貴州大學(xué) 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)組織(CSIRO)，新南威爾士州 2070)

縮節(jié)胺(mepiquat chloride, MC)，化學(xué)名N,N-二甲基哌啶嗡氯化物，是一種白色或淺黃色的粉狀物質(zhì)，水溶液中無(wú)熒光發(fā)射。因其對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)具有高效、低毒、廣譜的特性，在農(nóng)產(chǎn)品方面廣泛應(yīng)用[1]；然而縮節(jié)胺作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)人類和動(dòng)物的不良影響已得到廣泛報(bào)道和研究[2]，因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)MC的方法是必然的。近年來(lái)，對(duì)縮節(jié)胺殘留的檢測(cè)已有毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法[3]和液相色譜-質(zhì)譜法[4-6]等，但是這些方法都需要用到質(zhì)譜儀，所需儀器昂貴，分析成本高[7-8]。

超分子熒光探針是由具有空腔結(jié)構(gòu)的主體分子作為外來(lái)物質(zhì)的接受體，主體分子和熒光分子通過(guò)非共價(jià)作用形成的一類熒光傳感器[9-12]。超分子熒光探針可用于陽(yáng)離子、陰離子、生物分子(蛋白質(zhì)、DNA和氨基酸)以及藥物分子等物質(zhì)的檢測(cè)，其檢測(cè)機(jī)理主要是客體分子的競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同作用，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移、能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移等。這種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的識(shí)別方式近年來(lái)受到研究者廣泛的關(guān)注[13-20]。

瓜環(huán)又稱葫蘆脲(cucurbit[n]urils, 簡(jiǎn)稱Q[n]或CB[n])，是一個(gè)高度對(duì)稱的、剛性的、南瓜形狀的大環(huán)籠狀化合物，由亞甲基橋聯(lián)的“n”個(gè)苷脲單元組成，具有一個(gè)電中性疏水空腔、兩個(gè)負(fù)電性羰基修飾端口以及正電性外壁三大特征[21]。由于瓜環(huán)空腔內(nèi)外的極性等存在差別，熒光物質(zhì)在瓜環(huán)空腔內(nèi)或外面時(shí)，其理化性質(zhì)、光學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度的變化。因此，可通過(guò)瓜環(huán)與具有熒光的客體分子構(gòu)成超分子熒光探針，待檢測(cè)分子與超分子熒光探針作用后導(dǎo)致熒光探針發(fā)光性質(zhì)改變，再通過(guò)測(cè)熒光探針發(fā)光特性的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的測(cè)定[9-10]。對(duì)于空腔較大的Q[8]來(lái)說(shuō)，通常能與尺寸合適的客體分子形成穩(wěn)定的三元超分子配合物。

本文通過(guò)堿性黃T (thioflavin T, ThT)與Q[8]間的非共價(jià)鍵主客體相互作用，形成了一種水溶性Q[8]/ThT配合物，且該配合物在570 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的新型準(zhǔn)分子發(fā)射帶[22]，從而設(shè)計(jì)了一種用于無(wú)熒光性質(zhì)的MC的選擇性識(shí)別的超分子熒光探針體系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：Q[8]按文獻(xiàn)[23]由本實(shí)驗(yàn)室自制，ThT、MC均購(gòu)自Sigma-Aldrich試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。儀器：紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Agilent 8453，美國(guó)安捷倫)；熒光光譜儀(Cary Eclipse，美國(guó)瓦里安)；等溫滴定量熱儀(Nano ITC，美國(guó)TA儀器)；400 MHz核磁共振波譜儀(JNM-ECZ400S，日本電子株式會(huì)社)。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1光譜的測(cè)定

將Q[8]配制成0.1 mmol/L溶液，ThT配制成1.0 mmol/L溶液，MC配制成1.0 mmol/L的母液備用。實(shí)驗(yàn)所提的各個(gè)溶液的濃度均通過(guò)稀釋法獲得。

采用摩爾比法進(jìn)行光譜測(cè)定：向若干個(gè)10 mL的容量瓶中依次加入0.2 mL濃度為1.0 mmol/L的ThT溶液，再向其中分別加入0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0、5.0 mL濃度0.1 mmol/L的Q[8]溶液，用pH=7的Tris-HCl溶液定容。搖勻放置10 min，在250～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量各個(gè)溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。樣品池是光程1 cm的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿。在激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為309 nm條件下，測(cè)定體系的熒光發(fā)射光譜。

固定探針Q[8]/ThT的濃度為20.0 μmol/L，改變MC的加入體積，并用Tris-HCl溶液調(diào)節(jié)體系pH=7，定容，使體系中MC的濃度范圍為0～20.0 μmol/L。搖勻放置10 min，在激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為309 nm條件下，測(cè)定體系的熒光發(fā)射光譜。

