張 浩，鄔銳軍，劉利軍，郝瑞軍，魏玉環(huán)，王建華，馬駿驥

（內(nèi)蒙古正大食品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，規(guī)模化豬場(chǎng)快速興起，由此引發(fā)的豬病問題日益突出，嚴(yán)重制約了豬場(chǎng)的發(fā)展[1]。疫病不但能夠降低豬的生產(chǎn)性能，還能夠致使豬群大規(guī)模死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失[2]。良好的生物安全措施是控制疫病的關(guān)鍵，消毒是規(guī)?；i場(chǎng)生物安全的重要措施之一[3]。豬場(chǎng)常見的病毒主要分為RNA病毒和DNA病毒，目前，常用的消毒劑對(duì)這2種病毒的消殺降解作用是否全面有效，很少有系統(tǒng)的研究。

核酸檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室中最常見的問題就是核酸污染，這對(duì)核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性有重大影響。使用何種消毒劑以及如何制定合理的消毒程序，成為PCR實(shí)驗(yàn)室最需要重視的問題。RNA和DNA是大多數(shù)病毒的遺傳物質(zhì)，檢測(cè)RNA和DNA含量是評(píng)價(jià)病毒滴度最節(jié)約時(shí)間和成本的有效方法之一。消毒后常用熒光定量PCR方法對(duì)農(nóng)場(chǎng)及核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室消毒效果進(jìn)行評(píng)估。

本研究采用熒光定量PCR方法檢測(cè)84消毒劑（10%）、二氯異氰尿酸鈉（1∶200）、杜邦衛(wèi)可（1∶200）、NaOH（2%）、NaOH（1%）、NaOH（0.5%）、微酸電解水、威特利劍（1∶400）、潔凈（1∶200）、戊二醛及 75%酒精這11種常規(guī)消毒劑對(duì)RNA病毒 （勃林格藍(lán)耳疫苗）和DNA病毒（海博萊偽狂犬疫苗）的核酸降解效果，以期為規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的病毒防控實(shí)踐及PCR實(shí)驗(yàn)室消毒流程規(guī)范和污染防控提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 消毒劑。84消毒劑 （有效成分次氯酸鈉）（10%）、二氯異氰尿酸鈉（1∶200）、杜邦衛(wèi)可（過硫酸氫鉀復(fù)合物）（1∶200）、NaOH （2%）、NaOH （1%）、NaOH（0.5%）、微酸電解水、威特利劍（過硫酸氫鉀復(fù)合鹽）（1∶400）、潔凈（有效成分過氧乙酸）（1∶200）、戊二醛、75%酒精均注冊(cè)有獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)，試驗(yàn)時(shí)均在有效期內(nèi)。

1.1.2 試驗(yàn)疫苗選用。DNA病毒：海博萊偽狂犬疫苗（1頭份），RNA 病毒：勃林格藍(lán)耳疫苗（1頭份）。

1.1.3 主要試劑。DNA/RNA提取試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Axygen公司；Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser，購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；豬偽狂犬病毒（gB基因）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于北京世紀(jì)元亨公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于北京世紀(jì)元亨公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA病毒-勃林格藍(lán)耳疫苗消毒藥降解核酸效果試驗(yàn)。將11種常規(guī)消毒劑與RNA病毒勃林格藍(lán)耳疫苗按40 mL消毒藥+400 μL疫苗的比例混合，模擬日常消毒過程，設(shè)置蒸餾水與疫苗等比例混合為對(duì)照組。消毒藥劑與RNA病毒反應(yīng)時(shí)間分別為10 min、30 min、1 h、6 h、24 h 和 48 h，每個(gè)反應(yīng)時(shí)間段內(nèi)試驗(yàn)重復(fù)2組，加入IPC（內(nèi)部陽(yáng)性質(zhì)控品）全程控制試驗(yàn)過程，排除殘留消毒藥對(duì)核酸提取及PCR反應(yīng)造成的影響，篩選出消毒藥劑最適消毒效果反應(yīng)時(shí)間及消毒最佳藥劑配比。