1.2.2氫核磁共振譜的測(cè)定

在25 ℃條件下，以氘代水為溶劑，使用日本JEOL JNM-ECZ400S型400 MHz核磁共振波譜儀測(cè)定Q[8]與ThT及MC作用的1H NMR譜圖。

1.2.3等溫量熱滴定法的測(cè)定

ThT和MC分別配制成濃度為1.0 mmol/L母液備用，Q[8]配制成濃度為0.1 mmol/L母液。以水為參比溶液，采用Nano ITC等溫滴定量熱儀測(cè)定主體分子Q[8]分別與客體分子ThT、MC在25 ℃下的平衡常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)，樣品池體積為1.3 mL，攪拌速度為250 r/min，6 μL/滴，間隔時(shí)間為250 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 MC對(duì)Q[8]/ThT熒光探針的熒光猝滅

ThT是一種常見(jiàn)的熒光標(biāo)記染料，常用于淀粉樣原纖維的熒光標(biāo)記[24-25]。ThT溶液中加入Q[8]溶液后，溶液熒光逐漸增強(qiáng)，通過(guò)非共價(jià)鍵與Q[8]形成了2 ∶2的超分子配合物，與文獻(xiàn)[22]一致。

當(dāng)在Q[8]/ThT(2 ∶2)水溶液中逐漸滴加MC，隨著MC濃度的增加，體系在414 nm處的最大紫外-可見(jiàn)吸收光譜逐漸降低，且在440 nm處出現(xiàn)一個(gè)增強(qiáng)的峰，當(dāng)MC的濃度達(dá)到20.0 μmol/L時(shí)，紫外可見(jiàn)吸收光譜無(wú)明顯變化(圖1(a))。從圖1(b)可以看出：體系的熒光強(qiáng)度隨MC的濃度的增加逐漸降低，同時(shí)伴隨著最大熒光發(fā)射峰從570 nm逐漸移至490 nm，藍(lán)移了大約80 nm，且MC在該激發(fā)波長(zhǎng)下無(wú)熒光發(fā)射。因此，可利用Q[8]與ThT形成主客體超分子配合物Q[8]/ThT的熒光“開(kāi)-關(guān)”效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MC的檢測(cè)。

(a)紫外-可見(jiàn)吸收光譜 (b)熒光光譜 (λex=309 nm)圖1 在pH為7的Tris-HCl溶液中，熒光探針Q[8]/ThT(20.0 μmol/L)隨不同濃度MC(0～20.0 μmol/L)作用光譜Fig.1 Absorption and fluorescence spectra of Q[8]/ThT(20.0 μmol/L) in pH=7 Tris-HCl solution at different concentrations of MC (0～20.0 μmol/L)

2.2 pH值及共存離子對(duì)Q[8]/ThT探針的影響

為了考察pH值對(duì)探針Q[8]/ThT熒光強(qiáng)度的影響，測(cè)定了不同pH值下探針Q[8]/ThT的熒光強(qiáng)度。圖2是探針Q[8]/ThT在pH為2～11范圍內(nèi)的570 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化。從圖2可以看出：探針Q[8]/ThT在pH為5～9時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)且變化輻度不大，因此選擇pH=7的Tris-HCl溶液作為測(cè)試介質(zhì)。

圖2 在不同pH值的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT在570 nm處熒光強(qiáng)度變化(λex=309 nm)Fig.2 Variation of fluorescence intensity of Q[8]/ThT at 570 nm under different pH in Tris-HCl solution (λex=309 nm)

表1 離子干擾結(jié)果Tab.1 The result of ion interference study

2.3 探針Q[8]/ThT識(shí)別MC的檢出限

MC能使Q[8]/ThT探針的熒光強(qiáng)度減弱。在pH=7的Tris-HCl溶液中考察Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)熒光強(qiáng)度下降值隨MC濃度的變化。根據(jù)其工作曲線(圖3)可得，當(dāng)MC的濃度在2×10-8～30×10-8mol/L范圍時(shí)，MC的濃度與Q[8]/ThT熒光探針強(qiáng)度的降低值呈線性關(guān)系，線性方程式：△F=8.31C+44.41，R=0.989。依照IUPAC規(guī)定，根據(jù)CL=KS0/S計(jì)算求得探針檢測(cè)MC的檢出限為3.6×10-8mol/L。式中：K為與置信水平相關(guān)的常數(shù)，當(dāng)置信水平為90%時(shí)K取3；S0為測(cè)定10次空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為校正曲線的斜率。

圖3 在pH=7的Tris-HCl溶液中，Q[8]/ThT (20.0 μmol/L)熒光強(qiáng)度下降值隨MC濃度變化曲線Fig.3 Fluorescence intensity decreasing values of Q[8]/ThT (20.0 μmol/L) changing with the MC concentrations in Tris-HCl (pH 7)

2.4 Q[8]/ThT超分子熒光探針對(duì)MC識(shí)別機(jī)理

為了探討Q[8]/ThT超分子熒光探針對(duì)MC的識(shí)別原理，利用1H NMR和ITC考察了超分子熒光探針Q[8]/ThT與MC相互作用情況。Q[8]/ThT與MC相互作用的1H NMR譜圖如圖4所示。由圖4(a)和(b)可以看出：與游離的客體相比，作用的ThT的質(zhì)子H1向高場(chǎng)方向移動(dòng)了0.03，H2向低場(chǎng)方向移動(dòng)了0.80，H3—H8向高場(chǎng)方向分別移動(dòng)了0.82、0.60、0.70、0.97、0.58、0.83，表明ThT大部分受到了瓜環(huán)的屏蔽作用，即ThT大部分進(jìn)入Q[8]空腔[12]。同樣，由圖4(d)和(e)可以看出：作用MC與游離MC比較，Ha—Hd向高場(chǎng)分別移動(dòng)了0.20、0.21、0.21、0.20，說(shuō)明MC進(jìn)入到Q[8]的空腔，發(fā)生了主客體相互作用。隨著MC滴入Q[8]/ThT中(圖4(e))，ThT的所有質(zhì)子相對(duì)于Q[8]/ThT中的質(zhì)子幾乎沒(méi)有變化，而MC的所有質(zhì)子和游離MC相比均在低場(chǎng)，即非游離的MC，亦非單獨(dú)與Q[8]、與MC作用的MC的質(zhì)子，可能是MC與Q[8]/ThT熒光探針中的Q[8]的端口進(jìn)行主客體相互作用。因此，我們推測(cè)出Q[8] ∶ThT ∶MC為2 ∶2 ∶2的作用模式。熒光探針(Q[8]/ThT)對(duì)MC的“開(kāi)-關(guān)”識(shí)別示意如圖5所示。

(a) ThT；(b) Q[8]/ThT (2 ∶2)；(c) Q[8]/ThT/MC (2 ∶2 ∶2)；(d) Q[8]/MC (1 ∶2)；(e) MC。圖4 Q[8]與ThT及MC作用的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR spectra for the cucurbit[8]uril with ThT and MC

圖5 熒光探針(Q[8]/ThT)對(duì)MC的“開(kāi)-關(guān)”識(shí)別示意圖Fig.5 Schematic representation of the “on-off” recognition of MC for Q[8]/ThT fluorescent probe

進(jìn)一步使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)研究了Q[8]/ThT超分子熒光探針對(duì)MC的識(shí)別機(jī)制。在25 ℃下，Q[8]分別與ThT和MC相互作用，其熱力學(xué)擬合參數(shù)見(jiàn)表2，等溫滴定量熱圖如圖6所示。Q[8]與ThT的結(jié)合常數(shù)Ka1=(8.33±0.28)×107L/mol，Ka2=(9.12±0.12)×105L/mol，Q[8]與MC的結(jié)合常數(shù)Ka=(7.70±0.41)×106L/mol。結(jié)果表明，ThT和MC都能夠分別與Q[8]發(fā)生主客體作用，形成主客體復(fù)合物。然而，由于Q[8]與ThT的作用強(qiáng)于MC，因此，推測(cè)當(dāng)ThT與Q[8]形成Q[8]/ThT超分子熒光探針后，MC不能夠進(jìn)入Q[8]的空腔，只能與Q[8]的端口作用。該結(jié)果與1H NMR測(cè)試結(jié)果相符。

表2 Q[8]與ThT和MC相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.2 Thermodynamic parameters obtained by ITC for the Q[8] complexation of ThT and MC in aqueous media

(a)ThT (b)MC圖6 在25 ℃下，Q[8]分別與ThT和MC相互作用的等溫滴定量熱圖Fig.6 ITC profiles for the cucurbit[8]uril with ThT and MC at 25 ℃

3 結(jié)論

本文基于超分子識(shí)別作用原理構(gòu)筑了一種Q[8]/ThT超分子熒光探針，研究在Tris-HCl溶液(pH=7)中熒光探針Q[8]/ThT對(duì)MC的識(shí)別響應(yīng)。結(jié)果表明：熒光探針Q[8]/ThT對(duì)MC具有良好的識(shí)別能力，分析測(cè)試結(jié)果表明該方法具有檢出限低，快速的優(yōu)點(diǎn)。此外，利用氫核磁共振波譜及等溫滴定量熱法考察了Q[8]/ThT超分子熒光探針對(duì)MC識(shí)別機(jī)理，即ThT與Q[8]通過(guò)非共價(jià)主客體相互作用，形成了2 ∶2的主客體包結(jié)超分子熒光探針(Q[8]/ThT)，而MC的加入使其能夠進(jìn)一步與該超分子熒光探針中Q[8]的端口發(fā)生主客體相互作用，從而使Q[8]、ThT和MC形成了2 ∶2 ∶2作用模式的超分子三元檢測(cè)體系。