1.2.2 DNA病毒-海博萊偽狂犬疫苗消毒藥降解核酸效果試驗(yàn)。將11種常規(guī)消毒劑與DNA病毒海博萊偽狂犬疫苗按40 mL消毒藥+400 μL疫苗的比例混合，模擬日常消毒過程。其余步驟同1.2.1。

1.2.3 病毒核酸提取。取200 μL上述產(chǎn)物，按病毒RNA/DNA提取試劑盒說明，提取各試驗(yàn)組病毒核酸。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)。使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)。操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行。豬藍(lán)耳病疫苗檢測(cè)采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒；偽狂犬病疫苗檢測(cè)采用豬偽狂犬病毒（gB基因）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

按照以上步驟，重復(fù)處理各組樣品2次并檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)平均Ct值。將各組檢測(cè)結(jié)果分別與對(duì)應(yīng)陽(yáng)性對(duì)照組比較，篩選出對(duì)核酸降解有效的消毒劑。

2 結(jié)果與分析

11種消毒劑對(duì)兩種病毒疫苗核酸降解效果的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如表1和表2所示。由表1和表2可知，84消毒劑、二氯異氰尿酸鈉、杜邦衛(wèi)可及微酸電解水均可100%降解RNA及DNA病毒核酸；不同濃度的NaOH可100%降解RNA病毒核酸，對(duì)DNA病毒核酸無效；維特利劍、戊二醛、潔凈及酒精對(duì)病毒核酸降解作用不明顯。

表1 RNA病毒-勃林格藍(lán)耳疫苗（1頭份）熒光定量PCR平均Ct值

表2 DNA海博萊偽狂犬疫苗（1頭份）熒光定量PCR平均Ct值

3 討論

豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病、豬流行性腹瀉病和豬圓環(huán)病毒2型等都是豬群中傳播較為廣泛的傳染性疾病，長(zhǎng)期以來給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。再加上規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)密度過大以及頻繁引種，更加重了疾病的傳播。消毒的主要目的是通過消滅傳染源和切斷傳播途徑，阻止疫病的發(fā)生及蔓延，進(jìn)而降低養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的損失[6]。消毒劑的正確使用是預(yù)防養(yǎng)豬場(chǎng)病原感染和疫病暴發(fā)的關(guān)鍵。本試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于以藍(lán)耳病毒和偽狂犬病毒疫苗為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停u(píng)價(jià)常用的11種消毒劑對(duì)2種病毒的核酸降解效果，為養(yǎng)豬場(chǎng)及其他家畜養(yǎng)殖場(chǎng)的消毒程序提供理論依據(jù)。在利用熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果作為檢驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)洗消效果的大背景下，有效地為農(nóng)場(chǎng)篩選出能夠降解核酸的消毒劑，為科學(xué)評(píng)價(jià)洗消效果和降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

近年來，隨著我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)的不斷興起，越來越多的集團(tuán)化企業(yè)開始自建實(shí)驗(yàn)室，用于農(nóng)場(chǎng)生物安全的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和疾病預(yù)警。隨著實(shí)驗(yàn)室的不斷增加，核酸污染防控問題也越來越受到管理人員的重視。尤其對(duì)于進(jìn)行PCR診斷的實(shí)驗(yàn)室來說，污染防控是直接影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素。因此，我們進(jìn)行了常見消毒劑的核酸降解評(píng)估。通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，氯制劑（84消毒劑、二氯異氰尿酸鈉、杜邦衛(wèi)可及微酸電解水）對(duì)核酸降解效果明顯，這可以幫助實(shí)驗(yàn)室管理人員進(jìn)行正確的消毒藥品篩選和使用，有效控制PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的核酸污染問題，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室消毒程序的制定提供科學(xué)依據(jù)。